MICM检测在恶血液病中运用PPT课件.ppt

MICM检测在恶性血液病中的运用 曾雁玲 1 背景介绍 血液病是原发于造血系统的疾病 或影响造血系统伴发血液异常改变 以贫血 出血 发热为特征的疾病 出血性疾病 贫血症 白细胞疾病 常见血液病 造血系统恶性肿瘤 2 恶性血液病类型 3 MICMFAB形态学诊断 Morphology 包括血液和骨髓形态学及组织化学染色 免疫学检查 Immunology 遗传学检查 Cytogenetics 分子生物学检查 Molecular 检测方法 4 一 形态学 是诊断的基础 任何淋巴造血系统增生性疾病的诊断都离不开形态学诊断 形态学诊断技术包括细胞学 外周血 骨髓涂片组织学 骨髓活检 血凝块 5 外周血涂片检测 血液病血常规 用来观察外周血细胞形态 数量 是对血液分析仪检测的血常规的镜下检测补充 检测内容包括 白细胞如粒细胞 单核细胞 淋巴细胞 红细胞 血小板 6 骨髓涂片检测 1 骨髓增生程度 G E 骨髓小粒及脂肪油滴有无及分度 2 粒细胞系统 红细胞系统 淋巴细胞系统 单核细胞系统 巨核细胞系统 浆细胞系统以及其他细胞 网状细胞 内皮细胞 纤维细胞 成骨细胞 破骨细胞 组织嗜碱细胞 退化细胞等 的形态及比例 血小板的情况 3 骨髓小粒4 有无转移瘤和寄生虫 7 8 9 10 11 骨髓病理检测 在高倍镜下观察骨髓的组织结构和各成分的分布及相互关系 12 骨髓活检和骨髓 血涂片 骨髓 血涂片 骨髓涂片细胞细微结构清楚评估红系 粒系增生情况及幼稚细胞比例具有优势骨髓纤维化 细胞致密可干抽可做组织化学染色 如铁染 对缺铁性贫血 慢性疾病引起的贫血 巨幼细胞性贫血 和急性白血病的诊断尤其有帮助 骨髓活检 骨髓活检显示骨髓的组织结构和各成分的分布及相互关系 对巨核细胞的评估具有优势不存在干抽和骨髓稀释可做免疫组织化学染色对再生障碍性贫血 低增生性白血病 淋巴瘤 转移癌 骨髓增生性肿瘤的诊断具有重要价值 骨髓涂片看细胞 骨髓活检看结构 相互补充相互验证不能相互替代 血凝块 废物利用 骨髓活检的补充 13 骨髓活检常见问题 标本取材条件 要求穿刺1cm以上骨髓组织诊断不明确 取材部位是否有病灶保存液 10 福尔马林固定 14 二 细胞组织化学染色 以形态学为基础 运用化学或生物化学技术研究细胞内化学成分的分布及变化的检测方法 对某些血液病的诊断 鉴别诊断 疗效 判断预后有一定的意义 15 常用的细胞化学染色有 1 过氧化酶又称髓过氧化酶 Myeloperoxidase MPO或POX 阳性为棕黑色 用于急性白血病的鉴别 急性粒细胞白血病为阳性 其中M3为强阳性 急性单核细胞白血病为弱阳性 急性淋巴细胞白血病为阴性 16 17 18 2 非特异性酯酶 NSE 包括中性非特异性酯酶 NAE 棕黑色 酸性非特异性酯酶 A NAE 棕红色 碱性非特异性酯酶 NBE 棕红色 意义 急性单核细胞白血病强阳性 且能被氟化钠抑制 急性粒细胞白血病弱阳性或阴性 不被氟化钠抑制 19 20 3 特异性酯酶 SE 阳性红宝石色颗粒 意义 急性粒细胞白血病阳性或强阳性 急性单核细胞白血病阴性 慢粒急粒变阳性增强 21 22 4 苏丹黑B染色 SBB 阳性为黑色 意义 和POX基本一样 23 5 中性粒细胞碱性磷酸酶 NAP 阳性为灰黑色或黑色 计算阳性率和积分值 阳性率 计数100个中性杆状核和分叶核粒细胞 观察其阳性细胞的个数 即为阳性率 正常值 40 阳性指数 1 2 3 4的总和 正常值40 80分 意义 升高见于严重感染 类白 急淋 骨纤 真红 再障 ITP 淋巴瘤等 降低见于慢粒 急性粒细胞白血病 PNH 故可用于慢粒和类白 骨纤 再障和PNH 急粒和急淋的鉴别 24 25 6 糖原染色 PAS 阳性为红色 可以计算阳性率和阳性指数 意义 1 正常情况下 红细胞系统的原 幼红细胞和成熟红细胞 粒细胞系统的原粒细胞 原单核细胞和大多数淋巴细胞为阴性反应 自早幼粒阶段以后的粒细胞和幼单核细胞可呈弱阳性反应 2 急淋 红白血病 戈谢病的原始细胞呈强阳性反应或阳性反应 缺铁性贫血 珠蛋白生成障碍 MDS亦可呈阳性反应 急性粒细胞白血病 急性单核细胞白血病 良性淋巴细胞增多症 尼曼 皮克细胞呈阴性反应或弱阳性反应 巨幼细胞性贫血 溶血性贫血 再生障碍性贫血等幼红细胞为阴性反应 偶有个别幼红细胞呈阳性反应 3 帮助鉴别不典型巨核细胞和霍奇金细胞 巨核细胞呈强阳性反应 霍奇金细胞呈弱阳性或阴性反应 4 帮助鉴别白血病细胞和腺癌骨髓转移的腺癌细胞 腺癌细胞呈阳性反应 26 27 7 酸性磷酸酶染色 ACP 阳性酶活性部位出现红色沉淀 胞核为蓝色 意义 1 鉴别戈谢细胞和尼曼 匹克细胞 前者阳性 后者为阴性 2 多毛细胞白血病为阳性反应 且耐L 酒石酸的抑制作用 淋巴肉瘤细胞和慢性淋巴细胞白血病的淋巴细胞 酸性磷酸酶染色也呈阳性反应 但此酸可被L 酒石酸抑制 3 T淋巴细胞呈阳性反应 而B淋巴细胞为阴性反应 28 8 铁染色 Fe染色 阳性为淡绿色 细胞内铁观察有核红细胞 细胞外铁观察骨髓小粒及网状细胞 意义 1 铁低见于缺铁性贫血 2 铁高见于再生障碍性贫血 巨幼红细胞性贫血 白血病 感染和多次输血病人 3 环形铁粒幼细胞 RS 环铁大于15 见于RAS 29 30 铁粒幼红细胞定义 31 32 三 免疫分型 应用 1 确定系来源 利用不同系有特定的抗原表达可以确定髓系 B系 T NK系 组织细胞和树突状细胞 2 确定细胞分化阶段 不同发育阶段细胞 其抗原表达不同 3 预后判断 有些抗原表达和淋巴瘤 白血病预后相关 如白血病患者有CD7 与CD34 共表达 示预后不好 4 治疗方法选择 治疗靶向5 疗效判断 复发监测所以我们可以用于血液疾病的诊断如白血病 多发性骨髓瘤 淋巴瘤 MDS等 以及一些疾病的鉴别诊断如再障 ITP MPD 运用于微小残留病灶的监测等 33 常用的方法 流式细胞术和细胞免疫组织化学染色法 34 白血病分类中免疫分型的应用与意义 常用的抗原 1 白血病系列分化抗原T淋巴细胞白血病 CD3 CD5 CD7 B淋巴细胞白血病 CD10 CD19 CD22 NK淋巴细胞白血病 CD16 CD56 CD57 髓系白血病 CD13 CD14 CD33 MPO 髓过氧化物酶 红白血病 GlyA 血型糖蛋白A 巨核细胞白血病 CD41 CD42 CD61 35 2 白血病系列非特异性抗原CD34 HLA DR为早期细胞抗原 无系列特异性 可与CD38联合运用于免疫分型 一般而言 干 祖细胞CD34 HLA DR CD38 原始细胞CD34 HLA DR CD38 而幼稚细胞 如早幼粒细胞 CD34 HLA DR CD38 36 3 白细胞共同抗原CD45为白细胞共同抗原 其表达量在淋巴细胞最高 单核细胞 成熟粒细胞 早期造血细胞 blasts 依次减弱 红细胞 中 晚幼红细胞 成熟红细胞 不表达CD45 用SSC CD45PerCP双参数分析可十分容易鉴别骨髓和血液中的原始或成熟细胞 37 AML 1 M0 其特征为T B细胞标记的阴性 即CD19 CD20 CD22与CD3 CD5 CD7 CD10 作为干 祖细胞标记的CD34 CD38和HLA DR均为阳性 具有特征性的TdT标记应有至少30 的原始细胞会呈阳性表达 而髓系特征不能过多 通常是CD13 CD33 CD117中的任何一项呈阳性表达 CD68 MPO大多阴性 若髓系有两个以上标记呈阳性 应考虑未成熟的急性髓细胞白血病 38 2 M1 M1与M0相似不易区分 M1一般CD13 CD33 HLA DR 但CD34表达少于M0 可能表达部分CD15 3 M2 M0与M1的主要区别是成熟度增加 CD15较M1较显著 CD34弱于M1 CD13有时表达强于CD33 多数病例HLA DR 4 M3 高颗粒性 多数情况HLA DR 或表达减少 CD34少于M2 一般CD13弱 可有CD2表达 39 5 M4与M5 两型表型相似 但M4较M5表达更多的CD34 重要的表型为CD13 CD33 HLA DR CD14和CD15 CD33可表达强于CD13 CD33 CD13 CD34 很可能为M5 但只出现在少数病人中 部分M5可见CD56 40 6 M6 M6较少见且特征不明显 一般HLA DR CD34 CD13 CD33阳性 7 M7 巨核细胞白血病 在AML中少于1 一般CD61 Gp a 和 或CD41 Gp b a 阳性 而注意由于血小板粘附造成的假阳性以及一些不明原因出现的假阴性 这时候可以借助于小巨核酶标 CD41免疫组织化学染色 41 ALL WHO分型分为B祖细胞型 CD10 或CD10 前B细胞型 B细胞型 T细胞型 42 1 B祖细胞型ALL FAB标准的L1或L2 一般TdT HLA DR CD19 此型又分为2个亚型 CD10 和CD10 前者预后好 多数病例CD24 CD34 CD20表达随成熟度增加而增加 43 2 前B细胞型ALL 一般为CD19 CD24 HLA DR 胞浆CD22 CD10 TdT随CD20变化 CD34多为阴性 44 2020 1 3 45 3 B细胞型ALL 即成熟B细胞型ALL 即FAB标准的L3 表型为CD19 CD20 CD22 CD24且sIg 多数为IGM 阳性 多数病例CD10 46 4 T ALL 表达CD1 CD2 CD5 CD7 CD4 CD8双阳与极少膜表面CD3 TdT多为阳性 另一常见亚型为皮质早期表达CD2 CD5 CD7 TdT强表达 髓质期亚型表达CD2 CD5 CD7 与CD3 CD4 CD3 CD8 很少见TdT表达 47 杂合型白血病 随着流式技术的广泛应用 我们发现许多病例并不能严格划分为淋系或髓系 真正的双表型病人多为t 9 22 或 11q23 现在杂合型的误诊率很高 最重要的系特异性抗原在B系 T系 髓系分别为CD22 CD3和MPO 48 49 50 即染色体异常包括染色体的结构和数量异常根据这些特征性的异常 对恶性血液病进行诊断和分类 预后分层及指导治疗 四 细胞遗传学 51 核型描述 首先列出染色体总数 然后是性染色体组成 接着列出异常的染色体数目或形态 下列统一的命名符号 A G染色体组的名称1 22染色体编号X Y性染色体del缺失der结构重排的染色体dup重复inv倒位t易位 在染色体符号前表示染色体增加或减少 在染色体符号后表示染色体多出或缺少一部分 52 人类23对染色体 53 上面的核型描述就是46 XY 例如46 XY t 8 21 q22 q22 54 一 染色体检测在白血病中的意义 55 1950 1960 1970 1980 1990 2000 2010 确定染 色体数目 46 发现Ph 发现 21 各种显带技术 出现 发现多数AL患者伴有染色体异常 FISH出现 阐明某些染色体异常的分子学改变 SKY CGHPCR技术FLT3 ITD 1996 c KIT突变 1993 芯片技术 cDNAarrayArray CGH SNP array 测序技术的发展大量基因突变的发现 JAK2 NPM CEBPA PAX5 IKZF1 FLT3 RUNX1 WT1 RAS NOTCH1 新一代高 通量测序技术 各种遗传学改变间的相互作用 血液肿瘤遗传学研究的历史 56 多数AML患者有非随机性染色体改变 包括易位 倒位 插入 缺失 扩增 等臂染色体等 染色体异常在AML诊断 分型 预后评价 发病机 制研究及靶向治疗药物研发方面有重要价值 一些特殊的细胞遗传学异常在WHO分型建议中已被 列为特殊亚型 对不同细胞遗传学类型的血液肿瘤患者进行个体化治 疗可以获得更好的疗效 57 AML常见染色体异常 t 8 21 t 15 17 10 8 inv 16 t 16 16 11q23异常 5 10 3 5 30 20 45 单一异常 45 2种异常 55 5 5q 7 7q 8 Y 11 13 21 223q26 del 9q t 6 9 t 9 22 等 58 AML的WHO分型 伴再现性遗传学异常的AML 伴多系发育异常的AML继发于MDS 无MDS病史 治疗相关性AML 烷化剂相关 拓扑异构酶抑制剂相关 其它 无法分类的AML 髓细胞肉瘤 Down s综合征相关AML 59 伴再现性遗传学异常的AML AMLwitht 8 21 q22 q22 AMLwithinv 16 p13 1q22 ort 16 16 APLwitht 15 17 q22 q12 AMLwitht 9 11 p22 q23 AMLwitht 6 9 p23 q34 AMLwithinv 3 q21q26 2 ort 3 3 AML M7witht 1 22 p13 q13 RUNX1 RUNX1T1CBFB MYH11PML RARAMLLT3 MLLDEK NUP214RPN1 EVI1RBM15 MKL1 AMLwithmutatedNPM1 AMLwithmutatedCEBPA通常AML的诊断标准 原始细胞比例为20 但如果t 8 21 t 15 17 或inv 16 阳性 则不论原始细胞比例为多少 白血病诊断成立 60 AML染色体异常的预后分级 预后等级好中差 核型类型t 8 21 t 15 17 inv 16 正常 8 21 22 del 9q del 7q t 9 11 p13 q23 5 del 5q 7 inv 3 复杂异常 t 8 16 p11 p13 inv 3 q21q26 11q23异常 t 9 11 除外 t 6 9 p23 q34 等 61 二 染色体在MDS中的意义 已报道的MDS患者骨髓细胞染色体核型异常较多 其中以 5 7 8 5q 7q 11q 12q 20q 较为多见 经过很多作者反复证实 MDS患者有无染色体异常以及异常的类型对于诊断分型 评估预后和治疗决策都具有极为重要的意义 因此 细胞遗传学检查必须列为MDS常规检测项目之一 62 MDS的重现染色体异常 非平衡异常 8 7或del 7q 5或del 5q del 20q Y i 17q 或t 17p 13或del 13q del 11q del 12p 或t 12p del 9q idic X q13 其中 8 del 20q 和 Y 在不符合形态学标准的情况下不能作为MDS的确诊依据平衡异常 t 11 16 q23 p13 3 t 3 21 q26 2 q22 1 t 1 3 p36 3 q21 1 t 2 11 p21 q23 inv 3 q21q26 2 t 6 9 p23 q34 63 MDS预后判断 MDS的国际预后积分系统 IPSS 64 五 分子生物学检测 分子诊断常用技术 核酸分子杂交技术荧光原位杂交 FISH 聚合酶链反应 PCR 技术实时荧光定量PCR 多重PCR技术基因测序Sanger测序法 二代测序技术 65 荧光原位杂交 FISH 生命科学中的 钓鱼 技术原理 通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交目的 获得细胞内多条染色体或多种基因状态的信息 荧光原位杂交 Fluorescenceinsituhybridization FISH 66 FISH检测BCR ABL融合基因 BCR ABL基因正常 BCR ABL基因融合 9号 22号 双色单融合探针 检测染色体易位 abl bcr 67 聚合酶链反应PCR 按照上述步骤重复操作 PCR产物呈指数扩增模板DNA扩增倍数T 2n n 循环次数 68 Sanger测序法 DNA双脱氧链终止法测序 69 各个平台的特点 70 血液病分子诊断的意义 71 CBFB MYH11AML1 ETOPML RARaE2A PBX1MLL AF4BCR ABLTEL AML1SIL TAL1EVI1HOX11MLL AF10MLL AF9MLL ENLNPM1 ALKNPM MLF1 MLL ELLMLL AFXMLL AF1qMLL AF1pPLZF RARaMLL AF6MLL MLL dupMLL TLS ERGTEL PDGFRTEL ABLSET CANDEK CANMLL AF17E2A HLFNPM RARaAML1 MDS1 72 CBFB MYH11 Inv 16 p13q22 是急性髓系白血病 AML 特征性染色体异常 通常见于AML M4Eo亚型 占总AML患者的10 其中50 发生在AML M4Eo中 带有Inv 16 p13q22 的病人通常有较好的预后 该基因阳性的病人 可用于疗效监测和微小残留的检测 73 AML1 ETO 出现在所有的t 8 21 阳性的AML中 同时也出现在具有复杂移位的t 8 21 阴性的AML病例中 其主要出现在AML M2这一亚型中 大约有20 40 病例具有t 8 21 在非常少见的AML M1 AML M4和t AML中也有报道 t 8 21 异位是一个较好的标志 它的存在使这类病例对一些药物有较好的反应 因此基于细胞遗传学和分子遗传学的检测结果 可以为病人选择风险低的较好的治疗方案 该基因阳性的病人 可用于疗效监测和微小残留的检测 74 PML RARa t 15 17 易位是APL的一个典型标志 其易位造成了15号染色体上的PML基因和17号染色体上的RARa基因的融合 产生了一个融合基因PML RARa 检测PML RARa融合基因的存在与否 对APL的诊断 判断ATRA的疗效和预后复发都非常重要 PML RARa阳性强烈预示着复发的可能 而其持续性阴性则预示病人有更长的生存期 该基因阳性的病人 可用于疗效监测和微小残留的检测 75 PLZF RARa t 11 17 q23 q21 易位 特定的在急性早幼粒白血病或急性非淋巴细胞白血病M3型中发现 功能尚不明确 预后明显差与有t 15 17 易位的ANLLM3型 其对ATRA的化疗无反应 NPM RARa t 5 17 q35 q22 易位发生于急性非淋巴细胞白血病 见于M3 即急性早幼粒细胞白血病 病例少 有记载的只有2例儿童病例 2例的复发时间都短 预后可能不乐观 76 BCR ABL 在超过95 的CML病人的白血病细胞中 30 20 50 的成人ALL和2 10 的儿童ALL中 以及小于2 的淋巴瘤和骨髓瘤的病例中有BCR ABL融合基因 在CML中BCR ABL大部分是p210型的 少许p190 极少数p230 ALL患者的BCR ABL融合基因是p190型 60 在ALL中 Ph阳性和随之出现的BCR ABL融合基因是一个非常不好的标志 它影响着病人血相的完全缓解率和可能的生成率 该基因阳性的病人 可用格列卫进行治疗 并可进行疗效监测和微小残留的检测 77 E2A PBX1 t 1 19 的ALL中检测到 尤其是前B ALL病例中 临床症状都比较凶险 该基因阳性的病人 可用于疗效监测和微小残留的检测 MLL AF4 见于与t 4 11 相关的前BALL 预后不良但该融合基因的存在似乎能增强高剂量的Ara C的疗效 可用于疗效监测和微小残留的检测 TEL AML1 见于t 12 21 p13 q22 儿童ALL 都是前B细胞ALL 其白细胞比较低 预后较好 复发较迟 可用于疗效监测和微小残留的检测 EVI1 定位于染色体3q26 见于MDS和CML 预后不良 78 MLL ELL t 11 19 q23 p13 1 占11q23异常的3 8 为AML特征性异常 年龄以成人为主 白细胞20 109 L FAB分型M4或M5 预后不良 2年无病生存率50 NPM MLF1 t 3 5 q25 1 q34 易位 在MPS MDS ANLL M2 M4 M6 中有发现 预后非常差1 中位生存期少于1年 79 FLT3 ITD Fms样酪氨酸激酶3 内服串联重复序列 13q13 1NPM1 核仁磷酸蛋白1 5q35 急性髓系白血病 急髓相关突变检测 FLT3 TKD Fms样酪氨酸激酶3 TK区域点突变 13q12 预后不良 80 CEBPA基因位于19q13 11 CCAAT盒 增强子结合蛋白 粒细胞分化过程中起重要作用 预后良好c KIT基因位于4q11 21