基础学习实验食管癌细胞系总蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定ppt课件.ppt

1 食管癌细胞系及总蛋白提取总蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析鉴定食管正常细胞与食管癌细胞的差异蛋白鉴定 综合性设计性实验 2 2 食管癌是我国常见的恶性肿瘤在消化道恶性肿瘤中仅次于胃癌发生于食管粘膜上皮绝大多数为鳞癌 小部分为腺癌 3 中国是食管癌死亡率最高的国家 在六大食管癌高发区中 只有潮汕高发区地处中国南部和沿海地理位置 其中 又以南澳县最高 食管癌粗死亡率在100 10万以上 其次为揭阳和饶平地区 与中国其它食管癌高发地区相比较 该地区在地理位置 气候条件 居民的生活习惯等方面均有明显不同 4 食管癌细胞系及总蛋白提取 5 细胞系 cellline 原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体 也指可长期连续传代的培养细胞 肿瘤细胞系多由癌瘤建成 多呈类上皮型细胞 常已传几十代或百代以上 并具有不死性和异体接种致瘤性 已在细胞遗传学 分子遗传学和生物医学等方面得到越来越广泛的应用 其已被用于基因定位 检测理化因素的毒性和细胞因子活性 生产单克隆抗体 制备组织工程化人工器官和转基因动物等方面 更是研究发育生物学 肿瘤发生学 肿瘤治疗等不可或缺的材料 6 7 细胞系名称特点EC109中国男性食管鳞癌细胞EC9706中国男性65岁病理诊断为食管蕈伞型高分化鳞癌细胞TE3日本男性48岁起源于高分化食管鳞癌转移至右胸壁细胞KYSE150日本女性49岁低分化食管鳞癌细胞KYSE180日本男性53岁高分化食管鳞癌细胞KYSE510日本男性67岁在顺铂药物治疗与放射治疗后高分化的食管鳞癌细胞HeLa美国女性子宫颈癌细胞系SHEEC汕头大学医学院建立的食管癌细胞系 8 癌细胞生长特性 无限增殖在适宜条件下 癌细胞能无限增殖 成为 不死 的永生细胞 正常细胞都具有一定的最高分裂次数 如人的细胞一生只能分裂50 60次 然而癌细胞却失去了最高分裂次数 如在1951年由一位黑人妇女 名叫HenriettaLacks 的宫颈癌细胞分离建立的HeLa细胞系 至今仍在世界许多实验室中广泛传代使用 接触抑制现象丧失正常细胞生长相互接触后 其运动和分裂活动都要停顿下来 在体外培养条件下则表现为细胞贴壁生长汇合成单层后即停止生长 癌细胞则不同 其分裂和增殖并不因细胞相互接触而终止 在体外培养时细胞可堆累成立体细胞群 故癌细胞接触对癌细胞的增殖无抑制作用 癌细胞间粘着性减弱癌细胞与其同源正常组织相比 细胞间的粘着性降低 故癌细胞在体内容易分散和转移 癌细胞的纤连粘蛋白显著减少或缺失 钙粘蛋白合成发生障碍 从而破坏了细胞与基质之间和细胞与细胞之间的粘着 因此癌细胞具有易于侵润组织和转移的属性 9 易于被凝集素凝集癌细胞凝集性增强是由于质膜结构发生深刻变化所致 糖蛋白在质膜中的运动性增强 因而凝集素更容易将其受体 糖蛋白 簇集 形成更多的横桥 质膜糖蛋白运动性增强还可能是由于与其相连的微丝受到破坏所致 粘壁性下降葡糖胺聚糖是构成细胞外基质的主要成分 可形成水合凝胶 癌细胞合成葡糖胺聚糖减少 导致细胞粘壁性能下降 细胞骨架结构紊乱癌细胞中微管变短 排列紊乱 微丝亦发生结构异常 肌动蛋白丝的量减少 引起质膜流动性增强 细胞属性发生改变 由于细胞骨架结构紊乱 导致细胞外形亦发生改变 例如培养中的正常成纤维细胞呈扁平梭形 但被鸟类肉瘤病毒 含src癌基因 转化后 则变成球形 表面出现小泡 此即由于细胞骨架成分紊乱所致 10 食管癌细胞系Ec109 11 食管癌细胞系EC9706 12 食管癌细胞系KYSE150 13 食管癌细胞系KYSE180 14 准备凝胶电泳的样品 需要对细胞和组织进行裂解以释放目的蛋白 这些可溶性蛋白能够穿过分离胶单独移动 细胞总蛋白的来源 细胞总蛋白的来源 15 蛋白样本制备的原则 蛋白样本制备原则 方法应具备标准化 具有重现性 可靠性 简便性 尽量抽提完全 应使所有蛋白全部处于溶解状态 防止发生蛋白的降解 聚集 沉淀 变性 防止在抽提过程中发生化学修饰 如做2D则需去除高丰度蛋白或无关蛋白 必要时去除样品中的核酸和某些干扰蛋白 16 学习SDS PAGE测定蛋白质分子量的原理掌握垂直板电泳的操作方法了解蛋白印迹技术原理和方法 实验目的 第二部分 食管癌细胞系总蛋白的SDS PAGE电泳分离 17 带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动 这种现象称为电泳 电泳使用不同的支持介质 早期有滤纸 玻璃珠 淀粉粒 纤维素粉 海砂 海绵 聚氯乙烯树脂 以后有淀粉凝胶 琼脂凝胶 醋酸纤维素膜 现在则多用聚丙烯酰胺 PAGE 和琼脂糖凝胶 电泳的概念和分类 18 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺 acrylamide 简称Acr 和交联剂N N 甲叉双丙烯酰胺 N N methylene bisacylamide 简称Bis 在加速剂N N N N 四甲基乙二胺 N N N N tetramethylethylenediamine 简称TEMED 和催化剂过硫酸铵 ammoniumpersulfate NH4 2S2O8 简称AP 或核黄素 ribofavin即vitaminB2 C17H20O6N4 的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶 以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacrylamidegelelectrophoresis 简称PAGE 19 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种因素 蛋白大小 形状和电荷 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳 是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS 十二烷基硫酸钠 1967年 Shapiro等人首先发现 如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠 SDS 则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小 SDS PAGE的原理 SDS的分子式 20 SDS是一种阴离子去垢剂 SO32 带负电荷 因此蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与SDS分子结合时 可形成SDS 蛋白质复合物 这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS 好比蛋白质穿上带负电的 外衣 蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了 从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用 SDS能断裂分子内和分子间氢键 破坏蛋白质的二级和三级结构 强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂 使蛋白复合物分解成多个亚基 因此在电泳时 蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质 亚基 分子大小 使聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应 SDS的作用 21 当分子量在15KD到200KD之间时 蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系 符合下式 logMW K bX式中 MW为分子量 X为迁移率 k b均为常数 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图 可获得一条标准曲线 未知蛋白质在相同条件下进行电泳 根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量 有许多蛋白质是由亚基 如血红蛋白 或两条以上肽链 如胰凝乳蛋白酶 组成的 它们在SDS和巯基乙醇作用下 解离成亚基或单条肽链 因此这一类蛋白质 测定时只是它们的亚基或单条肽链的分子量 22 被分离物质分子量与凝胶浓度的选择 23 按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连续系统和不连续系统两大类 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同 带电颗粒在电场作用下 主要靠电荷和分子筛效应分离 不连续系统中由于缓冲液离子成分 pH 凝胶浓度以及电位梯度的不连续性 带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应 分子筛效应 还具有浓缩效应 因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分类 24 不连续体系由电极缓冲液 浓缩胶及分离胶所组成 浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶 凝胶缓冲液为pH6 7的Tris HC1 分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶 凝胶缓冲液为pH8 9Tris HC1 电极缓冲液是pH8 3Tris 甘氨酸缓冲液 2种孔径的凝胶 2种缓冲体系 3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径 pH值 缓冲液离子成分的不连续性 这是样品浓缩的主要因素 不连续系统的特点 25 浓缩胶的作用 浓缩胶的作用是有堆积作用 凝胶浓度较小 孔径较大 把较稀的样品加在浓缩胶上 经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带 当样品液和浓缩胶选Tris HCL缓冲液 电级液选Tris 甘氨酸 电泳开始后 HCL解离成氯离子 甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子 蛋白质带负电荷 因此一起向正极移动 其中氯离子最快 甘氨酸根离子最慢 蛋白居中 电泳开始时氯离子泳动率最大 超过蛋白 因此在后面形成低电导区 而电场强度与低电导区成反比 因而产生较高的电场强度 使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动 形成以稳定的界面 使蛋白聚集在移动界面附近 浓缩成一中间层 26 27 蛋白质印迹法又称为免疫印迹法 这是一种用抗原抗体的特异性结合来检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法 蛋白质印迹 westernblotting 的概念 28 将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素 PVDF膜上 然后与能特异性识别待检测蛋白的一抗 针对待测分子的单克隆抗体或多克隆抗体 进行反应 洗涤去除没有结合的特异性抗体后 加入二抗 针对一抗的抗体 标记有放射性同位素或生物素 反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体 加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等 观察有无特异性蛋白条带的出现 也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量 蛋白印迹基本步骤 29 固体相上的蛋白质针对蛋白质的特异性抗体 称为一抗带上辣根过氧化物酶针对一抗的抗体 称为二抗加入底物 在酶的作用下 分解产生荧光 30 垂直电泳系统 31 蛋白转膜系统 32 转膜系统各组件及其位置 33 将玻璃板用蒸馏水洗净晾干 准备2个干净的小烧杯 把玻璃板在灌胶支架上固定好 放好密封条和隔离板 固定玻璃板时 两边用力一定要均匀 防止夹坏玻璃板 按照下表配制12 分离胶与4 浓缩胶 样品的制备 样品和标准蛋白分别与5倍上样缓冲液按5 1的比例混匀 并在100度沸水浴中煮5min 取出待用 SDS PAGE凝胶的制作 34 凝胶的成分 聚丙烯酰胺具有神经毒性 操作时要戴手套 35 按比例配好分离胶 用移液管快速加入 大约5厘米左右 之后加少许蒸馏水 或异丙醇除泡 静置至胶凝固 凝胶配制过程要迅速 催化剂TEMED要在注胶前再加入 否则凝结无法注胶 注胶过程最好一次性完成 避免产生气泡 水封的目的 保持分离胶上沿平直 排气泡 胶凝好的标志 胶与水层之间形成清晰的界面 倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干 按比例配好浓缩胶 连续平稳加入缩胶至离边缘5mm处 迅速插入梳子 静置到胶凝固 梳子需一次平稳插入 梳口处不得有气泡 梳底需水平 36 拔出样梳后 拆掉密封条 在内槽中加入缓冲液 上样 marker5 l样品20 l 5 上样buffer5 l共25 l上样时要记清上样的顺序微量注射器不可过低 以防刺破胶体 也不可过高 样品下沉时易发生扩散 溢出加样孔 37 接通电源 100V恒压电泳 至溴酚蓝距凝胶边缘约0 5 1cm时 约2 5h 停止电泳 凝胶的处理 剥离与染色 电泳结束后 撬开玻璃板 剥胶时要小心 保持分离胶完好无损 将分离胶做好标记后放在大培养皿内 加入考马斯亮蓝染色染色液 染色约4h 染色后的凝胶板用脱色