临床免疫学PPT课件.pptx

临床免疫学 1 一 概论1 免疫学简介 1 免疫学概念与免疫应答 2 免疫组织与器官 3 免疫细胞 4 免疫分子2 临床免疫学 1 免疫病理与免疫性疾病 2 移植免疫 3 肿瘤免疫 4 感染免疫 2 免疫是机体识别和排斥抗原性异物的一种生理功能 免疫应答是指机体免疫系统接受抗原刺激发生一系列反应 并以排出或分解该抗原为目的的反应过程 免疫应答的过程包括 抗原的识别 处理 信息传递 免疫细胞的激活 增殖 分化以及产生一系列的免疫效应分子 以免疫效应分子的协同作用执行效应功能 从而达到维持机体内环境稳定的目的 3 免疫应答是一个复杂的连续过程 分为识别阶段 活化阶段和效应阶段 1 识别阶段是巨噬细胞等抗原递呈细胞对外来抗原或自身变性抗原进行识别 摄取 降解和递呈抗原信息给T辅助细胞 THc 及相关淋巴细胞的阶段 2 活化阶段是T B淋巴细胞在接受抗原信号后 在一系列免疫分子的参与下 发生活化 增殖 分化的阶段 由于T细胞和B细胞表面表达的细胞膜受体不同 所以对抗原的识别具有严格的特异性 B细胞接受抗原刺激后活化 增殖 分化为浆细胞 T细胞在接受抗原刺激和协同刺激双信号后活化 增殖 分化为效应细胞 3 效应阶段是浆细胞分泌特异性抗体 执行体液免疫功能 T细胞中的Th细胞分泌细胞因子等效应分子 T杀伤细胞执行细胞毒效应功能 另有少量T细胞和B细胞在增殖分化后 不直接执行效应功能 而作为记忆细胞 当其再次遇到相同抗原时 迅速活化 增殖 分化为效应细胞 执行高效而持久的特异性免疫效应功能 4 免疫器官和组织主要包括 1 中枢免疫器官中枢免疫器官在人类包括骨髓和胸腺 是造血干细胞分别分化为B细胞和T细胞的场所 2 周围免疫器官包括脾 淋巴结 淋巴小结及全身弥散的淋巴组织 它们是成熟的T细胞和B细胞定居以及对抗原应答的场所 5 免疫细胞 immunecell 是白细胞的俗称 包括淋巴细胞和各种吞噬细胞等 也特指能识别抗原 产生特异性免疫应答的淋巴细胞等 淋巴细胞是免疫系统的基本成分 在体内分布很广泛 主要是T淋巴细胞 B淋巴细胞受抗原刺激而被活化 activation 分裂增殖 发生特异性免疫应答 除T淋巴细胞和B淋巴细胞外 还有K淋巴细胞和NK淋巴细胞 共四种类型 T淋巴细胞是一个多功能的细胞群 除淋巴细胞外 参与免疫应答的细胞还有浆细胞 粒细胞 肥大细胞 抗原呈递细胞及单核吞噬细胞系统的细胞 6 免疫分子 7 1 免疫球蛋白B细胞转化为浆细胞 分泌能与相应抗原特异性结合的蛋白 即免疫球蛋白 又称抗体 Ab Ig是由相同二条重链和二条轻链组成 Ig以重链命名 分为IgG IgA IgM IgD和IgE五类 2 补体用C 表示 是血清中存在的一组具有酶活性的 不稳定的能帮助抗体溶解靶细胞的一组蛋白 称补体系统 至少有30多个成分 补体激活途径至少有三条 经典途径 替代途径和凝集素途径 溶解细胞与杀菌作用 促炎作用 中和及溶解病毒作用 8 3 细胞因子是指由活化的免疫细胞和某些基质细胞分泌的 介导和调节免疫应答及免疫反应的小分子蛋白类因子 细胞因子包括淋巴因子和单核因子 产生细胞因子的细胞种类极多 主要有3类 激活的免疫细胞 基质细胞 某些肿瘤细胞 功能 介导天然免疫应答和效应功能 免疫调节功能 调节炎症反应 刺激造血细胞增殖和分化成熟的功能 抗肿瘤生长的功能 4 HLA分子HLA是人类白细胞抗原 即人的主要组织相容性抗原 编码HLA分子的基因 称主要组织相容性复合体 MHC 又叫组织相容性位点A HLA 9 移植免疫 10 基本概念 移植是指应用异体 或自体 正常细胞 组织 器官置换病变的或功能缺损的细胞 组织 器官 以维持和重建机体生理功能 1 自体移植 同种异基因移植 异种移植1 自体移植 指移植物取自受者自身 不发生排斥反应2 同种异体 基因 移植 指同种内遗传基因不同的个体间移植 临床移植多属此类型 一般均发生排斥反应 3 异种移植 指不同种属个体间的移植 由于异种动物间遗传背景差异甚大 移植后可能发生严重的排斥反应 11 2 直接识别 间接识别1 直接识别 指受者的同种反应性T细胞直接识别供者APC表面抗原肽 供者MHC分子复合物 pMHC 并产生免疫应答 2 间接识别 指供者移植物的脱落细胞或MHC抗原经受者APC摄取 加工 处理 形成受者MHC 供者MHC来源的抗原肽复合物 递呈给受者T细胞使其活化 间接识别在急性排斥反应中晚期和慢性排斥反应中起重要作用 12 肿瘤的免疫学诊断 一 检测肿瘤抗原这是目前最常用的肿瘤免疫学诊断法 如AFP的检测对原发性肝细胞性肝癌有诊断价值 CFA的检测有助于诊断直肠癌 胰腺癌等 但对于人类肿瘤特异性抗原的检测进展不大 二 检测肿瘤抗体例如在黑色素瘤患者血清中可查到抗自身黑色素瘤抗体 在鼻咽癌和Burkitt淋巴瘤患者的血清中检测出EB病毒的抗体 且抗体水平的变化与病情的发展和恢复有关 三 肿瘤的放射免疫显像诊断将放射性核素如131I与抗肿瘤单抗结合后 医学教 育网 收集整理从静脉注入体内或腔内注射均可将放射性核素导向肿瘤的所在部位 用 照相机可以显示清晰的肿瘤影像 已用于临床诊断 是一种有较好前景的肿瘤诊断新技术 13 感染与免疫简介 一 感染的概念传染又称感染 是寄生物对人体的一种寄生过程 有些寄生物与人体宿主达到了互相适应 互不损坏对方的共生状态 二 感染过程的表现1 病原体被清除2 隐性感染3 显性感染4 病原携带状态5 潜伏性感染一般来说隐性感染最多见 病原携带状态次之 显性感染最少 但一旦出现则易识别 14 三 感染过程中病原体的作用病原体侵入人体或能否发病 取决于病原体的致病能力和机体的免疫功能这两个因素 病原体的致病能力与下列因素有关 1 侵袭力指病原体侵入人体并在机体内生长 繁殖 蔓延扩散的能力 2 毒力包括毒素和其他毒力因子 3 数量入侵病原体的数量一般与致病能力成正比 4 变异性病原体可因环境或遗传等因素而产生变异 四 感染过程中的免疫应答作用机体的免疫应答对感染过程的表现和转归具有重要作用 15 抗原抗体反应的特点 1 特异性 2 可逆性 3 比例性 4 阶段性 16 1 特异性 抗原抗体结合的特异性是指抗原表位与抗体超变区结合的特异性 是由两者在化学结构和空间构型上呈互补关系所决定的 抗原与抗体的结合高度的特异性 是应用于临床诊断的基础 但多数天然抗原具有不只一种抗原决定簇 与另一物质可能有共同抗原 对检验结果产生交叉反应 但这交叉反应仍是抗原抗体特异性结合 对临床诊断可能产生干扰 不过有时也将这种交叉反应用于临床诊断 17 2 比例性 在抗原抗体特异性反应时 生成结合物的量与反应物的浓度有关 只有当抗原抗体分子比例合适时抗原抗体充分结合 沉淀物形成快而多 称为抗原抗体反应的等价带 若抗原或抗体极度过剩则无沉淀形成 称为带现象 抗体过量时 称为前带 抗原过剩时 称为后带 18 3 可逆性 可逆性指抗原抗体结合后形成的 理复合物在一定条件下可发生解离 恢复抗原抗体的游离状态 抗原抗体结合是分子表面的结合 犹如酶与底物的结合 是一种非共价键结合 结合虽稳定但可逆 抗原抗体的结合是一种动态平衡过程 抗原抗体复合物的解离取决于抗体对相应抗原的亲和力及反应条件 如离子强度 pH等 免疫学技术中的亲和层析法就是利用这个原理来纯化抗原或抗体 19 抗原抗体反应的主要影响因素 20 一 抗原和抗体浓度 比例抗原和抗体浓度 比例对抗原抗体反应影响最大 是决定性因素 如前所述 二 电解质抗原与抗体特异性结合后 其亲水性减弱 分子表面所带的电荷易受电解质影响而失去 复合物间的排斥力下降 导致第一阶段已形成的可溶性结合物能进一步联结 出现明显的凝集或沉淀现象 试验中常用0 85 的NaCl溶液作为稀释液 以提供适当浓度的电解质 21 三 温度适当的温度可增加抗原与抗体分子碰撞的机会 加速结合物体积的增大 一般而言温度越高 形成可见反应的速度越快 但过高则会使抗原或抗体变性失活 影响试验结果 一般在37 下进行试验 但也有些抗原抗体在4 下进行反应较好 四 酸碱度pH过高或过低都将直接影响抗原或抗体的理化性质 例如 当pH降至3 0左右时 因接近细菌抗原的等电点 细菌表面蛋白或其他基团所带的电荷消失 其相互间的排斥力丧失而导致非特异性酸凝集 影响试验的可靠性 22 常规免疫检测技术 23 一 皮内试验 宿主在病原体刺激后 体内产生亲细胞性抗体 IgE和IgG4 当其与相应抗原结合后 肥大细胞和嗜碱性粒细胞脱颗粒 释放生物活性物质 引起注射抗原的局部皮肤出现皮丘及红晕 以此便可判断体内是否某有种特异性抗体存在 24 二 免疫扩散和免疫电泳1 免疫扩散于一定条件下 抗原与抗体在琼脂凝胶中相遇 在二者含量比例合适时形成肉眼可见的白色沉淀 2 免疫电泳是将免疫扩散与蛋白质凝胶电泳相结合的一项技术 事先将抗原在凝胶板中电泳 之后在凝胶槽中加入相应抗体 抗原和抗体双相扩散后 在比例合适的位置 产生肉眼可见的弧形沉淀线 25 三 间接红细胞凝集试验IHA以红细胞作为可溶性抗原的载体并使之致敏 致敏的红细胞与特异性抗体结合而产生凝集 抗原与抗体间的特异性反应即由此而显现 常用的红细胞为绵羊或O型人红细胞 26 四 间接荧光抗体试验IFAvvv本法用荧光素 异硫氰基荧光素 标记第二抗体 可以进行多种特异性抗原抗体反应 即可检测抗原又可检测抗体 本法具有较高的敏感性 特异性和重现性等优点 除可用于寄生虫病的快速诊断 流行病学调查和疫情监测外 还可用于组织切片中抗原定位以及在细胞和亚细胞水平观察和鉴定抗原 抗体和免疫复合物 27 五 对流免疫电流试验 counter immunoelectrophoresis CIE 对流免疫电泳试验是以琼脂或琼脂糖凝胶为基质的一种快速 敏感的电泳技术 既可用已知抗原检测抗体 又可用已知抗体检测抗原 六 酶联免疫吸附试验 ELISA vvv酶联免疫吸附试验原理是将抗原或抗体与底物 酶 结合 使其保持免疫反应和酶的活性 把标记的抗原或抗体与包被于固相载体上的配体结合 再使之与相应的无色底物作用而显示颜色 根据显色深浅程度目测或用酶标仪测定OD值判定结果 28 颗粒性抗原的制备颗粒性抗原主要是指细胞抗原或细菌抗原 最常用的细胞抗原为制备溶血素用的绵羊红细胞 这种抗原制备比较简单 采集新鲜绵羊红细胞 以无菌盐水洗涤3次 每次离心2000r min10min 最后配成106 ml浓度的细胞悬液 即可应用 29 半抗原 某物质在独立存在时只具有反应原性而无免疫原性 这些物质称为半抗原 如一些分子量小于4000的有机物质 如多肽 大多数的多糖 甾族激素 脂肪胺 类脂质 核苷 某些小分子量的药物等 半抗原与蛋白质载体或高分子聚合物结合后才有免疫原性 30 杂交瘤技术的原理 31 杂交瘤技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征 这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞 被特异性抗原免疫的小鼠脾细胞 B淋巴细胞 的主要特征是它的抗体分泌功能 但不能在体外连续培养 小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂 增殖 即具有所谓永生性 在选择培养基的作用下 只有B细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交细胞才能具有持续培养的能力 形成同时具备抗体分泌功能和保持细胞永生性两种特征的细胞克隆 32 一 B细胞杂交瘤技术二 T细胞杂交瘤三 阳性杂交瘤细胞的克隆化培养杂交瘤细胞形成后的初期很不稳定 为确保单克隆抗体的专一性及避免其他阴性细胞对其生长影响 必须将阳性杂交瘤细胞进行单细胞分离培养 产生单克隆杂交瘤细胞 经2 3次检测均为阳性的杂交瘤单个细胞 才能进行克隆化培养 克隆化培养后的阳性杂交瘤细胞应及时冻存 最好保存在 196 液氮中 33 凝集反应的原理及特点 34 定义 细菌和红细胞等颗粒性抗原或表面包被抗原的颗粒性载体与相应抗体结合后 可出现肉眼可见的凝集现象 概念 颗粒性抗原 相应抗体 适量电解质 凝集现象 可溶性抗原 或抗体 载体颗粒 致敏颗粒 相应抗体 或抗原 适量电解质 凝集现象 特点 1 抗原为颗粒性抗原或可溶性抗原致敏颗粒 2 反应时间较短 需几到十几分钟 3 反应产物为凝集块 4 凝集反应抗原分子大 反应面积小 为使抗体分子不致过多 试验时需稀释抗体 35 直接凝集反应 1 玻片凝集试验 2 试管凝集试验 36 玻片凝集试验为定性试验方法 一般用已知抗体作为诊断血清 与受检颗粒抗原如菌液或红细胞悬液各加一滴在玻片上 混匀 数分钟后即可用肉眼观察凝集结果 出现颗粒凝集的为阳性反应 此法简便 快速 适用于从病人标本中分离得到的菌种的诊断或分型 玻片法还用于红细胞ABO血型的鉴定 37 试管凝集试验为半定量试验方法 在微生物学检验中常用已知细菌作为抗原液与一系列稀释的受检血清混合 保温后观察每管内抗原凝集程度 通常以产生明显凝集现象的最高稀释度作为血清中抗体的效价 亦称为滴度 在试验中 由于电解质浓度和pH不适当等原因 可引起抗原的非特异性凝集 出现假阳性反应 因此必须设不加抗体的稀释液作对照组 临床上常用的直接试管凝集试验为肥达试验 Widaltest 和外斐试验 Weil Felixtest 在输血时也常用于受体和供体两者的红细胞和血清的交互配血试验 38 间接凝集反应 1 间接凝集反应的类型 2 间接血凝试验 3 胶乳凝集试验 4 明胶凝集试验 5 间接凝集反应的应用 39 根据致敏载体用的是抗原或抗体以及凝集反应的方式 间接凝集反应分为4类 正向间接凝集反应 反向间接凝集反应 间接凝集抑制反应 协同凝集反应 可用作载体的颗粒很多 常用的为红细胞 胶乳颗粒及明胶颗粒等 间接凝集反应具有快速 敏感 操作简便 无需特殊的实验设备等特点 而且能用于抗原或抗体的测定 因此在临床检验中广为应用 40 间接血凝试验 41 其原理是将抗原 或 抗体包被于红细胞表面 成为致敏载体 然后与相应的抗体 或抗原 结合 从而使红细胞被动地凝聚在一起 出现可见的凝集现象 42 间接血凝试验可分为三类 红细胞包被抗原 用以检测抗体的血凝 称为正向间接血凝反应 PHA 红细胞包被抗体 用以检测抗原的血凝反应 称为反向间接血凝反应 RPHA 先将可溶性抗原 或抗体 与相应的抗体 或抗原 混合然后再加入抗原 或抗体 致敏的红细胞 则能抑制原先的血凝现象 称为正向 或反向 间接血凝抑制试验 间接血凝抑制试验医学教育网整理可用于检测抗体 自身抗体 变态反应性抗体 也可测定抗原 43 间接血凝试验 红细胞沉积于管底 1 红细胞沉积于管底 周围有散在少量凝集 2 红细胞形成片层凝集 面积较小 边缘较松散 3 红细胞形成片层凝集 面积多于2 4 红细胞形成片层凝集 均匀布满孔底 或边缘皱缩如花边状 44 絮状沉淀试验 45 抗原抗体溶液在电解质的存在下结合 形成絮状沉淀物 这种絮状沉淀受抗原和抗体比例的直接影响 因此产生最适比例的测定方法 常见有 1 抗原稀释法 抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应 2 抗体稀释法 抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应 3 方阵滴定法 为了保证抗原抗体在最适比例条件下进行反应 达到最大沉淀反应的效果 就必须对抗原和抗体最佳工作浓度做出选择 将上述我们讲过的抗原稀释法和抗体稀释法结合起来就是方阵滴定法 又称为棋盘格法 46 一 免疫浊度法原理当可溶性抗原与相应抗体在两者比例合适时 抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物 使反应液出现浊度 如形成的复合物增加 反应液的浊度随之增加 与一系列的标准品对照 即可计算出受检物的含量 47 1 免疫透射比浊法 根据郎伯 比尔 Lambert Beer 定律 当光线通过抗原抗体反应系统时 由于溶液中存在抗原抗体复合物 光线被吸收 吸收的量和复合物的量成正比 利用透射比浊仪测量出由于反射 吸收或散射引起的入射光衰减 48 2 免疫速率散射比浊法 其原理是指一定波长的光通过溶液遇到抗原抗体复合物时 光线被折射 发生偏转 偏转角度可以从0 90 这种偏转的角度可因光线的波长和复合物大小不同而有所区别 散射光的强度与复合物的含量成正比 即待测抗原越多 形成的复合物也越多 散射光也越强 同时也和散射夹角成正比 和波长呈反比 测定方法有终点法和速率法两种 49 与免疫浊度法测定密切相关的因素有 1 抗原与抗体的比例 理想状态是抗原与抗体比例合适全部结合 事实上有困难 根据Heidelberger曲线理论 反应液中保持抗体过量时 复合物随抗原量的增加递增至抗原与抗体两者比例最合适时达高峰 因此免疫浊度法中保持抗体过量 2 抗体的质量 应是特异性强 效价高 亲和力强 并使用R型抗血清 3 抗原抗体反应的溶液 关键是pH及离子种类 通常用磷酸盐缓冲液作反应液 4 增浊剂的应用 通常用非离子型亲水剂 如聚乙二醇 PEG 吐温 20等 50 单向扩散试验 琼脂内混入抗体 待测抗原从局部向琼脂内自由扩散 如抗原和相应抗体结合 则形成沉淀环 1 试管法 将一定量的抗体混入0 7 琼脂糖溶液中 注入小试管内 上层加抗原溶液使待测抗原在凝胶中自由扩散 在抗原抗体比例恰当位置形成沉淀环 2 平板法 是将抗体或抗血清混入0 9 琼脂糖内 未凝固前倾注成平板 然后在上打孔 将抗原加入孔中 放37 让其自由扩散 24 48h后可见孔周围出现沉淀环 测定环的直径或面积计算标本中待测抗原的浓度 有两种计算方法 l Mancini曲线 适用大分子抗原的和长时间扩散 48h 的结果 沉淀环直径的平方与抗原浓度呈线性关系c d2 k 其中c为抗原浓度d为沉淀环直径k为常数 51 单向扩散试验检测时的注意点 1 抗血清必须特异性强 效价高 亲和力强 在良好条件下保存 2 每次测定都必须作标准曲线 3 每次测定时必须用质控血清作质控 4 注意双环现象 出现了两种抗原性相同成分 5 应用单克隆抗体测量多态性抗原时 测定值偏低 用多克隆抗体测量单克隆病时 测定值偏高 52 双向扩散试验 在琼脂内抗原和抗体各自向对方扩散 在最恰当的比例处形成抗原抗体沉淀线 根据沉淀线的位置 形状以及对比关系 可对抗原或抗体作出定性分析 双向扩散试验也分为试管法和平板法 1 试管法 在含有抗原的溶液和含有抗体琼脂中间 加一层普通琼脂 让下层抗体和上层抗原向中间自由扩散 在抗原 抗体浓度最适时形成沉淀线 53 2 平板法 是在琼脂板上相距3 5mm打一对孔 或者梅花孔 双排孔 三角孔等 在相应孔中加入抗原或抗体 待其自由扩散后 抗原 抗体形成可见的沉淀线 54 根据沉淀线的位置可作如下分析 抗原 抗体是否存在及其相对含量 一般沉淀线靠近抗原孔 提示抗体量大 沉淀线靠近抗体孔 提示抗原量大 抗原 抗体相对分子量的分析 抗原或抗体在琼脂内自由扩散 其速度受分子量影响 分子量小者 扩散快 反之较慢 由于慢者扩散圈小 局部浓度较大 形成沉淀线弯向分子量大的一方 如若两者分子量相等 则形成直线 抗原性质的分析 受检的抗原性质可能完全相同 部分相同 完全不同 沉淀弧可分别出现完全融合 部分融合 不融合三种情况 抗体效价的滴定 抗体效价是抗原 抗体经过自由扩散形成沉淀线 出现沉淀线的最高抗体稀释度为该抗体的效价 55 免疫电泳技术是区带电泳和免疫双扩散相结合的一种免疫化学技术 检测原理是在普通琼脂中央纵向挖一2 0mm宽的小槽 两侧各打一孔 将待测标本与标准抗原分别加入两侧孔内进行琼脂区带电泳 各蛋白质抗原成分因分子量及电泳迁移率不同 分离成若干肉眼不可见的区带 然后将抗体放入槽内进行自由扩散 根据抗原电泳位置 含量及与抗体比例不同 而出现不同位置 不同形状和不同大小的沉淀线 待测样品与已知抗原相比较 可对待测样品的成分及性质进行分析 此技术为定性试验 目前主要用在纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别与鉴定 56 免疫固定电泳技术这是区带电泳与免疫沉淀反应相结合的技术 检测原理是将血清蛋白质在琼脂糖凝胶介质上电泳后 再将抗血清直接加入电泳后蛋白质区带表面 或将浸有抗血清的滤纸贴于其上 参考泳道则加蛋白固定剂 作区带参考 孵育后 抗原与对应抗体直接发生沉淀反应 形成的复合物嵌于固相支持物中 经固定后的电泳凝胶在洗脱液中漂洗 将未结合的游离抗原或抗体洗去 则出现被结合固定的某种蛋白 氨基黑染色后观察结果 57 荧光抗体技术 58 荧光抗体技术 1 荧光抗体的制备和鉴定 抗体荧光素标记 用于标记抗体 要求是高特异性和高亲和力的 作为标记的荧光素应符合以下要求 1 应具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团 与蛋白质结合后不易解离 而未结合的色素及其降解产物易于清除 2 荧光效率高 与蛋白质结合后 仍能保持较高的荧光效率 3 荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明 4 与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质 5 标记方法简单 安全无毒 6 与蛋白质的结合稳定 易于保存 常用的标记蛋白质的方法有搅拌法和透析法两种 59 荧光抗体的鉴定 包括效价及荧光素与蛋白质的结合比率 抗体效价可以用琼脂双扩散法进行滴定 效价大于1 16者较为理想 荧光素与蛋白质结合比率 F P 来计算 F P值越高 说明抗体分子上结合的荧光素越多 反之则越少 一般用于固定标本的荧光抗体以F P 1 5为宜 用于活细胞染色的以F P 2 4为宜 60 2 免疫荧光显微技术 是使荧光抗体与标本切片中组织或细胞表面的抗原进行反应 洗涤除去游离的荧光抗体后 于荧光显微镜下观察 在黑暗背景上可见明亮的特异荧光 标本的制作 主要靠观察切片标本上荧光抗体的染色结果作为抗原的鉴定和定位 荧光抗体染色 滴加经适当稀释的荧光抗体进行染色 荧光显微镜检查 最好在染色当天即作镜检 以防荧光消退 影响结果 实验的类型 包括直接法 间接法 补体结合法和双标记法 61 酶免疫技术 62 酶免疫技术是利用酶催化底物反应的生物放大作用 提高特异性抗原 抗体免疫学反应检测敏感性的一种标记免疫技术 63 1 酶和酶作用的底物 辣根过氧化酶 HRP 是一种糖蛋白 含糖量约18 分子量为44kD 是一种复合酶 由主酶 酶蛋白 和辅基 亚铁血红素 结合而成的一种卟啉蛋白质 主酶为无色糖蛋白 在275nm波长处有最高吸收峰 辅基是深棕色的含铁卟啉环 在403nm波长处有最高吸收峰 在反应中H2O2是受氢体底物 DH2无色的供氢体底物 在HRP的催化下脱氢而显色 此即HRP作为示踪物的原理 碱性磷酸酶 AP 是从牛肠粘膜或大肠杆菌中提取 从大肠杆菌提取的最适pH为8 0 用小牛肠粘膜提取的AP最适pH为9 6 其他的酶 有葡萄糖氧化酶 半乳糖苷酶和脲酶等 64 2 酶标记的抗体或抗原 称为结合物 制备方法通常有戊二醛交联法 包括有一步法和二步法 和过碘酸盐氧化法 标记抗体的最佳用量 通常采用棋盘滴定法进行滴定 65 3 固相载体 主要试剂 固相的抗原或抗体 酶标记的抗原或抗体和与标记酶直接关联的酶反应底物 可作固相载体物质最常用的是聚苯乙烯 与聚苯乙烯类似的塑料为聚氯乙烯 聚苯乙烯作为ELISA固相载体 载体还包括微孔滤膜和含铁磁性微粒 聚氯乙烯板的特点为质软板薄 可切割 价廉 但光洁度不如聚苯乙烯板 聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高 但空白值有时也略高 66 4 免疫吸附剂 固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂 将抗原或抗体固相化的过程称为包被 如在包被后再用1 5 牛血清白蛋白包被一次 可以消除这种干扰 这一过程称为封闭 包被好的ELISA板在低温可放置一段时间而不失去其免疫活性 67 酶免疫技术的分类酶免疫技术按实际应用目的可分为酶免疫测定 EIA 和酶免疫组织化学技术两大类 前者主要用于液体标本中抗原或抗体的定性和定量 后者主要用于组织切片或其他标本中抗原的定位 EIA是用酶标记抗原或抗体作标志物用于检测液体样品中可溶性抗原或抗体含量的微量分析技术 EIA反应系统中 酶标抗体 抗原 经反应后 可与相应的抗原 抗体 形成免疫复合物 通过测量复合物中标记酶催化底物水解呈色的颜色深浅 可以推算待测抗原或抗体含量 根据抗原抗体反应后是否需将结合和游离的酶标志物分离 EIA一般可分为均相和异相两种类型 68 一 均相酶免疫测定均相法是利用酶标志物与相应的抗原或抗体结合后 标记酶的活性会发生改变的原理 可以在不将结合和游离酶标志物分离的情况下 通过测定标记酶的活性的改变 而确定抗原或抗体的含量 均相酶免疫测定主要用于小分子激素和半抗原 如药物 的测定 均相法的优点是适合于自动化测定 但反应中被抑制的酶活力较小 需用灵敏的光度计测定 反应的温度也需严格控制 其应用相对要局限得多 一 酶放大免疫测定技术 EMIT 二 克隆酶供体免疫分析 CDEIA 69 二 异相酶免疫测定异相酶免疫测定是目前应用最广泛的一类标记免疫测定技术 依据测定方法是否采用固相材料以吸附抗原或抗体 又分为液相和固相酶免疫测定两类 一 异相液相酶免疫测定 二 固相酶免疫测定如常用的酶联免疫吸附试验 ELISA 70 酶联免疫吸附实验 ELISA 属固相酶免疫测定方法 其基本原理是在固相载体 如聚苯乙烯反应板 上包被抗原或抗体后 通过抗原抗体反应使酶标抗体 或酶标抗原 结合到载体上 经洗涤使结合的酶标抗体和游离的酶标抗体分离 洗去游离的酶标抗体 或酶标抗原 加入底物显色 根据颜色深浅进行定性或定量分析 71 酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理 72 ELISA可用于测定抗原 也可用于测定抗体 在这种测定方法中有3种必要的试剂 固相的抗原或抗体 酶标记的抗原或抗体 酶作用的底物 根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件 可设计出各种不同类型的检测方法 73 一 双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法 操作步骤如下 1 将特异性抗体与固相载体连接 形成固相抗体 洗涤除去未结合的抗体及杂质 2 加受检标本 使之与固相抗体接触反应一段时问 让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合 形成固相抗原复合物 洗涤除去其他未结合的物质 3 加酶标抗体 使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合 彻底洗涤未结合的酶标抗体 此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量成正相关 4 加底物 夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物 根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量 74 二 双位点一步法在双抗体夹心法测定抗原时 如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体 则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步 这种双位点一步法不但简化了操作 缩短了反应时间 如应用高亲和力的单克隆抗体 测定的敏感性和特异性也显著提高 单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平 75 三 间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法 其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体 故称为间接法 四 竞争法竞争法可用于测定抗原 也可用于测定抗体 以测定抗原为例 受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合 因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量成反比 76 五 捕获法测IgM抗体血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在 后者会干扰IgM抗体的测定 因此测定IgM抗体多用捕获法 先将所有血清IgM 包括特异性IgM和非特异性IgM 固定在固相上 在去除IgG后再测定特异性IgM 77 六 应用亲和素和生物素的ELISA亲和素是一种糖蛋白 可由蛋清中提取 分子量60kD 每个分子由4个亚基组成 可以和4个生物素分子亲密结合 现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉亲和素 78 应用 具有高度的敏感性和特异性 几乎所有的可溶性抗原抗体系统均可用以检测 它的最小可测值达ng甚至pg水平 与放射免疫分析相比 酶免疫测定的优点是标记试剂比较稳定 且无放射性危害 免疫渗滤试验和免疫层析试验具有简便 快速 单份测定 可立等结果等优点 79 均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测 ELISA则应用更为广泛 可用以检测的项目包括以下几个方面 1 病原体及其抗体广泛应用于传染病的诊断 病毒肝炎病毒 风疹病毒 疱疹病毒 轮状病毒等 细菌如链球菌 结核分枝杆菌 幽门螺杆菌和布氏杆菌等 寄生虫如弓形体 阿米巴 疟原虫等 2 蛋白质各种免疫球蛋白 补体组分 肿瘤标志物 如甲胎蛋白 癌胚抗原 前列腺特异性抗原等 各种血浆蛋白质 同工酶 如肌酸激酶CK MB 激素 如hCG FSH TSH 3 非肽类激素如T3 T4 雌激素 皮质醇等 4 药物和毒品如地高辛 苯巴比妥 庆大霉素 吗啡等 80 电化学发光免疫测定是继放射免疫 酶免疫 荧光免疫 化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术 是电化学发光 ECL 和免疫测定相结合的产物 它的标记物的发光原理与一般的化学发光 CL 不同 是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应 实际上包括了电化学和化学发光二个过程 81 免疫渗滤试验 82 一 原理斑点金免疫渗滤试验 DIGFA 是将抗原或抗体点加在固相载体硝酸纤维素薄膜上 制成抗原或抗体包被的微孔滤膜并贴置于吸水材料上 依次在膜上滴加标本 免疫胶体金及洗涤液等试剂并与硝酸纤维素膜上的相应抗体或抗原发生反应 过量试剂很快渗入吸水材料中 抗原抗体反应后 形成大分子胶体金复合物 从而使阳性结果在膜上呈现红色斑点 液体通过微孔滤膜时 渗滤液中的抗原或抗体与膜上的抗体或抗原相接触 起到亲和层析的浓缩 达到快速检测的目的 同时洗涤液的渗入在短时间内即可达到彻底洗涤的目的 83 二 方法类型1 双抗体夹心法测抗原用抗体结合在微孔滤膜中央 滴加待检标本 若标本中为待测抗原则与膜上抗体结合 然后滴加金标抗体 加洗涤液洗涤后 阳性者即在膜中央呈红色斑点 胶体金聚集 2 间接法测特异性抗体用抗原包被在微孔滤膜上 滴加待测标本 滴加洗涤液洗涤后 滴加金标抗抗体 加洗涤液洗涤后 阳性者即在膜中央呈红色斑点 胶体金聚集 该法由于血清标本中非目的IgG的干扰 易导致假阳性结果 84 本方法实验操作非常简单 其操作要点为 1 将反应板平放于实验台面上 于小孔内滴加含待测抗原的标本1 2滴 待完全渗入 与膜上的抗体反应而结合在膜上 2 于小孔内滴加胶体金标记抗体试剂1 2滴 待完全渗入 使胶体金标记抗体与结合在膜上的抗原反应 3 于小孔内滴加洗涤液2 3滴 待完全渗入 洗去未结合的胶体金标记抗体 4 结果观察在膜中央有清晰的淡红色或红色斑点者判为阳性反应 反之则为阴性反应 斑点呈色的深浅相应地提示阳性强度 85 斑点免疫层析试验 一 原理斑点免疫层析试验简称免疫层析试验 ICA 也以硝酸纤维素膜为载体 但利用了微孔膜的毛细血管作用 滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移 犹如层析一般 86 二 试剂和操作免疫层析试验以单克隆双抗体夹心法为例 试验所用试剂全部为干试剂 测定时将试纸条下端浸入液体标本中 下端吸水材料即吸取液体向上端移动 流经C处时使干片上的免疫金复合物复溶 并带动其向膜条渗移 若标本中有待测特异抗原 其时可与免疫金复合物之抗体结合 此抗原抗体复合物流至测试区即被固相抗体所获 在膜上显出红色反应线条 T 过剩的免疫金复合物继续前行 至参照区与固相小鼠IgG结合 免疫金复合物中的单克隆抗体为小鼠IgG 而显出红色质控线条 R 反之 阴性标本则无反应线条 而仅显示质控线条 87 1 外周血单个核细胞的分离原理 外周血中单个核细胞 淋巴细胞和单核细胞 的比重与红细胞 多核白细胞及血小板不同 介于1 075 1 090之间 红细胞及粒细胞在1 092左右 血小板在1 030 1 035之间 因而可利用一种比重介于1 075 1 092之间 而近于等渗的溶液作密度梯度离心 使一定比重的细胞按相应密度梯度分布而加以分离2 试剂 常用的分层液有Ficoll与Percoll两种 88 淋巴细胞分离 89 1 纯淋巴细胞群的采集 利用单核细胞在37 和Ca2 存在时 能主动粘附在玻璃 塑料 尼龙毛 棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性 从单个核细胞悬液中除去单核细胞 从而获得纯淋巴细胞群 主要的方法有 粘附贴壁法 吸附柱过滤法 磁铁吸引法 90 2 淋巴细胞亚群的分离原则 根据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化 根据细胞的特性和标志选择纯化所需细胞的方法是阳性选择法 而选择性去除不要的细胞 仅留下所需的细胞为阴性选择 常用的方法包括 E花环沉降法 尼龙毛柱分离法 亲和板结合分离法 磁性微球分离法及荧光激活细胞分离仪分离法 91 T细胞亚群 CD3 CD4 CD8 反应细胞免疫功能 CD3 全T细胞 CD4 CD8升高 自身免疫性疾病 如类风湿性关节炎 SLE等 CD4 CD8降低 病毒感染 恶性肿瘤 再生障碍性贫血等 B细胞 CD19 CD20 CD22 与体液免疫功能有关 TH细胞 TH1 TH2细胞因子 IFN IL 4 92 93 B细胞具有多种特异性抗原和受体1 B细胞表面抗原的检测 B细胞表面有CD19 CD20 CD21 CD22和CD29等分化抗原 其中有些系全部B细胞所共有 而有些仅活化B细胞所特有 据此可用相应的CD系列单克隆抗体 通过间接荧光免疫法 酶免疫组化或ABC法加以检测 2 SmIg的检测 大多采用间接荧光免疫法或包括ABC法在内的酶免疫组化法 关键是选用高效价 高特异性和高亲和力的荧光或酶标记的多价抗人Ig抗体 也可分别用各种类型的Ig 即IgM IgG IgA IgE等抗血清 检测带有各种类型Ig的B细胞 在人外周血中以带有SmIgM的细胞数为最多 94 95 免疫细胞检测的临床意义T细胞功能检测主要用于判断细胞免疫功能 B细胞功能检测主要了解体液免疫功能 在淋巴细胞中 有一类细胞无需有抗体存在或预先加以致敏就有杀伤作用 这种作用是天然的 这一类淋巴细胞为自然杀伤细胞 NK 它的生物学活性有细胞毒作用 分泌细胞因子以及粘附功能 从而赋予NK细胞抗感染 抗肿瘤 免疫调节和调控造血细胞分化等免疫功能 尤其在抗肿瘤的免疫监视作用中处于第一道防线 肿瘤病人NK细胞活性降低 在有免疫抑制情况时NK细胞活性也可降低 动态观察有助于判定免疫增强类药物的疗效 96 FCM在AIDS病检测应用及免疫指标 97 人类感染HIV后 HIV主要选择地侵入人类具有重要免疫功能的T淋巴细胞亚群中的T辅助性细胞 即Th细胞 CD3 CD4 细胞 使具有重要免疫功能的T细胞群破坏 相继累及全身免疫功能器官 使全身免疫状态下降 98 免疫指标 T淋巴细胞总数减少 正常65 81 T细胞亚群比值倒置 Th Ts 1 0 正常1 3 2 1 1 Th细胞 CD4 细胞 绝对计数 200个 ml Ts细胞增高 NK细胞减少或活力下降 B淋巴细胞群则在正常范围 99 血清IgG IgA IgM测定 100 临床意义 原发性无丙种球蛋白血症时 5种主要的免疫球蛋白均缺乏 原发性丙种球蛋白异常症时 往往仅有一种或几种免疫球蛋白缺乏 而其余免疫球蛋白正常或升高 101 三种主要免疫球蛋白在肝病时的变化规律 IgG 急性肝炎时IgG轻度增加 两周至1个月达最高值 2 3个月后仍呈异常高值而不降至正常者 应疑及向慢肝转化 IgG的持续升高 是肝炎活动性病变的指标 IgA 在急 慢性肝炎时 IgA仅轻度增加 在肝硬化特别是酒精性肝硬化时 IgA显著增加 IgG IgA之比值变化 在临床上对某些肝病也有诊断意义 比值正常或增大时 提示病毒性肝炎 比值低于正常提示肝硬化 IgM 在甲型肝炎急性期 可伴有轻度或中度的IgM增高 在病后的最初两周内改变最显著 到恢复期降到正常水平 乙型肝炎时IgM浓度正常 因而认为IgM的测定有助于两型肝炎的鉴别诊断 102 尿液及脑脊液Ig测定 103 尿液Ig测定及临床意义正常人尿液中的Ig含量甚微 当机体的免疫功能异常或炎症反应引起肾脏疾病时 可导致肾脏肾小球滤过膜分子屏障破坏或电荷屏障受损 从而引起球蛋白及其他大分子蛋白质漏出增多 在滤过膜损伤轻微时 尿液中以IgG滤出增多为主 当滤过膜损伤严重时 尿液中除IgG滤出外 分子量较大的IgM也开始滤出 临 常选用测定尿液和血液中的转铁蛋白 TRF 及IgG含量 计算选择性蛋白尿指数 SPI 以此来评估肾小球滤过膜破坏程度及观察治疗效果和预后 测定方法一般选用速率散射免疫比浊法 尿液标本采集晨尿或随机尿 离心后测定 104 选择性蛋白尿指数计算公式为 SPI 尿IgG 血清IgG 尿TRF 血清TRF SPI 0 1表明肾脏有高度选择性地排泌分子量较小的蛋白质 SPI 0 2表明肾脏是非选择性地排泌分子量较大的蛋白质 微小病变型肾病的SPl大部分属于高度选择性 SPl 0 1 而膜性肾病 膜增殖性肾炎与肾病综合征其SPl通常 0 2 尿内IgA在原发性肾小球肾病和慢性肾炎肾病时含量最高 在慢性肾炎高血压型及普通型可轻度增高 而在隐匿性肾炎及急性肾炎时含量很少 尿内IgG在原发性 肾小球肾炎和慢性肾炎时含量较高 其他类型肾小球疾病时仅轻度增高 尿内IgM仅出现在慢性肾炎 而原发性肾小球肾炎和隐匿性肾炎时含量甚微 故可根据尿内Ig增高的类型来帮助鉴别诊断肾小球疾病的种类 尿液中游离轻链的检测对诊断轻链病是不可缺少的步骤 并对多发性骨髓瘤等疾病的分型鉴定及预后判断均有重要意义 105 脑脊液Ig测定及临床意义中枢神经系统内可以产生很强的免疫应答 这是某些自身免疫性神经系统疾病发生 发展的病理学基础 因此脑脊液 CSF 免疫球蛋白成分及其含量的检测 对某些中枢神经系统疾病的诊断 疗效观察具有重要意义 临 主要通过测定白蛋白商值 Albquotient QALB 即测定CSF中自蛋白 Albcsf 和血清白蛋白 Albs 比值来反映血脑屏障受损程度 其计算公式为 白蛋白商值 Albcsf Albs 1000 当商值 9时 提示血脑屏障无明显受损 9 15为轻度受损 l5 33为中度受损 33 100为重度受损 100为完全破裂 106 检测白蛋白商值不仅可以监测血脑屏障损伤的程度 判断病情的严重程度 还可以提示神经系统疾病的类型 一般来说 QALB轻度升高 常见于急慢性病毒感染 多发性硬化 神经梅毒 带状疱疹性神经节炎 脑萎缩等神经系统疾病 QALB中度升高 常见于急性神经疏螺旋体病 条件致病性脑膜炎 吉兰 巴雷综合征等 QALB重度升高 常见于化脓性脑膜炎 单纯疱疹性脑炎 结核性脑膜炎等严重细菌感染性疾病 107 M蛋白的检测与鉴定 108 M蛋白是浆细胞或B淋巴细胞单克隆大量增殖时所产生的一种异常免疫球蛋白 其氨基酸组成及排列顺序十分均一 空间构象 电泳特征也完全相同 本质为免疫球蛋白或其片段 轻链 重链等 由于它产生于单一克隆 又常出现于多发性骨髓瘤 巨球蛋白血症 恶性淋巴瘤病人的血或尿中 故称M蛋白 109 1 多发性骨髓瘤与巨球蛋白血症时的M蛋白检测和鉴定 1 血清总蛋白定量 90 的患者血清总蛋白含量升高 70 的患者 100g L 约10 的患者正常或甚至偏低 如轻链病时 2 血清蛋白醋纤膜或琼脂糖电泳 M蛋白在电泳时出现典型的单株峰 亦称M区带 特点是区带窄而浓 扫描时呈现尖高峰 在 区高比宽 2 在 区 1 此M区带可因Ig的不同而出现在在 2的任何区域 M蛋白增殖的另一特点是其他各区带明显减少 显示图像较简单 110 3 血清Ig定量 一般M蛋白所属Ig含量均显著增高 其他类Ig则正常或显著减低 4 免疫电泳 正常人血清免疫电泳结果 可分辨出20多种蛋白成分 在阳极端有船形很浓的沉淀线为白蛋白 通常Ig组分靠阴极端 最靠近加样孔者为IgM 依次为IgA IgG 三者成平滑的连续沉淀线 多发骨髓瘤 多发性骨髓瘤分IgG IgA IgM IgI 和IgE5种 IgG和IgA又分亚类 所有Ig的轻链又分两个型 因此 免疫电泳时变形沉淀线的位置随各分子的电泳区带不同而异 从慢 2区皆可出现 IgG1多出现在慢 区 IgG4在 2区 M蛋白与相应的抗重链血清 抗轻链血清形成迁移范围十分局限的浓密的沉淀弧 111 5 尿本 周蛋白检测 定性检测 用热沉淀法和磺基水杨酸法 免疫电泳法 用待检尿浓缩后进行免疫电泳 大多数多发性骨髓瘤病人和轻链病患者 仅出现一条致密的弓形弯曲的沉淀线 本法60 80 的骨髓瘤病人和几乎全部轻链病病人可检出尿本周蛋白 轻链白蛋白 戊二醛交联免疫电泳法 多发性骨髓瘤 华氏巨球蛋白血症及轻链病可呈阳性 正常人阴性 本法尿本周蛋白检出率为100 假阳性4 尿中含有200 g ml时即可出现阳性结果 112 2 重链病时M蛋白检测与鉴定与多发性骨髓瘤相同 免疫电泳时由于重链分子较Ig分子小 故迁移率快 电泳位置较靠阳极侧 但重链病一般需选择免疫电泳证实 113 冷球蛋白检测 114 冷球蛋白是血清中的一种特殊蛋白质 在4 时自发沉淀 加温至37 时又可溶解 故常利用这种可逆性冷沉淀的特性对其进行测定 取患者外周血 分离出血清置4 冰箱中 一般在24 72h出现沉淀 若1周仍不出现沉淀者方可判断为阴性 如形成沉淀 再置37 温育使其复溶 也可将冷沉淀物离心洗涤后做定性与定量分析 115 部分单克隆冷球蛋白可在低于10 时发生沉淀 故标本采集时必须将注射器和容器预温 离心及整个操作过程中也都要注意保温 部分冷球蛋白在冷的条件下可迅速沉淀 但有一些则需数天 因此 这些血清需在4 下放置1周 大部分正常人血清也含有多克隆冷球蛋白 但通常在是80 g ml以下 冷纤维蛋白原 C反应蛋白 蛋白复合物和肝素沉淀蛋白等也具有冷沉淀特性 实验时应加以区别 116 补体的大多数组分都是糖蛋白 且多属于 球蛋白 C1q C8等为 球蛋白 C1s C9为 球蛋白 正常血清中各组成分的含量相差较大 C3含量最多 C2最低 各种属动物间血中补体含量也不相同 豚鼠血情中含有丰富的补体 故实验室多采用豚鼠血作为补体来源 补体性质不稳定 易受各种理化因素影响 例如加热65 30min即被灭活 另外紫外线照射 机械振荡或某些添加剂等理化因素均可能破坏补体 所以补体活性检测标本应尽快地进行测定 以免补体失活 补体系统各组成分的主要理化性质