DNA重组技术的基本工具.ppt

专题1基因工程 第一节DNA重组技术的基本操作工具 基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 早期基础理论 达尔文提出生物进化论 基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 早期基础理论 孟德尔提出基因的分离定律和自由组合定律 基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 早期基础理论 摩尔根证明基因在染色体上 并提出基因的连锁互换定律 基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 后期基础理论 艾弗里证明DNA是遗传物质 DNA可从一种生物个体转移到另一种生物个体 基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 后期基础理论 沃森 克里克 提出DNA的双螺旋结构模型 基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 后期基础理论 梅塞尔松 斯塔尔证明DNA的半保留复制 基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 后期基础理论 克里克等提出中心法则 基础理论和技术发展催生了基因工程 科技探索之路 后期基础理论 1963年尼伦伯格和马太破译编码氨基酸的遗传密码 1966年霍拉纳用实验加以证明 青霉菌产生青霉素根瘤菌固氮家蚕吐丝 因为它们具有控制产生这些性状的基因 为什么以上生物会有这些特殊性状 我们可不可以通过科学手段 使本身没有某个性状的生物具有某个性状 通过基因工程 定向改造生物的新技术 思考 什么是基因工程 基因工程 又叫DNA重组技术 是指按照人们的愿望 在DNA分子水平上进行严格的设计 并通过体外DNA重组和转基因技术 赋予生物以新的遗传特性 从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品 基因工程培育抗虫棉的简要过程 在以上过程中关键步骤或难点是什么 普通棉花 无抗虫特性 苏云金芽孢杆菌 提取 抗虫基因 导入 转基因棉花含抗虫基因 转基因棉花产生伴胞晶体 转基因棉花有抗虫特性 伴胞晶体 杀虫 载体 基因工程培育抗虫棉的关键步骤 关键步骤一 抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来 关键步骤二 抗虫基因与棉花DNA 缝合 关键步骤三 抗虫基因进入棉花细胞 怎样解决这些关键步骤 关键步骤一 抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来 关键步骤二 抗虫基因与棉花DNA 缝合 关键步骤三 抗虫基因进入棉花细胞 分子手术刀 限制性核酸内切酶 分子缝合针 DNA连接酶 分子运输车 基因进入受体细胞的载体 分子手术刀 限制性核酸内切酶 分子缝合针 DNA连接酶 分子运输车 基因进入受体细胞的载体 一 DNA重组技术的基本工具 一 限制性核酸内切酶 分子手术刀 来源 主要从原核生物中分离纯化出来 种类 已从近300种微生物中分离出4000种限制酶 作用 1 能识别双链DNA的某种特定核苷酸序列2 使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开 磷酸二酯键 一个核苷酸核糖上第3位的羟基与下一个核苷酸核糖上第5位的磷酸羟基脱水缩合成酯键 该酯键称3 5磷酸二酯键 特异性 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 并且能在特定的切点上切割DNA分子 作用特点 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成少数的识别序列由4 5或8个核苷酸组成 限制酶的识别序列 一 限制性核酸内切酶 分子手术刀 限制酶的识别序列 限制酶所识别的序列 无论是6个碱基还是4个碱基 都可以找到一条中心轴线 如图 中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向 对称 重复排列的 回文序列 具有反向重复的DNA序列 通常是DNA结合蛋白的识别部位 也是限制性核酸内切酶识别位点的序列特征 想一想限制酶所识别的序列有什么特点 EcoRI限制酶的切割 中轴线 黏性末端 黏性末端 在G与A之间切割 大肠杆菌的一种限制酶 EcoR 只能识别GAATTC序列 并在G和A之间切开 中轴线 SmaI限制酶的切割 平末端 平末端 只能识别CCCGGG序列 并在C和G之间切开 产生黏性末端或平末端 限制酶的作用结果 寻根问底 你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗 原核生物易受自然界外源DNA的入侵 但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制 以防止外来病原物的侵害 限制酶就是细菌的一种防御性工具 当外源DNA侵入时 会利用限制酶将外源DNA切割掉 以保证自身的安全 所以 限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA 使之失效 从而达到保护自身的目的 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口 可产生几个黏性 平 末端 要切两个切口 产生四个黏性 平 末端 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割 会怎样呢 会产生相同的黏性 平 末端 然后让两者的黏性 平 末端黏合起来 就似乎可以合成重组的DNA分子了 思考 二 分子缝合针 DNA连接酶 作用 作用原理 催化磷酸二酯键形成 把切下来的DNA片段拼接成新的DNA 即将脱氧核糖和磷酸连接起来 分子手术刀 限制性核酸内切酶 二 分子缝合针 DNA连接酶 类型 E coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 来源 功能 大肠杆菌 T4噬菌体 恢复磷酸二酯键 只能连接黏性末端 能连接黏性末端和平末端 效率较低 相同点 差别 二 分子缝合针 DNA连接酶 寻根问底 DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗 为什么 1 只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上 形成磷酸二酯键 形成磷酸二酯键 1 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 2 以一条DNA链为模板 将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链 2 将DNA双链上的两个缺口同时连接起来 不需要模板 将外源基因送入受体细胞 三 基因进入受体细胞的载体 分子运输车 载体的作用 质粒 噬菌体的衍生物动植物病毒等 载体的种类 质粒 裸露的 结构简单的 独立于细菌染色体 即拟核DNA 之外 并具有自我复制能力的双链环状DNA分子 三 基因进入受体细胞的载体 分子运输车 作为载体的必要条件 有切割位点 供外源DNA片段 基因 插入 能自我复制 获得更多目的基因有遗传标记基因 供重组DNA的鉴定和选择 载体DNA必需是安全的 不会对受体细胞有害 或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去 载体DNA分子大小应适合 以便提取和在体外进行操作 太大就不便操作 质粒 能复制并带着插入的目的基因一起复制 有切割位点 有标记基因的存在 可用含氨苄青霉素的培养基鉴别 三 基因进入受体细胞的载体 分子运输车 1 不属于质粒被选为基因载体的理由是 A 能复制B 有多个限制酶切点C 具有标记基因D 它是环状DNA D 练习 2 有关基因工程的叙述中 正确的是 A 所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列B 质粒是基因工程中唯一的载体C 载体必须具备的条件之一是 具有多个限制酶切点 以便与目的基因连接D DNA连接酶使黏性末端的碱基之间形成氢键 C 练习 已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因 现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么 请设计实验 预期实验结果 并得出相应的实验结论 对照组 不添加抗生素 实验组1 添加一定浓度的四环素 实验组2 添加一定浓度的氨苄青霉素 实验组3 添加一定浓度的四环素和氨苄青霉素 练习 既含有抗四环素基因也含有抗氨苄青霉素基因 只含有抗四环素基因 只含有抗氨苄青霉素基因 既不含有抗四环素基因也不含有抗氨苄青霉素基因 思考与探究P7 2 为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA 通过长期的进化 细菌中含有某种限制酶的细胞 其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列 或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上 使限制酶不能将其切开 这样 尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断 并且可以防止外源DNA的入侵 3 天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗 为什么 提示 基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒 plasmid 即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制 双链闭环的裸露的DNA分子 是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢 不是 作为基因工程使用的载体必需满足以下条件 思考与探究P7 1 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点 以便目的基因可以插入到载体上去 这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置 还必须是在质粒本身需要的基因片段之外 这样才不至于因目的基因的插入而失活 2 载体DNA必需具备自我复制的能力 或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制 3 载体DNA必需带有标记基因 以便重组后进行重组子的筛选 4 载体DNA必需是安全的 不会对受体细胞有害 或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去 5 载体DNA分子大小应适合 以便提取和在体外进行操作 太大就不便操作 实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件 都要进行人工改造后才能用于基因工程操作 4 DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗 迄今为止 所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力 至于原因 现在还不清楚 也许将来会发现可以连接单链DNA的酶 思考与探究P7 什么是内含子和外显子 原核细胞基因的编码区是连续的 真核细胞基因的编码区是间隔的 不连续的 真核生物基因的结构特点是 编码区是间隔的 不连续的 也就是说 能够编码蛋白质的序列被不能编码蛋白质的序列分隔开来 成为一种断裂的形式 其中 能够编码蛋白质的序列叫外显子 不能编码蛋白质的序列叫内含子 真核基因包括编码区和非编码区 编码区又分为外显子和内含子 内含子不翻译蛋白质 知识拓展 什么是内含子和外显子 在遗传学上通常将能编码蛋白质的基因称为结构基因 真核生物的结构基因是断裂的基因 一个断裂基因能够含有若干段编码序列 这些可以编码的序列称为外显子 在两个外显子之间被一段不编码的间隔序列隔开 这些间隔序列称为内含子 内含子 Interveningregion 是一个基因中非编码DNA片断 它分开相邻的外显子 更精确的定义是 内含子是阻断基因线性表达的序列 DNA上的内含子会被转录到前体RNA中