双水相萃取法ppt课件.ppt

第七节双水相萃取早在1896年 发现 当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时 得到一个混浊不透明的溶液 随之分为两相 上相含有大部分水 下相含有大部分琼脂 或淀粉 两相的主要成分都是水 这种现象被称为聚合物的不相溶性 由此而产生了双水相萃取 双水相萃取技术始于20世纪50年代 1956年瑞典伦德大Albertsson将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离 1 双水相萃取技术 two aqueousphaseextraction 利用不同的高分子溶液相互混合可产生两相或多相系统 静置平衡后 分成互不相溶的两个水相 利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法 称为双水相萃取法 特点 能保留产物的活性 操作可连续化 可纯化蛋白质2 5倍 2 一 双水相的形成如葡聚糖与聚乙二醇按一定比例与水混合 静置平衡后 分成互不相溶的两个水相 上相富含PEG 下相富含葡聚糖 3 常用于物质分离的高聚物体系有 聚乙二醇 简称PEG 葡聚糖 简称Dextran 常见的高聚物 无机盐体系为 PEG 硫酸盐或磷酸盐体系 4 二 双水相萃取的基本概念 一 相图相图右上部为两相区 左下部为均相区 两相与均相的分界线叫双节线 组成位于A点的系统实际上由位于C B两点的两相所组成 BC称为系线 当系线向下移动时 长度逐渐减小 表明两相的差别减小 当达到K点时 两相间差别消失 K点称为临界点 5 二 分配系数影响分配系数的因素包括很多 如粒子大小 疏水性 表面电荷 粒子或大分子的构象等 这些因素微小的变化可导致分配系数较大的变化 因而双水相萃取有较好的选择性 6 三 影响双水相萃取的因素 一 成相高聚物的分子量一般原则 对于给定的相系统 如果一种高聚物被低分子量的同种高聚物所代替 被萃取的大分子物质 如蛋白质 核酸 细胞粒子等 将有利于在低分子量高聚物一侧分配 如以Dextran500 MW500000 代替Dextran40 MW40000 即增大下相高聚物的分子量 被萃取的低分子量物质如细胞色素C分配系数增加并不显著 然而 被萃取的大分子量物质 如过氧化氢酶的分配系数可增大到原来的6 7倍 7 二 成相聚合物浓度 界面张力一般来说 双水相萃取时 如果相系统组成位于临界点附近 则蛋白质等大分子的分配系数接近于1 高聚物浓度增加 系统组成偏离临界点 蛋白质的分配系数也偏离1 即K 1或K 1 三 电化学分配 盐类的影响盐对带电大分子的分配影响很大 各种盐的分配系数存在着微小的差异 产生了相间电位 由于蛋白质等大分子在水溶液中常带有电荷 相间电位造成的静电力能影响所有带电大分子和带电细胞粒子在两相中的分配 例如 DNA萃取时 离子组分微小的变化可使DNA从一相几乎完全转移到另一相 8 四 疏水效应选择适当的盐组成 相系统的电位差可以消失 排除了电化学效应后 决定分配系数的其它因素 如粒子的表面疏水性能即可占主要地位 成相高聚物的末端偶联上疏水性基团后 疏水效应会更加明显 此时 如果被分配的蛋白质具有疏水性的表面 则它的分配系数会发生改变 五 温度及其它因素温度的影响是间接的 它主要影响相的高聚物组成 只有当相系统组成位于临界附近时 温度对分配系数才具有较明显的作用 pH对酶的分配系数也有很大关系 特别是在系统中含有磷酸盐时 由于pH的变化会影响磷酸盐是一氢化物还是二氢化物磷酸盐的存在 而一氢化物磷酸盐对界面电位有明显的影响 9 四 双水相萃取的应用 应用特点 双水相系统平衡时间短 含水量高 界面张力低 为生物活性物质提供了温和的分离环境 它还具备操作简便 经济省时 易于放大 据报道 系统可从10ml直接放大到1m3规模 105倍 而各种试验参数均可按比例放大 产物收率并不降低 淀粉酶和蛋白酶用PEG NH4 2SO4双水相体系 经一次萃取从 淀粉酶发酵液中分离提取 淀粉酶和蛋白酶 萃取最适宜条件为PEG1000 15 NH4 2SO4 20 pH 8 10 红霉素的提取系统分别为AKM 马来酸酐和环氧乙烷共聚物 磷酸盐 PEG 磷酸盐和PEG 葡聚糖 考察了pH和添加中性盐的影响 当pH 6时 AKM 磷酸盐对红霉素的分配更为有效 当添加中性盐 NaCl Na2SO4 时 红霉素的分配系数迅速增大 万古霉素的双水相萃取是在PEG Dex和PEG 磷酸盐系统中进行的 添加少量的Na3PO4 Na2SO4或NaCl等中性盐是一种提高抗生素分配系数的有效方法 11 第八节反胶束萃取 反胶束 reversedmicelle 也称反胶团或反微团 是表面活性剂分散在连续的有机相中自发形成的纳米尺度的一种聚集体 12 一 基本原理表面活性剂溶于非极性溶剂中 并使其浓度超过临界胶束浓度 便会在有机溶剂内形成聚集体 非极性基团在外 极性基团则排列在内 形成一个极性核 此极性核具有溶解极性物质的能力 当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后 蛋白质及其他亲水性物质能够溶于极性核内部的水中 由于周围的水层和极性基团的保护 蛋白质不与有机溶剂接触 从而不会造成失活 13 二 反胶束体系在反胶束萃取的早期研究中多用季胺盐 目前用得最多的是AOT 其化学名为丁二酸乙基己基酯 磺酸钠 14 三 反胶束萃取过程萃取过程 目标蛋白质从主体溶液转移至反胶束溶液中的过程 反萃取过程 目标蛋白质从反胶束溶液中转移至第二水相 或以固体的形式游离出来 的过程 这些过程可连续操作 反胶束可在两套系统中循环 微水池溶解和分离作用 反胶团的微水池的水可溶解氨基酸 肽和蛋白质等生物分子 为生物分子提供易于生存的亲水微环境 因此 反胶团萃取可用于氨基酸 肽和蛋白质等生物分子的分离纯化 特别是蛋白质类生物大分子 15 蛋白质溶解模型 a 水壳模型 蛋白质位于水池的中心 周围存在的水层将其与反胶团壁隔开 b 半岛模型 表面存在强烈疏水区 该区直接与有机相接触 c 吸附于反胶团内壁 d 疏水区与几个反胶团的S疏水尾发生相互作用 被几个小反胶团所 溶解 16 17 18 四 影响因素1 表面活性剂的种类 早期用一种表面活性剂 现在混合体系的研究较多2 水相pH值 决定蛋白质表面带电基团的离子化状态 与表面活性剂的头部基团有相互作用3 温度 提高温度可使反胶束排斥水 起浓缩作用4 离子强度 降低带电蛋白与反胶束极性基团的相互作用 并导致高离子强度