宽叶野生稻内生固氮菌新种描述及促

1 第十届 挑战杯 全国大学生课外学术科技作品竞赛 作品名称 作品名称 宽宽叶野生稻内生固氮菌新种描述及促水稻生叶野生稻内生固氮菌新种描述及促水稻生长长作用作用 学校全称 学校全称 华华 南南 农农 业业 大大 学学 申申报报者姓名者姓名 集体名称 集体名称 罗罗慧芬慧芬 谢红谢红薇薇 赖伟赖伟豪豪 类别 自然科学自然科学类类学学术论术论文文 哲学社会科学类社会调查报告和学术论文 科技发明制作 A 类 科技发明制作 B 类 2 宽叶野生稻内生固氮菌新种描述及促水稻生长作用宽叶野生稻内生固氮菌新种描述及促水稻生长作用 作者 罗慧芬1 谢红薇2 赖伟豪1 指导老师 谭志远1 教授 彭桂香2 副教授 华南农业大学 农学院1 资源环境学院2 广州 510642 摘要摘要 氮元素是水稻生长发育的必需元素之一 也是影响水稻产量的重 要因素 首次对宽叶野生稻 Oryza latifolia 内生菌资源进行分离纯化 用乙炔还原法测定固氮酶活性和PCR扩增固氮酶nifH基因筛选到固氮 菌6株 经SDS PAGE全细胞蛋白电泳 IS PCR DNA指纹图谱聚类分 析确定6株菌是同一个类群 形态鉴定 脂肪酸成分分析 16S rRNA 基因序列测定 初步确定所获得的菌株属于肠杆菌属的一个新类群 通过Biolog板 API 20E 耐盐和抗生素抗性 生长的pH范围 肠杆菌 科细菌共同抗原 Enterobacteria common antigen ECA 等生理生化测 定及G C mol 测定 DNA DNA杂交进一步确定为新种 命名 Enterobacter guangdongense sp nov 乙炔还原法测定结果显示新种 菌株具较高的固氮酶活性 荧光蛋白GFP标记接种水稻 证明为内生 菌 并明显促进水稻生长 研究结果进一步充实了内生固氮菌种质资 源 为内生固氮菌应用于农业生产实际奠定了基础 关键词关键词 宽叶野生稻 内生固氮菌 新种描述 促水稻生长 3 Description of a novel species of endophytic diazotrophs isolated from wild rice and the effects on promotion growth of rice seedlings Authors LUO Huifen1 XIE Hongwei2 LAI Weihao1 Supervisors TAN Zhiyuan1 PENG Guixiang2 1College of Agriculture 2College of Resources and Environment South China Agricultural University Guangzhou 510642 China Abstracts Nitrogen is one of the necessary elements of the rice growth and one of the important factors affecting the rice yields Endophytic bacteria isolated from wild rice Oryza latifolia were purified Six nitrogen fixing isolates were screened by acetylene reduction activity tests and PCR amplification of nitrogenase nifH genes These nitrogen fixing isolates were grouped together by SDS PAGE whole cell protein patterns IS PCR DNA fingerprinting patterns and identified as Enterobacte sp by cell morphology fatty acid methyl esters FAME and 16S rRNA gene sequence analysis Further tests of Biolog microplates and API 20 E strips G C mol contents DNA DNA hybridization indicated that these isolates represent a novel species within the genus of Enterobacter described as E guangdongense sp nov Isolates also showed high nitrogen activity by acetylene reduction activity ARA tests and remarkably promote the growth of rice seedlings The novel nitrogen fixing isolates may serve as valuable resources of bio fertilizer and potentially apply to agricultural production Keywords Oryza latifolia endophytic diazotrophs Enterobacter guangdongense sp nov promotion growth of rice seedlings 4 1 前言前言 内生固氮菌能够有效地侵染和寄生在植物的组织体内 而不使植 物产生病害症状 内生固氮菌研究起步较晚 1986年D bereiner实验 室首先从巴西甘蔗中分离到内生固氮菌 Baldani et al 1986 1993年 Reinhold Hurek实验室从巴基斯坦盐碱地先锋植物卡拉尔草 Kallar grass 的根 茎 叶中分离到内生固氮菌 并对它们的特性进行了研 究 证明内生固氮菌与宿主之间形成了高效固氮系统 在 1993年召 开的第 9次国际固氮大会总结报告中 赞誉了内生固氮菌的发现 它 代表了一个新的 不同于经典联合固氮的共生固氮系统 开拓了一条 新的扩展生物固氮到其它作物的途径 随后国内外更多学者展开了内 生固氮菌的研究 研究结果表明有些内生菌能帮助植物吸收营养 提 高光合作用 增强植物抗病能力 Reiter et al 2002 杨海莲等 1999 促进寄主植物生长 有的能固定大气中的氮供寄主植物利用 Chaintreuil et al 2000 Baldani et al 1997 有的具有固氮和溶磷双 重作用 有的在促植物生长时 还能增强植物的抗酸能力 由于内生 固氮菌定殖于植物体内部 不仅可满足细菌生长和固氮所需的足够能 源 低氧分压以及交换代谢产物的微环境 还避免了化合态氮的抑制 和土著微生物的竞争 因而表现出较高的固氮效率 安千里 李久蒂 1999 在禾本科植物的根皮层到导管的广大区域定殖着大量内生菌 Coombs et al 2003 Elbeltagy et al 2001 冯永君 宋未 et al 2001 安千里 李久蒂 1999 不同宿主植物中内生固氮菌的种质资源具有 较大的多样性 如从耐盐 碱先锋植物卡拉尔草中分离到Azoarcus sp A indigens A communis Azovibrio restrictus Azospira oryzae等 3属4种 Reinhold Hurek and Hurek 2000 甘蔗中能检测到 Azospirillum brasilense A lipoferum A amazonense Herbaspirillum seropedicae H rubrisubalbicans Acetobacter diazotrophicus Burkholderia spp 等4属7种内生固氮菌 Robert et al 2003 各类新的内生固氮菌资源的发掘 已成为开发和利用内生固氮 菌功能的前提条件 Tan et al 2003 的研究表明 施用氮肥能显减少 水稻中内生固氮菌的多样性和固氮酶基因表达 宽叶野生稻长期生长 在未施肥的自然条件下 存在多样性的 高固氮酶活性的内生固氮菌 几率较大 关于宽叶野生稻内生固氮菌的分离描述未见报道 本研究 旨在利用栽培稻的近缘种 野生稻 从其中分离到的内生固氮菌易于 转化应用到栽培稻的生产实际中 为将来开发和利用这类固氮菌资源 5 服务 2 材料与方法材料与方法 2 1 材料材料 2 1 1 菌株的分离 菌株的分离 纯纯化化 试验材料为采集于华南农业大学野生稻苗圃的宽叶野生稻 O latifolia 取植株新鲜根 消毒 取宽叶野生稻 洗净 切成约1cm长的小段 用75 酒精浸 泡5 s 再用0 1 氯化汞消毒7 min 无菌水冲洗7次 每次5 min 最后 一次洗的无菌水涂布于NFb培养基作对照 检查材料是否洗净 分离 研磨后制成浓度10 1 10 2 10 3菌悬液 涂布在NFb琼脂培养 基上 28 生长2 3天后 挑单菌落 纯化 取单菌落 制成涂片 镜检纯度 若不纯 重复平板划线 挑 单菌落 镜检 NFb培养基的主要成分 malic acid 5 0 g L 1 K2HPO4 0 5 g L 1 MgSO4 7H2O 0 2 g L 1 NaCl 0 1 g L 1 CaCl2 0 02 g L 1 0 5 bromthymol blue 2 0 ml L 1 vitamin solution 1 0 ml L 1 micronutrient solution 2 0 ml L 1 1 64 Fe 3 EDTA solution 4 0 ml L 1 KOH 4 5 g L 1 pH 6 8 其中vitamin solution biotin 100 0 mg L 1 pyridoxol HCl 200 0 mg L 1 micronutrient solution CuSO4 0 4 g L 1 ZnSO4 7H2O 0 12 g L 1 H2BO3 1 4 g L 1 Na2MoO4 2H2O 1 0 g L 1 MnSO4 1 5 g L 1 2 2 方法方法 2 2 1 固氮固氮酶酶活性活性 将获得的纯菌株分别接种于盛有5ml NFb半固体培养基的试管中 试管规格为10 150 mm 反口胶塞密封 置于28 培养箱内培养 24 h 后 向管内注入1 10体积乙炔气体 再培养24h后 取0 5ml样品在气相 色谱仪 SP 2100 北京产 上测定乙烯峰值 工作条件设置为 柱温 50 进样器120 检测器温度180 气体流量分别为 N2 30ml min 1 H2 30 ml min 1 干燥空气60 ml min 1 计算方法参考文献 姚拓等 2004 即 N 其中hx 样品峰值 hs 标准C2H4峰值 C 标准 ths VChx 9 24 6 C2H4浓度 nmol ml 1 V 培养容器体积 ml t 样品培养时间 h N 产生的C2H4 浓度 nmol ml 1 h 1 2 2 2 nifH基因的基因的扩扩增增 小量DNA提取法提取菌株DNA 彭桂香等 2005 以正向引物 Zehf TGY GAY CCN AAR GCN GA 反向引物Zehr ND GCC ATC ATY TCN CC D A G或T N A C G或T Y C或T R A或G 扩增 nifH基因 Zehr等 1989 反应条件是97 预变性3 min 97 变性1 min 55 退火 50 s 72 延伸 35 s 总共进行35个循环 72 延伸5 min 2 2 3 SDS PAGE全全细细胞蛋白胞蛋白电电泳泳 蛋白质的提取 用预称重的Eppendorf管离心收集菌体 对数生长 期 称其重量 并用样品缓冲液裂解细胞 使其浓度达到150 mg ml 1 将样品在95 下加热10 min 8000 r min 1离心2 min 放入 20 冰 箱中待用 临用前将样品在95 下加热10 min 上样 全细胞蛋白电泳 用DYCZ 24D双垂直电泳槽 10 的分离胶 5 的 浓缩胶 电泳视指示剂溴酚兰到达胶的底端0 5cm处时停止 溶液的 配方及具体操作见参考文献 谭志远等 1998 胶的染色 电泳结束后把胶取下放大小适合的盒子里 用考马斯 亮蓝 甲醇和乙酸配成的染色液染色 染色液的量以刚刚浸过胶为宜 在37 摇床振荡30 min 然后用乙酸和甲醇配成的脱色液脱色 遵循 少量多次原则 直到背景蓝色褪去 2 2 4 插入序列插入序列IS PCR 指指纹图谱纹图谱分析分析 采用引物J3 5 GCT CAG GTC AGG TGG CCT GG 3 作为IS PCR引物 彭桂香等 2005 PCR反应体系为50 0 l 10 PCR 缓冲液 5 0 l 10 mM dNTPs 1 0 l J3引物 浓度50 0 mol 0 5 l 去离子无 菌水 41 5 l 模板DNA 浓度20 0 ng l 1 1 0 l Taq DNA聚合酶 3 U l 1 1 0 l PCR反应条件 97 C预变性3 min 35个循环 97 C变性 50 s 56 C 退火50 s 72 C 延伸60 s 循环反应完成后 72 C延伸5 min 反应完成后用2 琼脂糖电泳检测PCR产物 4 C 保存备用 将 保存的IS PCR产物进一步用高分辨率的6 聚丙烯酰胺凝胶电泳 得 7 到指纹图谱 彭桂香等 2005 2 2 5 脂肪酸脂肪酸组组成分析成分析 提取方法 本文参考卢焱等 1997 的实验方法 对样品的处理方 法做了一些改进 先培养细菌至对数生长期 取大约40 mg湿重的菌 体放在5 ml带螺旋盖试管中 盖子内衬特弗龙 teflon密封垫 向样品 管中加入15 NaOH 甲醇 V V 1 ml 100 水浴 30 min 然后加入 25 HCl 甲醇 V V 2 ml 80 水浴 10 min 冷却后加入正己烷 甲基叔丁基醚 V V 1 1 1 ml提取脂肪酸甲酯 将提取物移入另一试 管中加12 NaOH溶液进行洗涤 毛细管柱气相色谱条件 SP 2100型气相色谱仪 北京产 与N2000 色谱软件联用 计算机采集数据 30 m 0 22 mm 0 22 m SE 54弹 性石英毛细管色谱柱 FID检测器 进样口和检测器的温度分别是 250 和270 程序升温 120 维持2 min 以20 min 1速率上升至 180 维持1 min 然后以5 min 1的速率上升至240 维持1 min 继 续以10 min 1速率上升至270 维持2 min 载气N2 30 ml min 1 H2 30 ml min 1 干燥空气300 ml min 1 2 2 6 生理生化生理生化鉴鉴定定 2 2 6 1 菌株菌株对对碳源利用和碳源利用和产酶产酶情况情况 根据Biolog Hayward CA USA 和API 20E系统 bioMerieux Montakieu Vercieu France 及它们的系统指导手册测定菌株对碳源利 用和产酶情况 将菌株在NFb固体培养基上28 培养24 h 用生理盐 水制成菌悬液 OD 0 25 加入微量测试板中 28 培养1 3 5 7天 观察各孔颜色变化并记录 判断菌株的生长情况 并将结果数值化 能生长的是阳性反应 记录为 数值化为 1 反之为 数值化 为 0 采用不加权算术平均UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean 方法聚类 用TREECONW Van de Peer and Wachter 1994 软件完成 2 2 6 2 抗生素 抗生素 pH及耐及耐盐试验盐试验 操作方法与2 2 6 1中biolog板测定相同 只是所用试剂板中的碳 源改为不同种类和浓度的抗生素 不同pH和不同浓度的Nacl 将菌株 在NFb固体培养基上28 培养24 h 用生理盐水制成菌悬液 OD 0 25 加入微量测试板中 28 培养1 3 5 7天 观察各孔颜色变化并记录 8 判断菌株的生长情况 并将结果数值化 能生长的是阳性反应 记录 为 数值化为 1 反之为 数值化为 0 2 2 6 3 肠肠杆菌科杆菌科细细菌共同菌共同抗原抗原 Enterobacteria common antigen ECA 大肠杆菌E coli O14抗原提取和ECA兔疫血清制备参考 Whang Neter 1962 的方法 间接血凝试验用2 的新鲜兔红细胞作抗原 致敏载体 antigen modified erythrocytes 将供试菌株中提取的抗原 与2 的兔红细胞按2 1比例混合 37 水浴作用60分钟 每间隔15分 钟振荡一次 将致敏的红细胞用生理盐水洗2 3遍 最后用PBS缓冲 液配成所需浓度 将ECA兔免疫血清由1 10起倍比稀释到1 5120 取 ECA兔疫血清和致敏抗原各25 l 混合于微量血凝板 U 形或 V 形 孔内 于微量振荡器上振荡1 2分钟 32 或室温作用1 2小时后 用肉眼观察结果 以明显出现血细胞凝集者 血凝效价大于1 10 记录 ECA为阳性 否则记为阴性 2 2 7 G C mol 含量含量测测定和定和DNA DNA杂杂交交 菌体培养与收集 DNA的提取按文献 Marmur 1961 G C mol 测定采用热变性法 DNA DNA杂交同源性测定采用初始复性速率法 在2XSSC溶液中进行 以Escherichia coli K12作为参考菌株 De Ley et al 1970 谭志远等 1995 2 2 8 16S rRNA基因基因扩扩增及序列增及序列测测定定 以少量提取的 DNA为模板 正向引物25f 5 AAC T G T A AGA GTT TGA TCC TGG CTC 3 和反向引物1492r 5 TAC GG C T TAC CTT GTT ACG ACT T 3 PCR扩增16S rDNA Tan 等 2001 PCR反 应条件是97 预变性3 min 97 变性50 s 56 退火50 s 72 延伸 60 s 35个循环 72 延伸5 min 测序由华大基因研究中心完成 所用 引物为35fc 5 CTK AAG AGT TTG ATC MTG GCT CAG ATT GAA CG 3 342fc 5 CTC CTA CGG GAG GCA G 3 和930fc 5 GGT TAA AAC TYA AAK GAA TTG ACG GGG AC 3 引物由北京三博 远志生物技术有限责任公司合成 序列分析采用软件CLUSTALX进行比对 alignment 后 再用软件 GeneDoc进行人工比对和格式转换 最后用TREECONW进行邻近法 neighbor joining method 聚类分析并构建系统发育树 9 2 2 9 细细胞形胞形态观态观察察 细胞形态观察采用负染色 Cole M为DNA PstIDNA marker 3 4 新新类类群的确立群的确立 3 4 1 固氮菌的固氮菌的SDS PAGE全全细细胞蛋白胞蛋白电电泳聚泳聚类类 将分离到的6株内生固氮菌进行全细胞蛋白电泳初步聚类分析 结果见图2 6株菌具有高度相似的蛋白质图谱类型 初步归为同一个 11 类群 未表现菌株多样性 因我们只运用了NFb培养基筛选内生菌 所以分离到的内生菌比较少 选取菌株Ola 50 Ola 51和Ola 01进行 16S rDNA测定后 它们与已知亲缘关系最近的种为Enterobacter cloacae 将E cloacae 模式菌株CGMCC 1 2021T和待测类群菌株进行 蛋白质图谱类型比较 发现它们间存在有较大差异 图2 图图2 SDS全细胞蛋白电泳聚类图谱 M 蛋白质 maeker 泳道1 2 3 4 5 6 7依次为菌株E cloacae CGMCC 1 2021T Ola 51 Ola 10 Ola 50 Ola 12 Ola 01 Ola 28 3 4 2 插入序列插入序列IS PCR指指纹图谱纹图谱分析分析 采用IS PCR指纹图谱技术从DNA水平上对待测类群菌株和已知 种模式菌株进行比较 结果见图3 图中待测类群菌株除有1条指纹带 不一致外 其余带型一致 从DNA 分子水平上确证6株菌为同一类群 菌 并与亲缘关系较近的已知种有较大的差异 IS PCR指纹图谱结果 与蛋白质图谱的聚类结果一致 12 图图3 IS PCR指纹图谱分析结果 M DNA maeker 泳道1 2 3 4 5 6 7依次为菌株Enterobacter cloacae CGMCC 1 2021T Ola 51 Ola 10 Ola 50 Ola 12 Ola 01 Ola 28 3 4 3 脂肪酸脂肪酸组组成分析成分析 新分离的6株菌与亲缘关系较近的已知种E cloacae在细胞脂肪 酸含量和组成成分存在差异 尤其是在分离时间9 5 min时 待测类群 代表菌株 Ola 51多出一种含量达11 3 的脂肪酸成分 而E cloacae菌 没有 各脂肪酸含量见表1 基于新分离的6株菌与亲缘关系较近的已 知种E cloacae在蛋白质 DNA指纹图谱 细胞脂肪酸含量和组成成 分上都存在较大的差异 所以初步认为所获得的菌株属于肠杆菌属的 一个新类群 表表 1 新类群代表菌株Ola 51与E cloacae CGMCC 1 2021T脂肪酸成分含量 脂肪酸含量 菌株 主要共同成分 总计不同成分 总计 E cloacae4 7 12 61 433 15 413 4 11 5 10 41 31 51 43 3100trtrtrtr0 Ola 512 63 90 821 85 310 7 13 77 10 81 74 19 58211 32 12 12 518 时间 min 6 28 810 5 12 0 12 5 14 5 16 5 17 5 18 4 19 5 22 6 25 69 513 4 15 8 21 2 含量少于0 2 为tr 3 5 内生固氮菌的生理生化特性研究内生固氮菌的生理生化特性研究 3 5 1 碳源和碳源和产酶产酶情况情况测测定定 新类群菌株与已知种E cloacae 模式菌株CGMCC 1 2021T的生理 生化测定 Biolog和API 20E 的聚类结果表明 在74 相似性水平以上 新类群菌株与参比菌株分成两个独立的类群 85 相似性水平上 新 类群菌株聚类成群 图4 新类群菌株具有较高的固氮酶活性 而E cloacae CGMCC 1 2021T没有固氮酶活性 新类群代表菌株Ola 51与 参比的模式菌株具体的特征差异 表2 13 E cloacae CGMCC 1 2021 Ola 51 Ola 01 Ola 50 Ola 28 Ola 10 Ola 12 9080100 T 图图4 新类群菌株与参比模式菌株的生理生化数值聚类结果 表 2 新类群代表菌株与已知模式菌株生理生化测定结果 特征Ola 51E cloacae CGMCC 1 2021T 特征Ola 51E cloacae CGMCC 1 2021T 草酸钠 L 天冬氨酸 香草酸 m 肌醇 D 阿拉伯糖 发酵 氧化肌醇 尿苷 半乳糖醇 苯甲酸钠 马尿酸钠 L 鼠李糖 乌头酸 测金盏花醇 丁二酸 水杨苷 L 精氨酸 正反应 positive 负反应 negative 二者均为阳性反应特征 D 葡萄糖醛酸 半乳糖醛酸 L 谷氨酸 L 丙氨酸 D 核糖 D 果糖 D 木糖 蔗糖 木糖 丙酮酸钠 麦芽糖 山梨醇 龙胆二糖 D 葡萄糖 D 甘露糖 L 阿拉伯 糖 乳酸钠 柠檬酸 D 丙氨酸 N 乙酰基 D 葡萄糖胺 D 海藻糖 D 海藻糖 D 棉子糖 酮戊二酸 P 羟基苯乙酸 D 葡萄糖醇 L 岩藻糖 L 苹果酸 L 脯氨酸 D 葡萄糖二酸 L 天 东酰胺酸 D 甘露醇 D 蜜二糖 甲基 D 葡萄糖作唯一碳源 产精氨酸双水解酶 鸟氨 酸脱羧酶 半乳糖苷酶 VP Voges Proskauer 反应阳性 可利用柠檬酸钠 可以发酵氧化葡萄 糖 甘露醇 山梨醇 蔗糖 蜜二糖 阿拉伯糖 二者均为阴性反应特征 苦杏仁苷 丙二酸 脱氧胆酸钠 菊糖 松三糖 松二糖 胱氨酸 塔 格糖 木糖醇 山梨糖 赤藻糖醇 L 甲硫氨酸 D 阿糖醇 氨基丁酸 L 羟脯氨酸 酒石酸 钾钠 淀粉 L 色氨酸 苏氨酸 D 乳糖吐温40 吐温80 L 亮氨酸 L 甘氨酸 肌苷 葵二 酸 丙酸 L 鸟氨酸 L 赖氨酸 L 组氨酸 L 苯丙氨酸 L 酪氨酸 L 阿糖醇 2 氨基乙醇 乙 酸 衣康酸 水杨酸钠 羟甲基纤维素 L 谷胺酰氨作唯一碳源 不能产色氨酸脱氨酶 细胞 色素氧化酶 明胶酶 脲酶 不产吲哚乙酸和H2S 不能将NO2产生还原到N2 14 3 5 2 抗生素抗生素 pH及耐及耐盐盐特性特性 新类群代表菌株Ola 51与E cloacae 模式菌株CGMCC 1 2021T都 能耐受耐受5 0 的NaCl 300 g ml 1的氨芐青霉素 50 g ml 1 的氯霉 素 5 g ml 1 的链霉素 5 g ml 1 的四环素素 300 g ml 1 的红霉素 新类群代表菌株Ola51生长范围是pH 3 pH 10 而 E cloacae 模 式菌株CGMCC 1 2021T生长范围是pH 4 pH 10 新类群代表菌株Ola 51能耐受300 g ml 1的新霉素和5 g ml 1的庆大霉素 而模式菌株E cloacae CGMCC 1 2021T 不能 3 5 3 肠肠杆菌科杆菌科细细菌共同菌共同抗原抗原 肠杆菌科细菌共同抗原 ECA 是几乎存在于所有肠杆菌科细菌表 面的氨基糖类抗原 间接血凝试验结果显示新类群代表菌株Ola 51肠 杆菌科共同抗原 Enterobacteria common antigen ECA 阴性 而 E cloacae 模式菌株CGMCC 1 2021T为阳性 3 6 G C mol 含量和含量和DNA DNA杂杂交交进进一步确定一步确定为为新种新种 新类群代表菌株Ola 51的G Cmol 为55 0 6mol 处于 Enterobacter属的范围 53 60 mol 内 新类群代表菌株Ola 51与E cloacae CGMCC 1 2021T的同源性分别为43 2 低于70 说明新类 群菌株与E cloacae为不同的DNA同源群 代表Enterobacter属的一个 新种 3 7 系系统发统发育分析育分析 16S rRNA基因全序列分析表明 新类群菌株Ola 51T Ola 50 Ola 01与E cloacae亲缘关系较近 相似性为98 图5 由于DNA DNA杂 交已表明新类群与E cloacae为不同的DNA同源群 且SDS蛋白质电 泳 DNA指纹图谱 生理生化测定均表明新类群与E cloacae存在较 大差异 将新类群命名为肠杆菌属的一个新种 广东肠杆菌 Enterobacter guangdongense sp nov 模式菌株为Ola 51 15 Shigella boydii strain 3557 77 AY696660 K variicola F2R9 AJ783916 E rhapontici ATCC 29283 U80206 T Pa stewartii LMG 2632 Y13251 T Citrobacter murliniae CDC 2970 59 AF025369 T E amylovora DSM 30165 AJ233410 T Pa agglomerans DSM 3493 AJ233423 T Pantoea ananatis LMG 2665 Z96081 T Erwinia psidii LMG 7034 Z96085 T P diazotrophicus LS18 DQ821584 Phytobacter diazotrophicus LS8 DQ821583 T Salmonella bongori JEO 4162 AF029226 S subterranea FRC1 AY373829 T S enterica ATCC 13314 AF008580 T C youngae CECT 5335 AJ564736 T Morganella morganii AU 1491 AY043390 Kluyvera cryocrescens 27 AY946284 Klu georgiana ATCC 51603 AF047186 Klu ascorbata CDC 0556 74 AF176566 C gillenii CDC 4693 86 AF025367 T En asburiae JCM6051 AB004744 T En hormaechei DSMZ 16691 AJ853890 T En cancerogenus LMG 2693 Z96078 T Enterobacter aerogenes JCM1235 AB004750 T K pneumoniae DSM 30104 AJ233420 T K singaporensis LX3 AF250285 T K granulomatis KH 22 AF010251 T Klebsiella pneumoniae ATCC13884 AF130983 T K pneumoniae subsp ozaenae ATCC11296 AF130982 T Pectobacterium carotovora ATCC 15713 U80197 Serratia marcescens ATCC 13880 M59160 T C werkmanii CDC 0876 58 AF025373 T C braakii CDC 080 58 AF025368 T C freundii ATCC 29935 M59291 T T Klu intermedia ATCC 33110 AF310217 100 81 53 55 90 99 100 97 66 58 100 100 100 100 56 94 77 91 100 81 S enterica serovar typhi CT18 AL627279 97 95 C koseri CDC 8132 86 AF025366 T C farmeri ATCC 51112 AF025371 T C rodentium CDC 1843 73 AF025363 T Citrobacter sedlakii ATCC 51115 AF025364 T C amalonaticus CDC 9020 77 AF025370 T Enterobacter cloacae ATCC 13047 AJ251469 T E guangdongense Ola 51 EF488759 T E guangdongense Ola 50 EF488758 E guangdongense Ola 01 EF488760 图图 5 新类群代表菌株与已知菌株系统发育树状图 长度为1 碱基差异 16 3 8 水稻内生固氮菌水稻内生固氮菌GFP标记结标记结果果 通过CaCl2 感受态细胞制备方法将质粒p KK2232GFP转化代表 菌株Ola 51 在LB平板中加入氨苄青霉素获得带GFP标记的菌落 如 图6 约为7 0 105细胞 g鲜组织 试验说明Ola 51能大量定殖于水稻 体内 为内生固氮菌 图图 6 接种水稻后 重新获得的带GFP标记的菌落 3 9 Enterobacter guangdongense sp nov 新种描述新种描述 Enterobacter guangdongens guang dong en se N L adj guangdon gense referring to its isolation from O latifolia grown in guangzdong provice in southern China 革兰氏阴性细菌 杆状 端生鞭毛 图7 能运动 大小0 8 1 1 m 1 5 2 0 m 宽x长 兼性厌氧 化能营养型 具固氮能力 菌落在 NFb培养基上呈圆锥形 透明 生长温度10 40 最佳生长温度28 37 pH生长范围是pH 3 pH 10 该种所有菌株来源于宽叶野生稻 17 O latifolia 能利用D 葡萄糖醛酸 半乳糖醛酸 L 谷氨酸 L 丙氨 酸 D 核糖 D 果糖 D 木糖 蔗糖 木糖 丙酮酸钠 麦芽糖 山梨醇 龙胆二糖 D 葡萄糖 D 甘露糖 L 阿拉伯糖 乳酸钠 柠檬酸 D 丙 氨酸 N 乙酰基 D 葡萄糖胺作唯一碳源 产精氨酸双水解酶 鸟氨酸 脱羧酶 半乳糖苷酶 可以发酵氧化葡萄糖 甘露醇 山梨醇 蔗糖 蜜二糖 阿拉伯糖 不能产色氨酸脱氨酶 细胞色素氧化酶 明胶酶 脲酶 不产吲哚乙酸和H2S 不能将NO2还原到N2 能耐受5 0 的 NaCl 300 g ml 1的氨芐青霉素 50 g ml 1的庆大霉素 50 g ml 1 的 氯霉素 5 g ml 1 的链霉素 300 g ml 1 的新霉素氯 5 g ml 1 的四 环素素 300 g ml 1 的红霉素 肠杆菌科共同抗原 Enterobacteria common antigen ECA 阴性 模式菌株Ola 51的G C mol 为55 0 6 mol 与该属其它种的区别特征 表3 0 2 m 图图 7 Enterobacter guangdongense sp nov Ola 51T细胞的电镜结果 18 表表3 Enterobacter guangdongense sp nov 与肠杆菌属相关种的区分特 征 1 234567 Voges Proskauer 脲酶水解 d d 赖氨酸脱羧酶 精氨酸双水解酶 d 细菌运动性 丙二酸利用 阿拉伯糖 己六醇 甘油 d 肌醇 d 密二糖 棉子糖 d L 鼠李糖 D 山梨糖醇 蔗糖 酒石酸钾钠 d d 硝化反应 鞭毛排列 PPPPP G C 555354 5653 59 1 E guangdongense sp nov 2 E cloacae 3 E aerogense 4 E asburiae 5 E cloacae subsp dissolvens 6 E amnigenus biogroup 1 7 E amnigenus biogroup 2 90 100 阳性 76 89 阳性 90 100 阴性 76 89 阴性 d 26 75 阳性 P 周生鞭毛 peritrichous L 侧生鞭毛 lateral 3 10 促水稻生促水稻生长长作用作用 将新种菌株Ola50 Ola51接种水稻苗后 与未接菌的对照水稻苗 相比 接菌的水稻苗显著高于对照 图8 将水稻苗进行盆栽试验和大 田试验 可观察到接种Ola50 Ola51的稻株比施氮肥 对照 的稻株生 长状况良好 稻株生长更壮更绿且无徒长 图9 图10 收获后接种 Ola50 Ola51的稻株比施氮肥的稻株产量高5 稻粒饱满 新种菌株Ola50 Ola51促稻生长作用机理可能是内生固氮菌定殖 19 于植物体内部 在木质部导管进行固氮作用 这个部位不仅可满足细 菌生长和固氮所需的足够的能源 低氧分压以及交换代谢产物的微环 境 也避免了土壤中化合态氮对固氮酶活性的抑制及土著微生物的竞 争 固定的氮又可直接供给植物吸收 促进植物生长 也可能是内生 固氮菌分泌植物激素 如生长素 赤霉素和细胞分裂素等 以促进植物 根系吸收土壤中的水分和养分 并对植物体其它生命活动进行调控作 用 CKCKCKOla01 Ola01 Ola01CKCKCK Ola12 Ola12 Ola12 CKCKCKOla50 Ola50 Ola50 CKCKCK Ola51 Ola51 Ola51CKCKCKOla10 Ola10 Ola10CKCKCKOla12 Ola12 Ola12 图图 8 各菌株对水稻的促生长作用 CK 为未接种菌株的对照 Ola 50 Ola 50 图图 9 盆栽水稻接菌和不接菌内生固氮菌的效果 20 Ola 50 图图 10 田间水稻接菌和不接菌内生固氮菌的效果 参考文献参考文献 Adhikari T B Mew T W and Leach J E Genotypic and Pathotypic Diversity in Xanthomonas oryzae pv oryzae in Nepal J Phytopathology 1999 89 687 694 Baldani V L D Alvarez M A B Baldani J I Dobereiner J Establishment of inoculated Azospirillum spp in the rhizosphereand in roots of field grown wheat and sorghum J PlantSoil 1986 90 35 46 Baldani J I Caruso L Baldani V L D Goi S R and D bereiner J Recent advances in BNF with non legume plants J Soil Biology Biochemistry 1997 29 911 922 Chaintreuil C Giraud E Prin Y Lorquin J Ba A Gillis M de Lajudie P and Dreyfus B Photosynthetic bradyrhizobia are natural endophytes 21 of the African wild rice Oryza breviligulata J Appl Environ Microbiol 2000 66 5437 5447 Coombs J T Franco C M M Visualization of an endophytic Streptomyces species in wheat seed J Applied and Environmental Microbiology 2003 697 4260 4262 Cole R M Popkin T J Electron microscopy In Manual of Methods for General Bacteriology 1981 pp 34 51 Edited by P Gerhardt and others Washington DC American Society for Microbiology De Ley J Cattoir H and Reynaerts A The quantitative measurement of DNA hybridization from renaturation rates J Eur J Biochem 1970 12 133 42 Elbeltagy A Nishioka K Sato T Suzuki H Ye B Hamada T Isawa T Mitsui H and Minamisawa K Endophytic colonization and in planta nitrogen fixation by a Herbaspirillum sp isolated from wild rice species J Appl Environ Microbiol 2001 67 5285 5293 Hallmann J Qusdt Hallmann A Mahaffee W F et al Bacterial endophytes in agricultural crops J Canadian Journal of Microbiology 1997 43 10 895 914 Marmur J A procedure for the isolation of DNA from microorganisms J J Mol Biol 1961 3 171 173 Reinhold Hurek B and Hurek T Reassessment of the taxonomic structure of the diazotrophic genus Azoarcus sensu lato and description of three new genera and new species Azovibrio restrictus gen nov sp nov Azospira oryzae gen nov sp nov and Azonexus fungiphilus gen nov sp nov J Int J Syst Evol Microbiol 2000 50 649 659 Reiter B Pfeifer U Schwab H Sessitsch A Response of endophytic bacterial communities in potato plants to infection with Erwinia 22 carotovora subsp atroseptica J Applied and Environmental Microbio