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湖北省自然科学基金申 请 书项目名称：氟喹诺酮类药物的生物降解研究申 请 者：余 知 和承担单位：长江大学项目类别：重点项目 一般项目 申请日期：二00四年二月十二日湖北省自然科学基金管理办公室二000年制一、简表研究项目名称氟喹诺酮类药物的生物降解研究涉及学科（专业）A名称应用微生物学B名称 环境生物学C名称化学分析代码1806150代码6101020代码1502510主要应用行业（仅重点项目填写）1 23起止年月2005年1月至2006年12月申请金额5.0 万元 承担单位情况第一承担单位名称长 江 大 学通信地址湖北荆州市荆南路1号邮编434023单位性质A.高等院校 B.科研单位 C.其它 合作单位名称（仅重点项目填写）12承担项目组情况总人数高级中级初级博士后博士生硕士生211项目负责人姓名余知和出生年月1966.08专业技术职称教 授学术带头人是 否 学位博士硕士学士电-通信地址湖北荆州市荆秘路88号邮编434025其他主要成员情况姓名出生年月专业技术职务工作单位项目中的分工严赞开1963.01教 授长江大学化学与环境工程学院化学分析郑和斌1979.10硕士生长江大学生命科学院菌株分离、培养周建芬1969.09医 师长江大学医学院药物分析研究内容和意义摘 要随着氟喹诺酮类药物在人畜临床上的广泛应用，环境中抗生素类药物的残留和污染已造成公众卫生问题。本项目旨在利用真菌广谱的降解性能对氟喹诺酮药物进行生物转化研究，测定环境中这类药物的含量及存在形式，了解其降解过程，探讨其转化的机理。研究结果在环境监测与保护及生态学上具有十分重要的现实价值。主题词1. 主题词数量不多于三个；2. 主题词之间空一格。真菌生物转化降解产物测定简 表 填 写 要 求一、 简表内容将输入计算机，必须认真填写，采用国家公布的标准简化汉字。简表中学科（专业）代码按GB/T13745-92“学科分类与代码”表填写。二、 部分栏目填写要求： 项目名称应确切反映研究内容，最多不超过25个汉字（包括标点符号）。 学科名称申请项目所属的第二级或三级学科。 申请金额以万元为单位，用阿拉伯数字表示，注意小数点。 起止年月起始时间从申请的次年元月算起。 项目组其他主要成员指在项目组内对学术思想、技术路线的制定理论分析及对项目的完成起主要作用的人员。二、立论依据1 研究项目的科学依据（包括科学意义和应用前景，国内外研究慨况、水平和发展趋势，学术思想，立论依据，特色或创新之处，主要参考文献目录和出处，可另附页）喹诺酮类（quinolones）是人工合成的含4-喹诺酮基本结构的抗菌药物，对细菌DNA螺旋酶（DNA gyrase）具有选择性抑制作用。萘啶酸（nalidixic acid）是第一个用于临床的喹诺酮类药（萘啶酮），因抗菌谱窄，口服吸收差，副作用多，现已不用。20世纪70年代喹诺酮进入快速发展时期，化学修饰在其主环6或8位加入氟原子后又被称为氟喹诺酮类（fluoroquinolones），代表产品有诺氟沙星（norfloxacin）、氧氟沙星（ofloxacin）、环丙沙星（ciprofloxacin）等。氟喹诺酮类产品的问世，使学术界对喹诺酮产品有了全新的评价并得到广泛的临床应用（汪复，1999）。氟喹诺酮类药物具有抗菌谱广，尤其对革兰阴性杆菌包括绿脓杆菌在内有强大的杀菌作用，对金葡菌及产酶金葡菌也有良好抗菌作用，某些品种对结核杆菌、支原体、衣原体及厌氧菌也有作用；细菌对本类药与其他抗菌药物间无交叉耐药性；合成方法生产、疗效价格比高等优势，因而愈来愈受到各国的重视，成为竞相生产和应用的热点药品（Wolfson & Hoope, 1989）。目前，喹诺酮类药物是抗感染药物开发中最活跃的领域之一，已有几十个品种在临床上应用。国际上许多大型跨国公司，也正在大力发展喹诺酮的研究，如Pfizer。Squibb、Bayer、Glaxo等，日本更是将喹诺酮药物作为主要发展方向，投入大量人力物力，以保持其世界第一的地位。氟喹诺酮类药物在哺乳动物体内可经硫化、N-去烷基化和胺的氧化作用分解。然而，大部分仍然以原型通过粪便等排泄物传播到农田、牧场等环境中，并和土壤、粪便紧密地结合在一起（Nowara et al., 1997）。早期的观点认为，氟喹诺酮类药物与土壤、粪便的紧密结合有利于缓解细菌种群在自然界中的选择压力。现在认为，这种紧密结合可能延缓氟喹诺酮类药物的降解和矿化。此外，动物使用抗菌素会给人类健康带来风险。饲养的家禽由于使用氟喹诺酮类药物导致细菌的抗药性增加，而这种细菌正是引起人食用肉类后产生疾病的罪魁祸首。欧洲、美及香港等食品药物管理部门已相继在食品动物禁止使用氟喹诺酮类药物。木腐真菌因产生高活性自由基而分解树木细胞成分中的木质素（白腐真菌）或纤维素和半纤维素（褐腐真菌），在自然界物质循环和森林生态学中起着重要的作用。例如，著名的白腐真菌Phanerochaete chrysosporium分泌木素过氧化酶（ligin peroxidases）、锰过氧化酶（manganese-dependent peroxidases）和漆酶（laccases），除降解木质素外，还可降解诸多的污染物，如多芳香族化合物、DDT、TNT等外源化学物（xenobiotics），是一种具有广阔应用开发潜力的生物制浆菌（Bumpus et al., 1985）。目前，关于抗生素类药物在环境中的含量、存在形式以及生物降解过程和机理知道得很少（Wetzstein et al., 1997）。国外仅德国、美国、巴西、日本等有这方面的研究报告，国内在这方面尚未见报导。依诺沙星（enrofloxacin）是第一个临床应用于畜牧业的氟喹诺酮类药物，动物在服用期间，仅一小部分被体内分解，大部分则通过废物排泄出来。德国动物卫生研究所（Leverkusen）研究了4种白腐真菌Phanerochaete chrysosporium、Irpex lacteus、Phellinus gilvus、Stropharia rugosoannulata和一种褐腐真菌Gloeophyllum striatum对结合在麦杆或土壤中的依诺沙星的降解过程，结果表明，褐腐真菌G. striatum具有较高效率的降解能力，而且土壤中依诺沙星的降解在很大的程度被土壤有机成分的吸收所抑制（Martens et al., 1996）。进一步的研究发现，G. striatum可能存在四种主要的代谢途径降解依诺沙星，产生11种中间代谢产物（Wetzstein et al., 1997）。环丙沙星（ciprofloxacin）又名环丙氟哌酸，抗菌谱广，体外抗菌活性为目前在临床应用喹诺酮类中最强，对耐药绿脓杆菌、MRSA、产青霉素酶淋球菌、产酶流感杆菌等均有良效。Wetzstein et al.（1999）研究了分别来源于不同生境（腐木、土壤、腐殖质、动物粪便）的16种真菌对环丙沙星的生物降解，发现不同来源的高等真菌（包括农田土壤和动物粪便）对环丙沙星都有不同程度的降解能力。美国食品药物管理局毒素研究中心（Jefferson）Sutherland博士领导的研究小组进行了同样的研究，他们利用土壤真菌Mucor ramannianus和其他的真菌对氟喹诺酮类药物（依诺沙星、环丙沙星）和吩噻嗪类化合物（phonthiazine）进行了详细的微生物转化研究后认为，既然Mucor ramannianus这类真菌普遍存在于土壤和腐烂有机物中，那么真菌对环境中残留药物的降解或生物转化可能具有重要的生态学意义（Parshikov et al., 1999；Parshikov et al., 2000）。本项目旨在参考国外研究的基础上，利用我国丰富的真菌资源，选取或分离有代表性的真菌菌株在离体培养的条件对氟喹诺酮类药物进行生物降解研究，从而筛选出高效降解氟喹诺酮类药物的真菌菌株，进而研究其生物降解氟喹诺酮类药物的过程及途径，探讨降解氟喹诺酮类药物的机理，在实践中监测和分析农田、牧场土壤、养殖场、医院等环境中氟喹诺酮类药物的含量及动态变化。本项目的完成，将可筛选出高效降解氟喹诺酮类药物的真菌菌株，其结果在环境监测、保护以及生态学理论上具有十分重要的意义。主要参考文献汪复. 1999. 氟喹诺酮类药物临床应用进展. 中华内科杂志，38: 26-30.Bumpus, JA, M. Tien, D Wright & SD Aust. 1985. Oxidation of persistent environmental pollutants by a white-rot fungus. Science 228: 1434-1436.Martens R, HG Wetzstein, F Zadrazil, M Capelari, P Hoffmann & N Schmeer. 1996. Degradation of the fluoroquinolone enrofloxacin by wood-rotting fungi. Appl. Environ. Microbiol. 62: 4206-4209.Nowara, A, J Burhenne & M Spiteller. 1997. Binding of fluoroquinolone carboxylic acid derivatives to clay. J. Agric. Food Chem. 45: 1459-1463.Parshikov IA, JP Freeman, JO Lay, RD Beger, AJ Williams & JB Sutherland. 1999. Regioselective transformation of ciprofloxacin to N-acetylciprofloxacin by the fungus Mucor ramannianus. FEMS Microbiology Letters 177: 131-135.Parshikov IA, JP Freeman, JO Lay, RD Beger, AJ Williams & JB Sutherland. 2000. Microbiological transformation of enrofloxacin by the fungus Mucor ramannianus. Appl. Environ. Microbiol. 66: 2664-2667.Parshikov IA, JP Freeman, AJ Williams, JD Moody & JB Sutherland. 1999. Biotransformation of N-acetylphenothiazine by the fungi. Appl. Microbiol. Biotechnol. 52: 553-557.Thorn RG, CA Reddy, D Harris & EA Paul. 1996. Isolation of saprophytic basidiomycetes from soil. Appl. Environ. Microbiol. 62: 4288-4292.Wolfson, JS & DC Hooper. 1989. Fluoroquinolone antimicrobial agents. Clin. Microbiol. Rev. 2: 378-424.Wetzstein HG, N Schmeer & W Karl. 1997. Degradation of the fluoroquinolone enrofloxacin by the brown rot fungus Gloeophyllum striatum: identification of metabolites. Appl. Environ. Microbiol. 63: 4272-4281.Wetzstein HG, M Stadler, HV Tichy, A Dalhoff & W Karl. 1999. Degradation of ciprofloxacin by Basiodiomycetes and identification of metabolites generated by the brown rot fungus Gloeophyllum striatum. Appl. Environ. Microbiol. 65: 1556-1563.三、研究方案1 研究内容和预期成果（说明项目的具体研究内容和重点解决的科学问题，预期成果和提供的形式。如系理论成果，应写明在理论上解决哪些问题及其科学价值；如系应用性成果或基础性资料，应写明其应用的可能性及效益，可另附页）主要的研究内容：真菌因产生高活性的自由基而分解环境中的木质素（白腐真菌）或纤维素和半纤维素（褐腐真菌），降解诸多的污染物，如多芳香族化合物、DDT、TNT等外源化学物（xenobiotics），在自然界的物质循环和生态系统中起着重要的作用。故本研究内容侧重于真菌的生物转化。a. 供试真菌菌株的分离、收集及筛选；b. 真菌在不同培养条件下的降解能力（最适的培养方法、时间及培养基等）；c. 氟喹诺酮类药物生物降解中间产物的测定；d不同真菌菌株降解氟喹诺酮类药物可能的代谢途径及机理。预期成果：该项目结合微生物学和环境生物学的知识，利用化学分析的方法对环境中氟喹诺酮类药物的残留问题进行真菌生物转化研究，在理论上探讨真菌降解氟喹诺酮类药物可能的代谢途径及机理，进一步认识和理解真菌在自然环境和生态中的作用，其结果在环境监测、保护方面具有重要的现实价值。同时，通过项目的实施和完成，可筛选出2-5株高效降解氟喹诺酮类药物的真菌菌株，培养从事环境微生物学研究方面的人才（一名硕士研究生和多名本科生）。2 拟采取的研究方法和技术路线（包括研究工作的总体安排和进度，理论分析、计算、实验方法和步骤及其可行性论证，可能遇到的问题和解决办法，可另附页）研究的方法路线与实验方案A. 真菌菌株的分离和收集。土壤中存在许多的腐生真菌具有分解氟喹诺酮类药物的潜力，分离方法按Thorn et al. (1996)。同时从国内外有关的菌种保藏中心收集菌株。B. 菌株的培养。斜面培养基为麦芽汁抽提物（葡萄糖20.0 g，麦芽汁10.0 g，蛋白胨5.0 g，KH2PO4 5.0 g，琼脂 20.0 g，1000 ml 水）。液体培养基为合成培养基（蔗糖30.0 g，蛋白胨5.0 g，NaCl 3.0 g，KH2PO4 5.0 g，MgSO47H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO4 0.1 g，MnSO4 1 mg，1000 ml 水）。培养条件参考Wetzstein et al. (1997)并改进。C. 选取氟喹诺酮类药物诺氟沙星（norfloxacin）、氧氟沙星（ofloxacin）、环丙沙星（ciprofloxacin）原药作为供试的药物。D. 具体操作步骤和方法为： 根据供试的药物的浓度使液体培养基中的药物浓度为300 M； 接种摇床培养（28 ，200 rpm）两周，用滤纸过滤； 滤液用三倍体积醋酸乙酯抽提，真空干燥； 残留外物用2.0 ml甲醇溶解； 抽提物定性分析采用薄层扫描法，参照Parshikov et al.（1999）； 中间代谢物定量测定采用反相高效液相色谱法（HPLC）分离并经质谱分析，根据测定机关推测可能的代谢途径，参照Parshikov et al.（1999）和Wetzstein et al.（1997）；研究工作的总体安排及进度（1）2004. 012004. 12在农田、医院、牧场的不同地点采集土壤样品，重点在真菌资源丰富的云南采集有代表性的木腐真菌。从国内外的菌种包藏中心收集或交换菌株。从样品分离菌株。获得菌株的生物学特征研究。药物代谢成分分析的前期试验。（2）2005. 012005. 12在生物学特性研究的基础上，选取不同来源的菌株进行生物降解和转化试验，分析代谢产物的成分，评价不同菌株的转化效果，探讨可能的代谢途径。可行性论证a. 该研究方案设计合理，技术路线正确，研究方法可行，同时，项目组成员结构配置合理，有足够的人力和时间保证项目的顺利实施；b. 本项目的研究难点是氟喹诺酮类药物被降解后代谢物的成分分析。项目组已在HPLC和HPLC-MS方法以及其他化学方法分析条件诸方面进行了大量的预备试验，取得了较好的结果；c. 项目组所在单位具备从事项目研究的基本条件和设备。可能遇到的问题和解决办法本研究的难点是氟喹诺酮类药物生物降解中间产物的测定，可通过送样品给有关的专门实验室和专家鉴定。四、研究基础1. 实现本项目目标已具备的条件（包括过去的研究工作基础，现有的主要仪器设备、研究技术人员及工作条件，从其他渠道已得到，已申请或拟申请的经费情况及金额等，可另附页）已收集到本项目研究的相关文献15篇，资料准备齐备，并始终和国外的研究同行保持着密切联系。拥有薄层扫描仪（CS-9000型，日本岛津）和HPLC两套大型仪器（长江大学涝渍灾害与湿地农业省级重点实验室，长江大学农学院），长江大学分析测试中心具备HP5988A型质谱仪，尚缺色谱柱，拟购置。在资金方面拟从省教育厅或长江大学申请1.5万元经费。2. 申请者和项目组主要成员业务简历（按人填写主要学历和研究工作简历，近期发表的与本项目有关的主要论著目录和科研成果名称，并注明出处及获奖情况，可另附页） 项目负责人余知和教授在中国科学院微生物研究所获得微生物学专业博士学位。1999年4-5月在比利时Louvain天主教大学菌种保藏中心真菌实验室从事小型真菌分子系统学研究工作；2002年8月-2003年7月在台湾自然科学博物馆做博士后研究。主要研究领域及研究兴趣为真菌的分子系统学与进化、木腐真菌资源开发与利用及环境微生物学与微生物分子生态学。现为中国菌物学会终身会员、中国微生物学会会员、湖北省食用菌协会理事。主持完成一项国家自然科学基金项目“中国晶杯菌科真菌分类及其分子系统学研究”（批准号39900001，2000.01-2002.12），参加完成国家自然科学基金重点项目“中国热带真菌资源、分类及多样性综合研究（批准号39730020，1998.01-2001.12）”和中国-比利时国家科委合作项目“长白山地区小型真菌的分类及系统学研究”（1998.08-1999.08）。参加的湖北省科学技术厅重点项目“玉米纹枯病综合防治研究”获湖北省政府科技进步三等奖（1995）。参加国际香菇生产及产品研讨会（浙江，1994）、亚洲真菌学大会及亚太地区生物技术研讨会（香港，2000）和第六届中韩真菌学研讨会（武汉，2003）。发表学术论文（著）（包括合作）近20篇，其中4篇（第一作者两篇，第二作者两篇）发表在SCI收录的国际性学术刊物上。近年的主要论文如下：余知和、庄文颖. 2003. 粒毛盘菌属及其相关属的分子系统学研究. 菌物系统 22: 42-49. 余知和、庄文颖.2003. 中国热带粒毛盘菌属的物种多样性研究. 生物多样性 11: 141-146.Yu Zhi-he （余知和）& Zhuang Wen-ying. 2002. New Taxa and new records of Lachnum and Arachnopeziza (Helotiales, Hyaloscyphaceae) from tropical China. Nova Hedwigia 74: 415-428. Yu Zhi-he（余知和），Wen-ying Zhuang, Shuang-lin Chen & Cony Decock. 2000. Preliminary survey of Discomycetes from the Changbai Mountains, China. Mycotaxon 75: 395-408. 余知和. 1998. 蕈菌与生物工程技术. 食用菌学报 5(3): 52-58.项目组主要成员严赞开教授主要从事有机合成及天然产物的分离工作，现为长江大学化学与环境工程学院应用化学学科带头人。1984年毕业于湖北师范学院，获学士学位。1988年在武汉大学有机合成助教进修班学完硕士研究生的主要课程。1994年在华中师范大学有机合成所做国内访问学者。2002年在中国科学院动物研究所做国内高级访问学者，现为在读博士。1984年主持了湖北省科技厅资助的项目“-萘乙酸的合成”。1994年参与了导师刘钊杰教授主持的湖北省自然科学基金项目“具有生物活性有机磷化合物的研究”的部分研究工作，合成了两个系列三十余个具有活性的新型结构的有机磷化合物。1996年参与了湖北省教育厅资助的项目“复相催化合成巴豆醛”的研究工作；并主持了省级横向联合资助项目“橘皮综合开发与利用”，系统、有效地从桔皮中提取了桔皮色素、果胶及橙皮甙。2001年主持研究了原湖北农学院科学基金重点资助项目“菜用仙人掌活性成分的研究”；并参与研究了国家自然科学基金项目“杨树枝把引诱棉铃虫的机制”。2002年参与了导师张钟宁研究员主持的国家重大发展规划项目的部分研究工作，合成了美国白蛾性信息素的两个主要组分。目前已公开发表学术论文40余篇。在本研究项目中任第一主持人，全面负责项目的组织、计划和实施。主要论文如下：严赞开，何 佶，刘钊杰, 陈卫兵. 2003. 烯丙基硫代磷酸酯的合成. 应用化学 6: 603607.严赞开，何佶, 张钟宁. 2003. 美国白蛾性信息素中两个主要成分的质谱研究. 质谱学报 1: 298302.严赞开，张钟宁. 2003. 人工合成美国白蛾性信息素的研究进展. 合成化学 1: 1419.严赞开，何佶，张钟宁. 2002. 美国白蛾性信息素的两个组分的合成. 农药学学报 2: 5658.严赞开，张钟宁. 2002. (9Z, 12Z, 15Z)-十八碳三烯醛的GC-MS分析. 分析测试学报 21(5): 5760.Chun Xiao, Yan Zenkai, Du Jiawei et al. 2001. Isolation of action components of volatiles of Chinese wing-nut tree, Pterocarya stenoptera attractive to cotton bollorw, Helixoverpa armigera. Entomol. Sinica 3: 257264.五、经费预算支出科目金额（万元）计算根据及理由1合计5.02科研业务费2.8样品采集差旅费0.5云南采集两人次菌株收集及购置0.2国内外菌种中心购置菌株每支1