DNA重组技术的基本工具PPT课件.ppt

专题一基因工程 1 假如你是一位育种专家 你能培育出下面几种 生物 吗 请问你准备用什么方法 2 这些定向改造基因的设想能实现吗 经过多年的努力 科学家终于在20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术 基因工程 3 一 基因工程的概念 DNA重组技术 生物体外 基因 DNA分子水平 定向改造生物 基因重组 基因工程是指按照人们的愿望 进行严格的设计 并通过体外DNA重组和转基因等技术 赋予生物以新的遗传特性 从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品 由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的 因此又叫做DNA重组技术 4 1 1DNA重组技术的基本工具 三种基本工具 剪刀 针线 运输车 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 运载体 5 问题探讨 普通棉花抗虫棉 6 基因工程培育抗虫棉的简要过程 普通棉花 无抗虫特性 苏云金芽孢杆菌 有抗虫性状 提取 抗虫基因 棉花细胞 含抗虫基因 棉花植株 有抗虫特性 重组DNA 导入 形成 培育抗虫棉的关键步骤有哪些 7 基因工程培育抗虫棉的关键步骤 关键步骤一 抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来 关键步骤二 抗虫基因与DNA 缝合 关键步骤三 抗虫基因进入棉花细胞 分子手术刀 限制性核酸内切酶 分子缝合针 DNA连接酶 分子运输车 基因进入受体细胞的载体 8 主要来源 1 限制性核酸内切酶 分子手术刀 原核生物 限制酶就是细菌的一种防御性工具 切割外源DNA 使之失效 从而达到保护自身的目的 简称 限制酶 分布 主要在原核生物中 你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗 二 基因工程的工具 9 原核生物易受自然界外源DNA的入侵 但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制 以防止外来病原物的侵害 限制酶就是细菌的一种防御性工具 当外源DNA侵入时 会利用限制酶将外源DNA切割掉 以保证自身的安全 所以 限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA 使之失效 从而达到保护自身的目的 限制酶在原核生物中的作用 10 T 磷酸二酯键 A 2 作用特点 11 12 2 作用特点 识别特定核苷酸序列 切断两个核苷酸之间的磷酸二酯键 具有特异性 一种限制酶一般只能识别一种特定的核苷酸序列 并且能在特定的切点上切割DNA分子 1 限制性核酸内切酶 分子手术刀 3 限制酶识别序列 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成少数的识别序列由4 5或8个核苷酸组成 13 思考与探究P7 2 为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA 通过长期的进化 含有某种限制酶的细胞 其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列 或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上 使限制酶不能将其切开 这样 尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断 并且可以防止外源DNA的入侵 14 限制酶所识别的序列 无论是6个碱基还是4个碱基 都可以找到一条中心轴线 如图 中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向 对称 重复排列的 想一想限制酶所识别的序列有什么特点 15 限制酶所识别的序列的特点 中心轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的 EcoR Sma 3 限制性核酸内切酶的作用特点 能识别特定核苷酸序列 专一性 16 3 限制性核酸内切酶的作用特点 从特定部位的两个核苷酸之间切开 切点 磷酸二酯键 T A 专一性 17 18 Sma 平末端平末端 4 限制酶的作用结果 19 EcoR 黏性末端 黏性末端 4 限制酶的作用结果 20 EcoR 黏性末端 黏性末端 重复演示 21 EcoR 黏性末端 黏性末端 大肠杆菌 E coli 的一种限制酶EcoR 能识别GAATTC序列 并在G和A之间切开 22 23 什么叫黏性末端 被限制酶切开的DNA两条单链的切口 带有几个伸出的核苷酸 他们之间正好互补配对 这样的切口叫黏性末端 24 Sma 平末端平末端 限制酶Sma 能识别GGGCCC序列 并在G和C之间切开 25 平末端 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时 切开的DNA两条单链的切口 是平整的 这样的切口叫平末端 26 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG EcoR GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 不同来源的DNA片段混合 将不同种来源的DNA片段连接起来 生物A基因片段 生物B基因片段 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 酶切 27 1 限制性核酸内切酶 分子手术刀 4 作用结果 产生黏性末端或平末端 28 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口 可产生几个黏性 平 末端 要切两个切口 产生四个黏性 平 末端 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割 会怎样呢 会产生相同的黏性 平 末端 然后让两者的黏性 平 末端黏合起来 就似乎可以合成重组的DNA分子了 思考 29 2 分子缝合针 DNA连接酶 作用 把切下来的DNA片段拼接成新的DNA 即将脱氧核糖和磷酸连接起来 作用原理 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 30 可把黏性末端之间的缝隙 缝合 起来 E coliDNA连接酶或T4DNA连接酶 即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 31 T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙 缝合 起来 但效率较低 T4DNA连接酶 32 类型 E coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 功能 大肠杆菌 T4噬菌体 恢复磷酸二酯键 只能连接黏性末端 能连接黏性末端和平末端 效率较低 相同点 差别 2 分子缝合针 DNA连接酶 33 DNA连接酶 寻根问底P6 DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗 为什么 34 DNA聚合酶 35 1 只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上 形成磷酸二酯键 形成磷酸二酯键 1 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 2 以一条DNA链为模板 将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链 2 能将DNA双链上的两个缺口同时连接起来 不需要模板 36 探规寻律 几种酶的作用部位限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶作用于 部位 DNA解旋酶作用于 部位 37 3 分子运输车 基因进入受体细胞的载体 载体需要的条件 有1 多个限制酶切点 对受体细胞无害 导入基因能在受体细胞中复制 表达 有某些标记基因 便于筛选 常用运载体 质粒 动植物病毒 3 噬菌体的衍生物 假如目的基因导入受体细胞后不能复制或不能转录 转基因生物能有预想的效果吗 作为分子运输车 载体 如果没有切割位点将会怎样 霍乱菌的质粒多个限制酶切点 你会用它来做分子运输车吗 目的基因有没有进入受体细胞 如何去发现 最常用 38 质粒是一种裸露的 结构简单 独立于细菌拟核DNA之外 并且有自我复制能力的双链环状DNA分子 39 40 常用的载体质粒 能复制并带着插入的目的基因一起复制 有切割位点 有标记基因的存在 可用含氨苄青霉素的培养基鉴别 独立于细菌拟核DNA之外的一种可以自我复制的小型环状的DNA分子 41 1 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点 以便目的基因可以插入到载体上去 这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置 还必须是在质粒本身需要的基因片段之外 这样才不至于因目的基因的插入而失活 2 载体DNA必需具备自我复制的能力 或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制 3 载体DNA必需带有标记基因 以便重组后进行重组子的筛选 4 载体DNA必需是安全的 不会对受体细胞有害 或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去 5 载体DNA分子大小应适合 以便提取和在体外进行操作 太大就不便操作 实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件 都要进行人工改造后才能用于基因工程操作 42 小结 限制酶 主要存在于原核生物中具有专一性 识别序列 切开DNA分子的磷酸二酯键产生黏末端或平末端 43 基因工程的基