6第六章 基因与载体连接.ppt

第六章基因与载体连接 一 黏性末端与平末端的连接二 其他连接方法 一 黏性末端与平末端的连接 一 黏性末端DNA分子间的连接 DNA连接酶把相互靠近的5 端磷酸与3 OH连到一起 1 两段DNA的连接 依靠粘性末端 依靠粘性末端 2 DNA片断与载体的连接 nick ligase 3 4 粘性末端的更换 在DNA片段上某一酶切口处换成另一种酶切口 二 平末端 bluntend 的连接 5 端与3 端并列靠近的时间太短 不容易被连接酶连接 1 直接连接 T4DNA连接酶虽然能连接平末端 但效率很低 只有粘性末端的1 5 5 5 5 3 3 3 3 OH OH P P P P HO HO 5 3 OH P P HO 5 3 1972年 斯坦福大学的P Labban和P Kaiser提出 1 同聚物加尾法 2 人工加尾形成 粘性末端 DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3 OH端加上脱氧核苷酸 原理 分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸 加尾 碱基互补 缺点 优点 能把任何片段连接起来 不能把插入片段再切下来 非酶切位点 5 突出的末端外源片段先用Klenow补平 然后用TdT补加polyC 载体片段也用Klenow补平 加polyG 退火不经连接即可转化 目的是 不使酶切位点遭受破坏 5 3 3 5 5 3 3 5 外源基因 载体 TdT ployC TdT ployG Klenow补3 平端 5 5 5 5 CCCCC CCCCC GGGGG GGGGG 退火 用T4DNA连接酶连到平端DNA上 然后再用酶切 形成一个人工粘性末端 2 衔接物 linker 连接 linker 用化学合成法合成的一段10 12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链 GGAATTCCCCTTAAGG EcoRIlinker linker的作用 缺点 1 可以用内切酶把插入片段切下来 如果插入片段内部也有该酶位点 不能切下完整的插入片段 2 能给载体连接上Polylinker 优点 3 DNA接头 adapter 连接法 1978年康内尔大学的吴瑞教授发明 5 p GATCCCGG OH3 GGCC p5 BamHIadapter 用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端 直接成为人工粘性末端 adapter 一头平末端 另一头粘性末端 某种酶切位点序列 adapter的作用 Blunt endedDNA 5 p GATCCCGG OH3 HO GGCC p5 BamHIadapter P P 5 p GATCCCGG GGCC CCGG GGCCCTAG P5 5 p GATCCCGG GGCC CCGGGGCCCTAG P5 CCGGGATCCCGG OHGGCCCTAGGGCC P5 接头自我连接 接头与接头会彼此以粘性末端接在一起 影响与DNA片段的连接 优点 连上后就能用 缺点 先用小牛肠碱性磷酸酶 CIP 处理接头 水解掉其5 端的磷酸 防止自我连接 以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸 防止自我连接 5 p GATCCCGG OHHO GGCC P P CCGG OHHO GGCCCTAG P5 CCGGGATCCCGG OHHO GGCCCTAGGGCC5 接头之间不能形成磷酸二酯键的自我连接 5 GATCCCGG OHHO GGCC5 5 CCGG OHHO GGCCCTAG5 CIP处理 OH HO Blunt endedDNA 5 p GATCCCGG OH3 HO GGCC p5 BamHIadapter P P 5 GATCCCGG HO GGCC CCGG OH GGCCCTAG5 5 GATCCCGG OH3 HO GGCC5 缺口 缺口 HO OH CIP处理 T4ligase 虽然有缺口 但仍然能与DNA片断连接 一 PCR产物的连接 1 在引物的5 端设计酶切位点 符合载体的多克隆位点 MCS 1 设计原则 避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复 二 其他连接方式 2 带酶切位点的引物结构 3 端15 20bp与模板互补 5 端6 10bp是某个内切酶的识别序列 5 端多余的3 5bp属保护碱基 引物1 GCAGAATTC 互补序列 模板 EcoRI位点 5 3 GCAGAATTC 互补序列 5 3 3 模板 GCAGAATTC 互补序列PCR产物 5 3 3 复性 延伸 模板 模板 3 3 GCTAGCCGG 互补序列 模板 BamHI位点 5 3 5 复性 延伸 模板 模板 3 3 GCTAGCCGG 互补序列 5 3 模板 5 GCTAGCCGG PCR产物互补序列 5 3 引物2 带酶切位点的PCR产物 GCAGAATTC PCR产物 5 3 GCTAGCCGG PCR产物 5 3 CGTCTTAAG CGATCGGCC EcoRI位点 BamHI位点 AATTC PCR产物 5 3 GCTAG PCR产物 5 3 G C EcoRI BamHI 两头各有一个粘性末端 2 与T载体直接连接 1 PCR产物两个3 端一般都有一个A TaqDNA聚合酶的特性 在DNA双链的3 端再加上一个多余的核苷酸 优先加A 2 T载体的两个3 端人为地各加一个T 利用TaqDNA聚合酶 当原料中只有dTTP时 被迫在平端载体上添加T A A dNTP T T dTTP TaqDNA聚合酶 载体 PCR产物 TA TA 二 DNA体外连接应注意的事项 插入片断与载体的酶切位点互补 相同的粘性末端才能有效地连接 尽量避免平端连接 决不能进行非粘性末端连接 1 用相同的酶切 2 用同尾酶切 BamHI BclI BglII Sau3AI XhoII 都产生GATC4个碱基的粘性末端 2 DNA插入的方向正确 1 用双酶切 由于产生的粘性末端不同 只能以固定方向连接 EcoRI BamHI EcoRI BamHI EcoRI BamHI 3 插入基因的开放阅读框 ORF 正确 1 DNA定向插入 2 起始密码 要注意载体上有ATG起始密码时 ATGGAATTC 载体 ATGCGGAATTCT 插入片断 EcoRI EcoRI ATGGAATTCT 重组 但移码突变 4 防止载体自身环化连接 1 提高插入片断的用量 连接反应体系中 插入片断比载体多10倍以上 2 用碱性磷酸酶处理载体 载体切口的5 磷酸被除去 不能自我连接 但可以与插入片断以单链连接 5 3 载体 插入片断 三 载