150-04微生物限度检查操作规程.doc

题 目：微生物限度检查操作规程 共 14 页 第 1 页文件编码：SX09SOP04150-04起草人： 日期： 年 月 日颁发部门：质量管理部审核人： 日期： 年 月 日制定原因： 新订 修订批准人： 日期： 年 月 日分发部门：质量管理部、质检中心 执行日期： 年 月 日微生物限度检查操作规程1 目的：建立微生物限度检查操作规程，以保证分析结果的准确性。2 依据：中华人民共和国药典2010年版3 适用范围：适应于药品微生物限度的检查。4 有关责任：微生物限度检查人员。5 微生物限度标准：项目剂型法定标准企业内控标准细菌数（cfu/g）霉菌、酵母菌数（cfu/g）大肠埃希菌细菌数（cfu/g）霉菌、酵母菌数（cfu/g）大肠埃希菌片剂1000100不得检出70070不得检出胶囊剂1000100不得检出70070不得检出药用辅料1000100不得检出70070不得检出内包材料1000100不得检出70070不得检出6 规程内容： 6.1 总则:6.1.1 抽样6.1.1.1 供试品一般按批号随机取不少于检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml，贵重药品、微量包装药品的检验量可酌减。6.1.1.2 抽样时，凡发现有可疑的样品，应选有疑问的样品，包装破损的样品不得作为供试品，凡已能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、长霉、虫蛀及变质的药品，可直接判为不合格，无需再抽样检验。6.1.2 供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，以防供试品中的污染菌题 目微生物限度检查操作规程共 14 页 第 2 页文件编码SX09SOP04150-04因保藏条件所引起致死、损伤或繁殖。6.1.2.2 供试品在检验之前，应该保持原有包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。6.1.3 检验:6.1.3.1 供试品检验项目按中国药典2010年版微生物限度检查法确定。6.1.3.2 检验的全过程，均应严格遵守无菌操作，严防再污染。6.1.3.3 除另有规定外，供试品制备成供试液后，应在均匀状态下取样。6.1.3.4 制成供试液后，应该在60分钟内注皿操作完毕。6.1.4 培养6.1.4.1 除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为3035，霉菌、酵母菌培养温度为2328。6.1.5 复检6.1.5.1 供试品检出控制菌时，按以一次检出结果为准，不再复试，但应保留检出菌株一个月备查。6.1.5.2 供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定时，应从同一批样品中随机抽样独立复试两次，以3次测定结果的平均值报告。6.1.6 检验报告6.1.6.1 检验报告以1g、1ml为单位。6.1.6.2 测定菌数报告，以每次测定结果全部平均值报告。6.1.6.3 控制菌按检验结果报告，如未检出控制菌时，报告为“按规定抽样检验结果未检出菌”，如抽样中任意一样品检出控制菌时，报告为“按规定抽样，检出菌，不符合药品微生物限度标准”。6.2 培养基及其制备方法6.2.1 营养琼脂培养基取营养琼脂培养基33g，加1000ml蒸馏水，搅拌加热煮沸至完全溶解，调PH7.20.2,分装，121高压灭菌15分钟。题 目微生物限度检查操作规程共 14 页 第 3 页文件编码SX09SOP04150-046.2.2 玫瑰红钠琼脂培养基取玫瑰红钠琼脂培养基30.5g，加1000ml蒸馏水，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装，121高压灭菌20分钟。6.2.3 胆盐乳糖培养基（BL）取胆盐乳糖培养基35.8g，加1000ml蒸馏水，搅拌加热煮沸至完全溶解，调PH7.40.2,分装，121高压灭菌20分钟。6.2.4 乳糖胆盐发酵培养基取胆盐乳糖培养基35.8g，加1000ml蒸馏水，搅拌加热煮沸至完全溶解，调PH7.40.2,加入0.04溴甲酚紫指示液25ml.根据用量的要求分装于含倒管的试管中. 121高压灭菌20分钟.6.2.5 MUG培养基取MUG培养基23.4g, 加1000ml蒸馏水，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装于试管中,115高压灭菌20分钟6.2.6 曙红亚甲蓝琼脂培养基取曙红亚甲蓝琼脂培养基42.5g, 加1000ml蒸馏水，搅拌加热煮沸至完全溶解，调PH7.20.2,分装，121高压灭菌15分钟。6.2.7 麦康凯琼脂培养基取麦康凯琼脂培养基40g, 加1000ml蒸馏水，搅拌加热煮沸至完全溶解, 调PH7.20.2,分装，121高压灭菌15分钟。6.3 试液6.3.1 2，3，5-氯化三苯四氮唑（TTC）试液。6.3.1.1 配制：取2，3，5-氯化三苯四氮唑0.1g加水溶解成10ml，灭菌，备用。6.3.1.2 用途：供制备培养基用。6.3.2 无菌对氨基苯甲酸试液题 目微生物限度检查操作规程共 14页 第 4 页文件编码SX09SOP04150-046.3.2.1 配制：取对氨基苯甲酸0.1g，加入含10ml水的具塞试管中，121灭菌20分钟。6.3.2.2 用途：供磺胺类药物检验用。6.3.3 氢氧化钾试液6.3.3.1 配制：取氢氧化钾40g，加水溶解使成100ml。6.3.3.2 用途：供作V-P反应试剂。6.3.4 -萘酚乙醇溶液6.3.4.1 配制：取-萘酚6.0g，加无水乙醇溶解使成100ml。6.3.4.2 用途：供作V-P反应试剂。6.3.5 靛基质试液6.4 稀释剂6.4.1 PH7.0无菌氯化钠蛋白胨水溶液取蛋白胨1g,氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，121灭菌20分钟。6.4.2 无菌磷酸盐缓冲液（pH6.8）取磷酸氢二钠25.8g与磷酸二氢钠4.4g，加水稀释至1000ml，121灭菌20分钟。6.5 指示液6.5.1 甲基红指示液取甲基红0.1g，加95%乙醇300ml，使溶解后，加水至500ml，即得。6.5.2 溴麝香草酚蓝指示液取溴麝香草酚蓝0.4g，加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解，再加水至100ml，变色范围6.07.6（黄蓝）6.6 供试品的检验量：6.6.1每批供试品检验量一般为10g 或10ml，化学膜剂为100cm2，贵重的或微量包装的供试品检验量可酌减，但口服药品不得少于3g，外用药品不得少于5g。6.6.2 供试品须取自2个以上的包装单位。6.7 供试液的制备6.7.1 液体供试品：取供试品10ml，加入稀释剂90ml，混匀， 作为供试液。6.7.2 固体供试品：取供试品10g，置PH7.0无菌氯化钠蛋白胨水溶液100ml中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀后，作为供试液。6.7.3 肠溶胶囊（片）供试品：取供试品10g，置含有无菌磷酸盐缓冲液（pH6.8）100ml的锥形瓶内，于45水浴中，保温，振摇，使溶解，作为供试液。6.7.4 含抑菌成分供试品的供试液制备方法：6.7.4.1 离心沉淀法：可溶性供试液：取供试液10ml，置于刻度离心管中，以3000转/分以上离心沉淀30分钟，用毛细管吸取上清液弃掉，留下管底约2ml残余液，将其全部洗入增菌培养基中，作控制菌检查。混悬供试液：取供试液 10ml，置刻度离心管中，先以500转/分离心沉淀5分钟，取其上清液移入另一离心管中，再经3000转/分以上离心沉淀30分钟，弃去上清液，保留约2ml残余液，全部洗入增菌培养基中，作控制菌检验。6.7.4.2 钝化剂中和法：磺胺类药物中和法：取规定量的供试液，加入含有无菌1%对氨基苯甲酸试液0.5ml的100ml增菌液中，作增菌培养即可。6.7.4.3 沉降法：取规定量的供试液，自然沉降5分钟，吸取上层液于含1%的氨基苯甲酸1ml的增菌液，作增菌培养即得。6.8 对照试验：6.8.1 阴性对照试验：检查测试检验全过程无菌技术的可靠性。用吸管从供用的稀释剂中吸取1ml于增菌液中，按控制菌检验方法检查，不得长菌。6.8.2 阳性对照试验：检查供试品是否对控制菌生长产生干扰作用及检查培养条件是否适宜。6.8.2.1 阳性对照试验：方法同供试品检验，于供试液中加入一定量的相应对照菌，作为平行试验。6.8.2.2 规定阳性对照菌：大肠埃希菌CMCC（B）441026.8.2.3 对照菌的加入量为50-100个，可事先预先确定细菌菌常用计数方法，取361培养1820小时的新鲜肉汤培养物，10倍递增稀释至10-6，取其0.1ml于营养琼脂平板表面涂抹或取10-7稀释液1ml以注皿法进行菌数测定。6.8.2.4 当供试品未检出控制菌时，而阳性对照试验也未能检出，不能做出供试品未检出控制菌的结论。6.8.2.5 阳性对照试验操作必须与供试品检验操作严格分开，避免交叉污染。6.9 检查法：6.9.1 检查前的准备：6.9.1.1 用具的洗涤与灭菌。6.9.1.1.1 试管：使用过的试管经消毒后，将培养基倒出，用清洁液洗刷，用水冲洗4-5次，倒立，晾干备用。灭菌前，用棉塞塞上管口，牛皮纸包紧。6.9.1.1.2 吸管：使用过的吸管用清洁液浸泡数分钟后，用水冲洗4-5次，晾干，备用。灭菌前，在吸管上端距0.5cm处塞入约2cm左右的适当疏松棉花，置不锈钢桶。6.9.1.1.3 研钵：使用过的研钵用清洁液洗刷后，用水冲洗数次，晾干备用。灭菌前，用牛皮纸将钵体和锤包裹。6.9.1.1.4 培养皿：使用过的培养皿经消毒后，将培养基倒出，用清洁液洗刷，用水冲洗4-5次，倒立、晾干备用。灭菌前，将培养皿置不锈钢桶内，进行灭菌。6.9.1.1.5 将上述包好的用具，放在121的热压蒸汽消毒器中，灭菌30min后，放入微生物检测室定点位置，备用。6.9.1.2 将所有已灭菌的培养皿、三角瓶、吸管（1ml、10ml）、稀释剂及供试品等移至微生物检测室内。每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入操作间。将全部包装（牛皮纸）去掉，编号。6.9.1.3 开启微生物检测室空气过滤装置并使其工作30min。6.9.1.4 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外线杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋，再用0.1%新洁尔灭或用75%乙醇棉球擦手，待干后，穿戴无菌衣、帽、口罩。6.9.1.5 操作前先用75%乙醇棉球擦手，并擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口周围，待干后将供试品瓶、盒、袋启封，启封后先检查瓶盖内侧及瓶口周围有无生霉、长螨的迹象，对肉眼可见变质者，若经证实为生霉、长螨即可判定为不合格，无须继续检验。6.9.2 细菌、霉菌、酵母菌计数。6.9.2.1 检验程序： 供试品1:10供试液1:100供试液1:1000供试液注皿培养菌落计数报告 6.9.2.2 操作步骤：(细菌、霉菌)6.9.2.2.1 供试液制备：经阴性对照取样后，按各类制剂制备供试液的方法（见供试液的制备）制备。6.9.2.2.2 稀释及取样稀释：取1ml 吸管1支，吸取混匀的1:10供试液1ml，在离稀释剂液面上约1cm处，测管壁注入装有9ml的稀释剂的的试管中，混匀成1:100的稀释液，同法操作得到1:1000的稀释液吸样：用上述吸管分别取1:10、1:100、1:1000的供试液各1ml,注入23个平皿中.6.9.2.2.3 注皿与干燥事先将培养基融化，置45水浴中，备用，当供试液及各稀释液均注入平皿后，以上述培养基倾注入平皿，每平皿约1520ml，转动平皿，使样液与培养基混匀后，置水平台上待凝。培养基凝固后，在净化条件下开盖倒置或换灭菌的陶瓦盖，使平板干燥，减少平板表面的水分，防止菌落蔓延生长，干燥时间一般在3h左右，干燥时间计入培养时限。6.9.2.2.4 培养：将上述平板倒置于适宜温度的培养箱中，培养。细菌于3035培养3天，霉菌于2328培养5天,必要时可延长至7天. 6.9.2.3 菌落计数：6.9.2.3.1 用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用5-10倍放大镜检查，是否遗漏。6.9.2.3.2 菌数报告规则细菌,酵母菌一般宜选取平均菌落数小于300cfu，作为菌数计算的依据，霉菌宜选取平均菌落数小于100cfu,作为菌数计算的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1g,1ml或10cm供试品中所含的菌数如各稀释级的平板均无菌落生长,或仅最低稀释级的平板有菌落生长,但平均菌落数小于1时,以1乘以最低稀释倍数的值报告菌数.6.9.3.1 操作步骤(大肠埃希菌)6.9.3.1.1 取胆盐乳糖培养基3份，每份100ml，2份分别加入规定量的供试液，1份为供试品,其中1份加入对照菌50100个作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。培养1824小时（必要可延至48小时）。阴性对照应无菌生长。取上述3份的培养物各0.2ml，分别接种至5ml MUG培养基管内培养，分别于5小时与24小时，取未接种的MUG培养基管作本底对照，将各管置365nm紫外光下观察。阳性对照管呈现荧光，MUG阳性。阳性；无荧光，MUG阴性。然后加数滴靛基质试液于MUG管内，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。当阴性管呈阴性，阳性对照正常生长，供试液胆盐乳糖培养基培养液澄明，并证明无菌生长，判未检出大肠埃希菌。供试液MUG阳性，靛基质阳性，判检出大肠埃希菌；MUG阴性，靛基质阴性，判未检出大肠埃希菌。6.9.3.1.2 如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，均应从取供试液胆盐乳糖培养基培养物划线于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基，培养1824小时，如上述供试液培养物的分离平板无菌落生长，判未检出大肠埃希菌。或有菌落生长，菌落形态的特征与下表不符, 判未检出大肠埃希菌,若平板上生长的菌落与下表菌落形态特征相似或疑似,应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的鉴定试验,确认是否为大肠埃希菌大肠埃希菌菌落形态特征培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心,圆形,稍凸起,边缘整齐,表面光滑,湿润,常有金属光泽.麦康凯琼脂鲜桃红色或微红色,菌落中心呈深桃色,圆形,扁形, 边缘整齐,表面光滑,湿润6.9.3.2 操作步骤(大肠菌群)取含适量(不少于10ml)的乳糖胆盐发酵培养基管3支,分别加入1:10的供试液1ml、1:10的供试液1ml、1:100的供试液1ml,另取一支乳糖胆盐发酵培养基加入稀释液1ml作为阴性对照管,培养1824小时.乳糖胆盐发酵培养基管若无菌生长或有菌生长但不产酸产气, 判未检出大肠菌群,若产酸产气,应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基, 培养1824小时.若平板上无菌落生长,或生长的菌落与下表的菌落形态特征不符或非革兰阴性无芽孢杆菌, 判未检出大肠菌群,若