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实时定量 PCR 的 GMO 检测 - 转基因拷贝数测定 BMC Biotechnology 2004, 4 :14 利用实时定量 PCR 技术估算转基因水稻的转基因拷贝数 LitaoYang 1, 2 , JiayuDing 1, 3 , ChengmeiZhang 4 , JunweiJia 4 , HaiboWeng 4 , WenxuanLiu 3 and DabingZhang 1, 4 摘要 在转基因植物中，转基因拷贝数对目标基因的表达水平和遗传稳定性有很大地影响，这使得转基因拷贝数的估算成为转基因作物研究中的重要课题。目前，转基因拷贝数是通过 Southern 分析来估算的，这种方法费力又费时，需要大量的植物材料，并可能会引入危险的同位素。在本文中，我们报道了一种高灵敏、高通量的实时（ RT ） PCR 技术，用来估算转基因水稻的转基因拷贝数。本系统使用了 TaqMan 定量 RT PCR 技术，通过与编码蔗糖磷酸合成酶（ SPS ）的水稻内源参照基因进行比较，来决定转基因水稻中外源葡萄糖苷酸酶（ GUS ）和潮霉素磷酸转移酶（ HPT ）基因的拷贝数。 T 0 代转基因植物的 GUS 和 HPT 拷贝数是通过将 GUS 和 HPT 基因的定量 PCR 结果和内参 SPS 的结果进行相互比较来计算的。在优化的 PCR 条件下，我们可以准确地评估含有一个、二个、三个和四个转基因拷贝的 T 0 代转基因植物。另外，在我们对 GUS 报告基因和 HPT 选择标记基因的拷贝数估算中，显示出转基因水稻 T DNA 重组现象的发生频率比一般认为的更高。 关键词 转基因水稻， TaqMan 实时 PCR ， GUS ， HPT ，拷贝数 前言 从第一个转基因番茄 FLAVR SAVR 问世以来，转基因技术得到迅猛的发展 （ FDA 1994 ; Kok and Kuiper 2003 ） ，各种外源基因被引入到植物中，改善了它们的特性 （ Einspanier 2001 ）。在过去七年里，全世界转基因作物的种植面积从 1996 年的 170 万公顷增加到 2003 年的 6770 万公顷（ James 2003 ）。当得到新的转基因植物时，一个重要的步骤是对它们进行分子水平的定性。必须对大量的第一代转化植株进行分析，因为新 DNA 是被随机地插入到植物基因组中的，而插入到一个或多个染色体位置的多个转基因拷贝经常会导致基因沉默。插入一个或两个外源基因的植物能产生高水平的表达（ Flavell 1994 ; Vaucheret et al. 1998 ），所以估算转基因拷贝数是选择和种植转基因植物的关键。 转基因拷贝数一般是通过 Southern 分析来估算的，近年来其他方法也用于拷贝数的估算，包括比较基因组杂交（ Larramendy et al. 1998 ）、荧光原位杂交（ Kallioniemi et al. 1996 ）、多重扩增探针杂交（ Armour et al. 2000 ; Hollox et al. 2002 ）和芯片（ Lucito et al. 2000 ; Li et al. 2002 ）技术。但是所有这些方法都费力而且费时，需要相当数量的新鲜或冷冻样品的 DNA ，而且经常要用到危险的同位素（ De Preter et al. 2002 ）。另外，这些方法产生的结果经常不能正确地反映出那些会导致相应限制性酶切位点缺失（ Mason et al. 2002 ）的转基因拷贝的重组情况。为了克服这些限制，许多研究者开发了快速、敏感和有效的定量 PCR 技术来，用于决定转基因植物中的转基因拷贝数，例如通过连续竞争性的定量 PCR （ Callaway et al. 2002 ）来估算 Nicotiana tabacum NT-1 细胞悬液中的转基因拷贝数，以及通过 TaqMan 实时定量 PCR 技术来估算转基因番茄和玉米的拷贝数（ Ingham et al. 2001 ; Mason et al. 2002 ; Song et al. 2002 ）。不过直到现在，还没有人研究过利用 RT PCR 技术来估算转基因水稻中的转基因拷贝数。我们在本文中描述了一种定量 RT PCR 的分析方法，通过与编码蔗糖磷酸合成酶（ SPS ）的水稻内源参照基因（ Ding et al. 2004 ）进行比较，来快速、准确地估算转基因水稻中的外源葡萄糖苷酸酶（ GUS ）和 潮霉素磷酸转移酶（ HPT ）基因拷贝数。 材料和方法 材料 双元质粒 pCAMBIA 1301 （ GenBank no. AF234297 ） 包含了 CaMV 35S 启动子控制下的 GUS 和 HPT 基因 （ Roberts et al. 1998 ） ，将它通过 AgrobaCterium tumefaciens 介导 转化到水稻种属 Oryza sativa L. ssp Japonica 9522 中。 DNA 提取 利用 DNA 提取 Kit （ Shanghai Ruifeng Agro-tech, Shanghai, China ）来提取和纯化 用于定量 RT PCR 分析的水稻基因组 DNA 样品。根据 CTAB 方法 （ Sambrook et al. 1989 ）从新鲜叶子中提取和纯化用于 Southern blot 分析的 水稻基因组 DNA 样品。基因组 DNA 通过测量 260nm 的紫外光吸收值来定量， DNA 纯度通过 260nm 和 280nm 紫外光吸收值的比例来评估，并利用在 0.5 TBE 中的 1%Agarose 电泳和 EB 染色来分析。 引物和探针 设计寡聚核苷酸引物和 TaqMan 探针（表 1 ）。所有的引物和探针都由上海申友公司（ Shanghai, China ）合成，探针的 5 端用荧光报告染料 6 羧基荧光素（ FAM ）标记， 3 端用荧光淬灭染料 6 羧基四甲基罗丹明（ TAMRA ）标记。 GUSR/GUSF 引物对和 GUSP 探针，以及 HPTR/HPTF 引物对和 HPTP 探针分别用于 GUS 和 HPT 的定量 PCR ，分别产生 149bp 和 77bp 的扩增片段。 表 1 实时定量 PCR 的引物对和探针 名称 走向 序列 （ 5 3 ） 长度 （ bp ） 位置 （ bp ） GUSF 正向引物 TTAACTATGCCGGAATCCATCGC 23 702724 GUSR 反向引物 AACGCTGACATCACCATTGGC 21 830850 GUSP 正向探针 ATGCTCTACACCACGCCGAACACCTG 26 731756 HPTF 正向引物 CTATTTCTTTGCCCTCGGACGA 22 8,9448,965 HPTR 反向引物 GGACCGATGGCTGTGTAGAAG 21 9,0009,020 HPTP 反向探针 CGCCGATAGTGGAAACCGACGCCC 24 8,9728,995 实时 PCR 的条件 在荧光定量 PCR 仪 上进行 TaqMan RT PCR ，反应体系为 25l ，包含 1 PCR buffer 、 5mM MgCl 2 、 0.2mM dATP 、 0.2mM dCTP 、 0.2mM dGTP 、 0.4mM dUTP 、 1.5U Taq DNA 聚合酶、 0.2U Amperase uracil N-glycosylase （ UNG ）、 1lDNA 模板和合适浓度的转基因特异性引物及探针（ 500nM HPTF/HPTR 引物和 300nM HPTP 探针或 500nM GUSF/GUSR 引物和 100nM GUSP 探针）。扩增条件包括一个循环的 50 2min 和 95 5min ，以及 50 个循环的 94 30s 、 60 30s 和 72 30s 。每个样品取三个复样进行定量。 为了得到 GUS 和 HPT 基因的标准曲线，对 pCAMBIA 1301 质粒溶液进行系列稀释，终浓度分别为 10 9 、 10 7 、 10 5 和 10 3 拷贝 / l （每个反应中加 1l ），通过三个独立的重复进行定量 RT PCR 分析。 转基因拷贝数的计算 为了计算 GUS 和 HPT 拷贝数，我们使用了结合两个绝对定量反应的相对定量方法：一个针对目标特异基因，另一个针对内源参照基因 （ Ahmed 2002 ; Bonfini et al. 2002 ）。我们比较了 GUS / HPT 转基因和 SPS 基因的定量结果（ Ding et al. 2004 ），分别针对转基因（ GUS 和 HPT ）和内源 SPS 基因绘制了标准曲线；将每个转基因水稻样品的实验结果与这些标准曲线进行比较，由此得到的转基因数量与内源基因的数量进行相除。每个反应有三个重复样本，并且重复进行了三次。 GUS 和 HPT 转基因的 Southern blot 分析 取转基因水稻样品的基因组 DNA10g （估算含有不同的 GUS 或 HPT 拷贝数），用 EcoRI 酶切，通过 0.8 Agarose 凝胶电泳和相应的 DNA markers （用 HindIII 和 EcoRI 酶切的 DNA ）进行分析，并转印到硝酸纤维素膜上（ Gene 公司）。利用随机引物 DNA 标记 Kit （ ver. 2， TaKaRa Biotechnolog y， Dalia n， China ） 在合适的 DNA 片段上标记 - 32 P dCTP ，通过该片段对膜进行杂交，以检测 GUS （ 1848 bp DNA 片段， 2032050 bp ； GenBank no. AF234297 ） 和 HPT （ 728 bp DNA 片段， 92429969 bp ； GenBank no. AF234297 ）。 62 进行 24h 的杂交，然后在室温下用 2SSC/0.1% SDS 和 1SSC/0.1%SDS 分别清洗一次膜，在 60 用 0.2 SSC/0.1 SDS 温育 30min ，接着利用 BioMax Transcreen-HE intensifying screen （ Eastman Kodak Company, Rochester, N.Y. ）让膜在 Hyperfilm MP X-ray films 上曝光。 结果和讨论 通过与内源 SPS 基因比较来估算转基因水稻中的转基因拷贝数 我们使用了材料和方法部分中描述的简单、有效的定量方法来估算转基因水稻中的转基因拷贝数。该方法中转基因拷贝数通过和内源参照基因的比较来定量，在设计上所有的反应变量都归一为起始 DNA 模板量。以前的实验观察结果表明水稻单拷贝基因 SPS 适于做为转基因水稻 PCR 检测和水稻总 DNA 定量的内源参照基因 （ Ding et al. 2004 ） ，因此我们利用 SPS 做为内源参照。用 SPS 基因扩增所得到的定量 RT PCR 结果来代表水稻基因组的总拷贝数，该结果再与靶标基因 GUS 和 HPT 的标准化结果进行比较，这样就可以估算转基因拷贝数。 标准曲线的验证 利用与标准曲线的比较来估算转基因拷贝数，该标准曲线是通过对 SPS 、 GUS 和 HPT 基因的系列标准 DNA 溶液进行定量 RT PCR 分析而获得的。在使用相对定量方法来估算转基因拷贝数之前，我们需要验证标准曲线，并表明转基因和内源参照基因的反应效率是相同的或者非常接近 （ Cirillo et al. （ 1999 ） ； Zhang et al. 2003 ）。标准曲线的相关系数良好（ 0.99840.9990 ）， PCR 的效率超过 0.90 。 GUS 和 HPT 的反应效率（分别为 1.00 和 0.95 ）与 SPS 相似（ 0.94 ），这表明我们的方法适合于估算转基因的拷贝数。 GUS 和 HPT 的 RT PCR 结果重复性 为了进一步验证我们定量方法的准确性和稳定性，我们生成并比较了三个独立的 GUS 和 HPT 的标准曲线。我们发现， HPT 和 GUS 转基因的变异系数（ CV ）在 0.57 到 7.15 之间变动，而标准偏差（ SD ）在 0.02 到 0.15 之间变动（表 2 ）。这些数据显示不同实验之间 CV 和 SD 的波动很小，说明 RT PCR 系统可以稳定而可靠地运作。 估算 T 0 代转化植株的 GUS 和 HPT 拷贝数 利用标准曲线，通过比较 GUS / HPT 基因转录子和内源 SPS 基因转录子的绝对数量来确定 GUS 和 HPT 的拷贝数。每个转基因水稻的 DNA 样品都测试三次，每次进行三个重复的反应；舍弃最大和最小的起始拷贝数（校正加样误差），对余下的七个数值取平均值，用来做为转基因或内源基因的起始拷贝数。针对这些数值，给出了 95 的置信空间，用来计算每个转基因水稻样品的转基因拷贝数（未显示数据），其中，转基因拷贝数是通过转基因的起始拷贝数和 SPS 基因的拷贝数之间的比例来获得的。一共测试了 24 个转基因水稻样品，结果显示 14 个样品含有 1 个拷贝的 HPT 基因， 7 个样品含有 1 个拷贝的 GUS 基因，余下的样品含有两个或两个以上的 HPT 和 / 或 GUS 基因（表 3 ）。 表 2 针对 HPT 和 GUS 基因进行 RT PCR 分析的重复性 DNA 数量（拷贝） Ct 值的平均值 CV （ % ） a SD b 1 2 3 HPT 基因 1,000,000,000 18.69 18.72 18.66 6.56 0.02 10,000,000 25.39 25.31 25.42 4.70 0.05 100,000 32.42 32.37 32.31 5.38 0.04 1,000 39.03 39.28 39.29 4.15 0.12 GUS 基因 1,000,000,000 12.51 12.59 12.50 7.15 0.04 10,000,000 19.45 19.32 19.29 3.62 0.07 100,000 26.01 25.74 26.04 2.33 0.13 1,000 32.63 32.74 32.38 0.57 0.15 a 变异系数 b 标准偏差 GUS 和 HPT 基因的重组 每个测试的转基因水稻样品（表 3 ）的结果比较表明，两个转基因的整合拷贝数不完全相符，这意味着在染色体整合的过程中发生了常见的 T DNA 重组。在 24 个测试样品中， 11 个样品 （ ZCM-1 3， ZCM-14 ， ZCM-22 ， ZCM-23 ， ZCM-27 ， ZCM-36 ， ZCM-40 ， ZCM-46 ， ZCM-61 ， ZCM-78 and ZCM-81 ）显示了重组的发生即 HPT 拷贝数和 GUS 拷贝数不相符。 45.8 的重组比例表明 T DNA 重组发生的频率高于一般的估算。重组比例的检测差异可能与技术有关，传统的 Southern blotting 技术只检测转基因，而不检测可选的标记基因，因此可能会漏检高比例的重组。 通过 RT PCR 和 Southern blot 确定的拷贝数之间的比较 为了确定从定量 RT PCR 中得到的转基因拷贝数，我们比较了 TaqMan 和 Southern blot 的结果，如表 4 中所示。在 18 个测试样品中， 15 个样品（ 83 ）的 Southern blot 和 RT PCR 分析结果一致， 3 个样品（ 17 ）的结果不同。在转基因拷贝数较高的情况下会产生不一致的结果，这 3 个不相关的样品在 RT PCR 分析中显示出有 3 个拷贝的基因插入，而在 Southern blot 分析中只显示 1 个或 2 个条带。 Southern 分析造成的拷贝数低估有几种原因，包括多于一个拷贝的 T DNA 插入到单位点、产生 DNA 片段的大小很相近以至于不能在凝胶上分开。相对而言， RT PCR 应该可以检测到基因的所有拷贝，除非是因为重组而偶然地破坏了引物结合位点 （ De Preter et al. 2002 ）。这些结果表明针对转基因拷贝数的评估， RT PCR 是比 Southern blot 更有效的技术。 表 3 推算的 GUS 和 HPT 拷贝数以及从 RT PCR 结果中推断的可能发生的基因重组 HPT GUS 基因重组 HPT GUS 基因重组 ZCM-1 1 1 No ZCM-36 2 1 ZCM-2 4 4 No ZCM-40 1 2 ZCM-3 3 3 No ZCM-46 1 4 ZCM-13 1 2 Yes ZCM-61 1 2 ZCM-14 1 2 Yes ZCM-65 3 3 ZCM-15 1 1 No ZCM-72 5 5 ZCM-16 1 1 No ZCM-73 4 4 ZCM-22 2 4 Yes ZCM-78 1 2 ZCM-23 1 23 Yes ZCM-80 3 3 ZCM-25 1 1 No ZCM-81 1 2 CM-27 4 5 Yes ZCM-87 2 2 1 1 No ZCM-90 1 1 表 4 RT PCR 和 Southern 分析在估算拷贝数上的比较 HPT GUS 样品 no. RT-PCR Southern blot （ Eco RI ） 样品 no. RT- PCR Southern blot （ Eco RI ） ZCM-1 1 1 ZCM-1 1 1 ZCM-15 1 1 ZCM-15 1 1 ZCM-16 1 1 ZCM-16 1 1 ZCM-22 2 2 ZCM-13 2 2 ZCM-36 2 2 ZCM-14 2 2 ZCM-87 2 2 ZCM-87 2 2 ZCM-3 3 3 ZCM-3 3 3 ZCM-65 3 1 ZCM-65 3 2 ZCM-80 3 2 ZCM-80 3 3 结论 总之，我们成功地开发了一种快速而可靠的 TaqMan RT PCR 方法，用来估算转基因水稻中转基因的整合拷贝数。本方法可以做为 Southern blotting 的替代法，因为 Southern blotting 要耗费大量时间，并且需要大量的新鲜或冷冻样品。与其他相似程序不同的是，我们的方法具有很好的灵活性，使得它可以适合于那些无法对所有反应组分进行准确优化的情况 （ De Preter et al. 2002 ）。另外，得到信息的质量也优于 Southern blot 分析。因此，使用内源 SPS 参照基因的 RT PCR 分析应该认为是一种分析转基因水稻拷贝数的好方法。 参考文献 1 Ahmed FE (2002) Detection of genetically modified organisms in foods. Trends Biotechnol 20:215223 2 Armour JA, Sismani C, Patsalis PC, Cross G (2000) Measurement of locus copy number by hybridization with amplifiable probe. Nucleic Acids Res 28:605609 3 Bonfini L, Heinze P, Kay S, Van den Eade G (2002) Review of GMO detection and quantification techniques. 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