酶活的测定.doc

。准确称取天山云杉种子0.1 g，先加入 1 ml 预冷的50 mmol/ L的磷酸缓冲液 (pH 7.0，内含1 mmol/ L EDTA)，研磨成匀浆，然后用 4.5 ml 分两次冲洗研钵至试管中，4 ，10000 r/min 离心 20 min，上清液即为酶提取液，4 保存用于ROS系统酶活性分析。3 酶活性的测定3.1 过氧化物酶 (POD，EC 1.11.1.7) 活性的测定。按照 Chance 和 Maehly6的方法，并作如下修改:反应混合液为50 mmol/ L的磷酸缓冲液 (pH 7.0，内含 0.1 mmol/ L EDTA) 2.9 mL，2 % H2O2 1.0 mL，50 mmol/ L 愈创木酚1.0 mL。测定时，反应混合液先在 25 水浴中预热，立即加入0.1 mL酶液以启动反应，以缓冲液调零，测定OD470值，每隔 30 s读数一次。取 0 60 s 时间段，即 1 min 反应时间来计算酶活性。以每分钟OD470增加0.01的酶量为一个酶活单位，Ug-1。 计算公式: POD活性 = A470 Vt (0.01 t FW V1) -1注: A470:反应时间内吸光度的变化；Vt:酶提取液总体积，ml；V1:测定用酶提取液体积，ml；FW:样品鲜重，g；t: 反应时间，1 min3.2 过氧化氢酶 (CAT，EC 1.11.1.6) 活性的测定。按照 Aebi7的方法，并作如下修改: 反应混合液为酶液 0.2 mL (空白管以失活的酶液代替)，50 mmol/ L的磷酸缓冲液 (pH 7.0，内含 0.1 mmol/ L EDTA) 1.5 ml，蒸馏水 1.0 ml。测定时，反应混合液和 0.1 mol/ L H2O2 预先在 25 水浴中预热。取反应混合液，加入0.1 mol/ L H2O2 0.3 ml，终体积为 3 ml，测定OD240值，每隔1 min读数一次，共读4 min。以每分钟OD240减少0.1的酶量为一个酶活单位，Ug-1。 计算公式:CAT活性 = A240 Vt (0.1 t FW V1) -1注: A240:A0(A1+ A2) / 2；A0:对照管的吸光度；A1，A2:样品管的吸光度；Vt:酶提取液总体积，ml；V1:测定用酶提取液体积，ml；FW:样品鲜重，g；t: 反应时间，1 min3.3 超氧化物歧化酶 (SOD，EC 1.15.1.1) 活性的测定。按照 Giannopolitis 和 Ries8的方法，并作如下修改:反应体系: 50 mmol/ L，pH 7.8 磷酸缓冲液3.0 ml，130 mmol/L甲硫氨酸0.6 ml，750 mol/L氮蓝四唑0.6 ml，0.1 mmol/ L EDTA 0.6 ml，酶提取液0.2 ml(对照管以失活的酶液代替)，蒸馏水 1.0 ml，20 mol/ L核黄素0.6 ml。混匀后，将一支对照管放置暗处，其他各管置于 30 光照为 4000 lx 日光灯下反应 20 min(要求照光情况一致，视酶活性高低适当调整反应时间)。至反应结束后，用黑布遮住试管，终止反应。以避光的对照管作为空白，测定各管OD560值。以抑制NBT光化还原的50 % 为一个酶活单位，Ug-1。 计算公式:SOD活性 = (A0As) Vt (0.5 A0 FW V1) -1注: A0:照光对照管的吸光度；As:样品管的吸光度；Vt:酶提取液总体积，ml；V1:测定用酶提取液体积，ml；FW:样品鲜重，g3.4 抗坏血酸过氧化物酶 (APX，EC 1.11.1.11) 活性的测定。按照 Nakano 和 Asada9的方法，并作如下修改: 反应混合液为 50 mmol/ L 磷酸缓冲液(pH 7.0，内含 0.1 mmol/ L EDTA)，0.5 mmol/ L ASA。测定时，反应混合液和 6 mmol / L H2O2 预先在 25 水浴中预热。取反应混合液 2.9 ml，加入酶液 50 l，加入 6 mmol / L H2O2 50 l (终浓度为 0.1 mmol/ L) 以启动反应，终体积为 3 ml，以不加H2O2作空白调零，测定 OD290值，每隔 10 s读数一次。取 0 30 秒时间段，即 30 秒反应时间来计算酶活性。以每分钟氧化1 mol ASA的酶量为一个酶活单位，Ug-1min-1。 计算公式: APX活性 = A290 Vt (2.8 t FW V1) -1注: A290:反应时间内吸光度的变化；Vt:酶提取液总体积，ml；V1:测定用酶提取液体积，ml；2.8: 1 mmol ASA在290nm波长的消光系数；FW:样品鲜重，g；t: 反应时间，0.5min3.5 谷胱甘肽还原酶 (GR，EC 1.6.4.2) 活性的测定。按照 Halliwell 和 Foyer10的方法，并作如下修改:反应混合液为 50 mmol/ L 磷酸缓冲液, (pH 7.5，内含 0.1 mmol/ L EDTA)，5 mmol/ LMgCl2。测定时，反应混合液、10 mmol/ LNADPH2 和 10 mmol/ L GSSG 预先于 25 水浴中预热。取反应混合液 2.34 ml，加入酶液 450 l、10 mmol/ L NADPH2 60 l ( 终浓度为 0 . 2 mmol/L ) 及 10 mmol/ L GSSG 150 l (终浓度为 0.5 mmol/ L ) 以启动反应，终体积为 3 ml，以缓冲液代替酶液调零，测定OD340值，每隔 30 s读数一次。取 0 3.5 min 时间段，即 3.5 min 反应时间来计算酶活性。以每分钟消耗1 mol NADPH的酶量为一个酶活单位，Ug-1min-1。 计算公式: GR活性 = A340 Vt (6.22 t FW V1) -1注: A340:反应时间内吸光度的变化；Vt:酶提取液总体积，ml；V1:测定用酶提取液体积，ml；6.22: 1 mmol NADPH在340nm波长的消光系数；FW:样品鲜重，g；t: 反应时间，3.5min3.6 谷胱甘肽过氧化物酶 (GPX，EC.1.11.1.9) 活性的测定。按照黄爱缨3、Flohe4,5等的方法，并作如下修改:反应体系由1.0 mmol/ L GSH 0.2 ml (含2.5 mmol/ L NaN3)，酶液0.2 ml组成，由37 预热的1.5 mmol/L H2O2 0.1ml启动反应，立即于37 水浴中反应3 min后， 加1.67 % 的偏磷酸沉淀液 (含2 % EDTA-2Na, 28 % NaCl) 2 ml 沉淀蛋白质，5000 r/min离心20 min，保留上清液。取上清液1 ml (空白管加入双蒸水0.2ml和1.67%的偏磷酸沉淀液0.8 ml)，加入0.32 mol/L Na2HPO4 1.25 ml 及DTNB (5,5-二硫对二硝基苯甲酸) 0.25 ml，反应5 min，测OD422值。必要时也要测定样品本身的GSH (及其他-SH) 的值。以单位鲜重 (g) 的植物样品，在37 下，每分钟使GSH的改变为总量的0.001时为一个酶活性单位(扣除非酶反应的GSH) ，Ug-1min-1。 计算公式: GPX活性 = (A0As) V