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T-DNA插入突变体在水稻功能基因组研究中的应用关键词： T-DNA 插入突变体 水稻功能基因组 研究 悠 游基因组（Genome）指一个物种的全套染色体和基因。随着模式生物基因组计划和人类基因组计划（HGP）的提出和实施，1986年Thomas Roderick提出了基因组学（Genomics）的概念，其内容主要是指基因组作图（Mapping）和测序（Sequencing）。基因组研究着重于探索基因组的结构、基因的结构和功能以及物种的进化。近年来，人们倾向于将基因组学分为结构基因组学（Structural genomics）和功能基因组学（Functional genomics）两大部分。结构基因组学的最终目标除弄清基因的全部序列，建立高精度的遗传、物理图谱和转录图谱，还包括大规模蛋白质构型的研究。功能基因组学研究的基本策略是将基因和蛋白质的研究从单个的研究扩展到以系统的方式对生物体内所有基因和蛋白质进行研究，利用结构基因组学所积累的数据，从中得到有价值的信息，阐述DNA序列的功能（张祖新等，2003）。1 突变体在水稻功能基因组研究中的作用1.1 水稻功能基因组研究 全基因组测序是当今生物科学研究发展的必然，是后基因组研究的重要基础。水稻因其基因组较小，遗传背景清晰，与其它禾本科植物存在广泛的共线性，遗传转化体系完善，EST/cDNA数据库丰富及其重要的经济价值而成为禾本科植物基因组研究的模式生物。由日本等十余个国家参与的国际水稻基因组测序计划（International rice genome sequencing project，IRGSP） 是大规模测定水稻基因组序列的国际组织，旨在完成水稻的精确序列图。美国Monsanto公司于2000年4月6日率先完成粳稻全基因组工作框架图，草图数据只提供给IRGSP和有条件登记的科研人员。Syngenta公司于2001年1月26日宣布已完成粳稻全基因组工作框架图，草图数据可在其网站有条件登记使用，Sygenta公司用6倍于水稻基因组的序列接成覆盖率为93%的序列草图，粗略预测“日本晴”基因组含有32000至50000个基因（Golff等，2002）。我国学者于2001年独立完成了籼稻全基因组工作框架图（Yu等，2001），其草图数据已在GenBank中登记注册，并于2002年在Science上发表了有关水稻全基因组工作框架图的构建工作，籼稻品种“93-11”基因组大小为466Mb，预测含有46022至55612个基因（Yu等，2002a）。2002年12月18日，IRGSP宣布已完成以PAC/BAC克隆为基础的水稻基因组全序列的测序工作。另外，45000个水稻EST序列已测序并于2001年释放到公用互联网数据库，但只有其中的25%可找到已知基因的同源序列，大部分基因的功能还有待鉴定；到2005年11月11日止，释放到NCBI数据库的水稻EST序列已达406790条（/dbEST/dbEST _summary.html）1.2 突变体在水稻功能基因组研究中的应用通过与已知基因序列（包括核苷酸序列、mRNA序列和蛋白质序列）的同源性比较可以预测许多未知基因的假定功能， 也可能通过它们在染色体上的位置进行预测。然而，要精确了解每个基因的功能及基因间的互作功能，必须分析单个基因和多个基因的突变表型以及它们的时空表达剖面。随着新技术新方法的不断创新开发，分析鉴定基因功能的方法越来越多，并逐渐形成功能基因组学的分支学科，如比较基因组学（comparative genomics）、转录基因组学（transcriptomics）、蛋白质组学（proteomics）、代谢基因组学（metabolomics）和表型基因组学（phenomies）等。但分离鉴定基因功能的最直接最有效的方法是构建饱和的基因突变群体，通过突变体分析鉴定基因功能。因此突变群体的构建是功能基因组学的基础（江树业，2003）。物理诱变、化学诱变、同源重组、基因沉默以及插入突变等方法都可以用来构建突变体库，但每种方法都有各自的优缺点。物理、化学诱变比较容易得到饱和突变体库，但突变基因的克隆要用较复杂的图位克隆法，难以在获得全基因组测序信息的基础上进行基因功能的研究。同源重组是酵母和鼠类中用得比较成功的一种方法，但植物中同源重组率比较低。2 T-DNA插入突变体在水稻功能基因组研究中的应用插入突变（insertional mutagenesis）是一种基于外源DNA插入基因内部导致其失活的基因功能研究方法。全基因组插入突变源包括植物转座子和农杆菌T-DNA。用于创造植物突变体库的转座子主要有玉米Ac/Ds, En/Spm及Mu转座子等，由于转座子具有转座特性，因此建立含转座子插入的突变体库较容易，但具有插入热点和区域优先特性，且可能发生再次转座。农杆菌T-DNA插入到植物基因组的位点被认为是随机的。随着农杆菌介导的水稻转基因技术的不断完善，T-DNA方法已成为快速构建插入突变库的主要方法。通过转基因的办法创造大量的T-DNA独立转化子可以建立T-DNA突变体库，能方便地进行正向和反向遗传学的研究。从正向遗传学来看，可以在突变体群体中筛选到感兴趣的表型，根据已知的T-DNA及转座子的序列，采用反向PCR，Tail-PCR和质粒拯救等办法来分离插入位点侧翼的植物基因组序列，通过检索基因组数据库来找到相应的突变基因。另外，根据某一感兴趣基因的保守区域设计引物，在转座子或T-DNA边界设计另一侧引物，采用Pool-PCR的方法来筛选突变体库，可以寻找到该未知功能基因的突变体，从而广泛地开展反向遗传学研究。2.1 T-DNA插入突变库的载体改造最初的T-DNA插入突变载体，是左右边界内只包含一个选择标记基因的载体。在用这类载体建立的突变体库中，能得到部分基因功能缺失的突变体，但不能得到有功能冗余及致死效应的基因的突变体，也很难研究具有高度多效性的基因。为了弥补这方面的不足，构建出了新的载体，即gene trap载体和激活标签载体。Gene trap载体通过插入的报告基因的表达来研究被插入基因的表达模式，而且对致死基因也可以在杂合状态下进行研究。激活标签载体，可以产生获得功能性的突变体，能够研究存在功能冗余或具有高度多效性以及致死效应的基因的功能（阎双勇等，2004）。2.2 水稻T-DNA插入突变库的构建由于水稻粳稻品种已建立了完善的转化体系，建立水稻大规模T-DNA插入突变体库己成为可能，目前粳稻品种“Dong Jin”己建立了T-DNA插入突变体库。已经筛选出30000个T-DNA插入突变体；Southern杂交和PCR分析表明，大约65%的插入突变体包含一个以上的T-DNA。潮霉素抗性分析表明平均每个插入突变体包含1.4个T-DNA插入；同时发现不少形态学突变，如矮秆突变（7%）、叶色突变（9.5%）、斑点叶（1%）和叶型突变（1.2%）（Jeon等，2000；2001）。Yu等（2002b）等获得了6000株含T-DNA的转基因植株，其中有60%的植株只含单拷贝T-DNA，侧翼序列分析表明，T-DNA已插入到多条染色体上，还发现了一些白化苗、矮秆和雄性不育等突变性状。Wu等（2003）采用带有GAL4/VP16-UAS的enhancer trap系统构建T-DNA突变体库，得到了31443个独立的转化株。PCR检验和DNA杂交分析表明94%转化株含有T-DNA插入，42的转化株只含单拷贝T-DNA。对1000个T0代植株进行组织化学检测表明报告基因GUS呈不同的表达模式，有的只在一个组织中表达，有的在多个组织中表达，有的在所有组织中均表达。T1代家系与相应T0代植株中报告基因呈相同的表达模式。GUS染色结果表明，大多数家系内GUS基因表达的分离比例符合孟德尔3: 1分离比。在田间种植的2679个T1代家系中有7.5%有显著的形态突变，超过1/3的家系符合3：1的分离比。2.3 运用T-DNA插入突变体研究水稻功能基因组的进展Jung等（2003）筛选叶绿素缺陷的T-DNA突变体，发现其中一个突变体T-DNA插入的基因与大麦中XANTHA-F和拟南芥中CHLH同源，进一步研究表明，该基因编码叶绿素的四吡咯生物合成途径中的一个关键酶的大亚基。这是T-DNA突变体用于水稻基因功能分析的第一次报道。 赤霉素20氧化酶（GA20ox）是赤霉素生物合成倒数第二步的关键酶。水稻中OsGA20ox2作为“绿色革命基因”而闻名，但另一个赤霉素20氧化酶基因，OsGA20ox1，由于没有找到合适的突变体使得它对植物高度的贡献不甚了解，Oikawa等（2004）找到了一个具有高，赤霉素过量表型的T-DNA（含有三个CaMV35S启动子）插入突变体，含有三个CaMV35S启动子T-DNA插在了OsGA20ox1开放阅读框的上游，突变体节间长度约是野生型亲本的两倍。特异抑制OsGA20ox1的表达导致水稻最终高度的减少，表明不仅OsGA20ox2而且OsGA20ox1也影响植物的高度。 Lee等（2004a）使用T-DNA插入突变体库对半胱氨酸蛋白酶基因（OsCP1）进行了功能分析，GUS检验显示OsCP1的启动子在水稻花粉囊中有很高活性。序列分析显示OsCP1预测的氨基酸序列与木瓜蛋白酶家族中半胱氨酸蛋白酶含有的保守结构域同源。在T2代鉴定了一个抑制的突变体，显示出花粉发育的严重缺陷。表明该基因在水稻中编码半胱氨酸蛋白酶，可能在花粉发育中起重要作用。 Lee等（2004b）分离到开花推迟的T-DNA插入突变体，T-DNA整合在水稻OsMADS50的K-box区域。OsMADS50的超表达引起愈伤阶段的极早开花，OsMADS50的RNAi植株显示出开花延迟和增加伸长节间的数量。结果表明OsMADS50是开花的激活因子，控制水稻各种花的调节因子。 Li等（2005）在T-DNA插入突变体库中筛选到一个具有短根表型的突变体，分离了水稻谷氨酸受体相似基因（命名为GLR3.1）。组织学和DNA合成分析表明突变体根中分生组织的激活失常，而且伴随着强烈的细胞程序性死亡。研究表明GLR3.1在早苗期对于维持根顶端分生组织细胞分裂和细胞的生存是必须的。 Jiang等（2005）找到一个在根的伸长中对温度敏感的T-DNA插入突变体，遗传和分子的分析显示，突变表型是编码葡萄糖-6-磷酸乙酰基转移酶的基因（命名为OsGNA1）的功能丧失引起的，该基因与UDP-N-乙酰氨基葡萄糖的重新合成有关。突变体异常的根形态包括：根的缩短，微管的破坏，根伸长区细胞的收缩。结论支持了蛋白质的糖基化在细胞代谢，微管稳定性，水稻根中细胞形态建成中起重要作用的观点。3 T-DNA插入突变体在水稻功能基因组研究中的问题3.1 组织培养变异自Hiei等（1994）等首次报道用农杆菌介导法对水稻成功地实现遗传转化以来，该方法在水稻遗传转化中得到广泛应用并不断完善，这使建立水稻T-DNA插入突变体库成为可能。与拟南芥插入突变体库的构建相比，水稻的一个困难是需要做大量繁琐的组织培养工作。拟南芥是在开花时用农杆菌菌液浸泡或喷洒等方法实现遗传转化的，不经过组培过程而获得转化植株。而组织培养是一个容易发生基因突变的因素，于是通过组织培养建立的突变体库就可能会得到许多与T-DNA插入无关的突变体。因此在突变体的鉴定中必须经过突变性状和T-DNA共分离检测，以确定突变性状是否真正是由于T-DNA的插入所造成的。3.2 T-DNA插入的复杂性 在T-DNA转化的植株中，通常可以检测到多个T-DNA插入到一个转化植株中， 一个位点包含多个TDNA插入或多个位点包含多个插入；或产生T-DNA的正向和反向重复、与比邻的染色体DNA发生重排等，导致随后分离基因和基因功能分析的复杂性。方进等（2001）分析了24条转基因水稻T-DNA侧翼序列，发现侧翼序列除14个是水稻DNA外，有9个为载体“主干”（backbone）序列，还有1个为外源基因。其中侧翼序列是载体“主干”（backbone）序列的又有多种情况。说明T-DNA特别是多拷贝T-DNA的插入涉及复杂的整合机制。3.3 侧翼序列分离正是由于上述的原因，使得有些T-DNA插入突变体的侧翼序列不易分离。研究表明质粒营救法从转基因植株获得的侧翼序列为水稻基因组DNA的效率是72，比TAIL-PCR法高18（张帆等，2004）。影响TAIL-PCR效率关键在于T-DNA边界序列的完整性，当边界序列碱基缺失过大时会影响TAIL-PCR效率，甚至失败。此时可用质粒营救方法获得侧翼序列。由于T-DNA的右边界在T-DNA转化过程中起重要的作用，它在整合时是相对保守的，所以营救T-DNA右边界的侧翼序列较好。小 结从拟南芥插入突变体库的构建及其研究所取得的进展，可以预见随着水稻饱和突变体库的建立，会有更多的水稻基因被克隆鉴定，特别是控制重要农艺性状的基因，这将会对农业生产产生巨大影响。突变群体的构建是功能基因组学的基础，有了理想的突变库，还需要进行系统、全面的表型筛选和分子鉴定。侧翼序列的分离可能是从表型筛选到分子鉴定的一个瓶颈。多种方法和新技术的应用有望解决这一问题。参考文献1 方进, 翟文学, 王文明, 李素文, 朱立煌. 转基因水稻T-DNA侧翼序列的扩增与分析. 遗传学报, 2001, 28: 345-3512 江树业. 水稻突变群体的构建及功能基因组学. 分子植物育种, 2003, 1: 137-1503 阎双勇，谭振波，李仕贵. 水稻插入突变库构建研究进展. 中国生物工程杂志, 2004, 6: 48-534 张祖新，张方东，郑用琏. 功能基因组学及其研究方法. 作物学报, 2003, 29: 194-2015 张帆，金维正，陈双燕，吴运荣，刘非燕，吴平. 质粒营救法和TAIL-PCR法获得水稻T-DNA旁邻序列的效率比较. 农业生物技术学报, 2004, 12: 13-186 Goff S A, Ricke D, Lan TH, PrestingG, WangR, Dunn M, Glazebrook J, Sessions A, Oeller P, Varma H, Hadley D, Hutchison D, Martin C, Katagiri F, Lange B, Moughamer T, Xia Y, Budworth P, Zhong J, Miguel T. 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