4.3双水相萃取.ppt

4 3双水相萃取 双水相系统 aqueoustwo phasesysten ATPS PEG 聚乙二醇 polyethyleneglycol Kpi 磷酸钾 DX 葡聚糖 dextran 双水相形成的机理 某些有机物之间或有机物与无机盐之间 在水中以适当的浓度溶解后形成互不相溶的两相或多水相体系 右图中是聚乙二醇6000 PEG6000 和葡聚糖 Dextran500 两种聚合物形成的双水相 聚乙二醇和葡聚糖以不同比例分配在上下两相中 两相中水的含量都很高 从溶液理论上说 当两种或多种有机物和水溶液相互混合时 是分层还是混合成一相 取决于混合时熵变和分子间的相互作用 双水相体系的熵很难准确计算 分子间的作用力也不清楚 聚合物的不相容性 两种高聚物分子间如有斥力存在 在达到平衡后就有可能分成两相 两种高聚物分别富集于不同的两相中 双水相形成的依据 上层组成 5 PEG60002 Dextran50093 H2O 下层组成 3 PEG60007 Dextran50090 H2O 形成原因 聚合物的不相容性 即聚合物分子的空间阻碍作用 无法形成均一相 具有相分离倾向 一定条件下分成两相 双水相的类型 离子型高聚物 非离子型高聚物PEG DEXTRAN高聚物 相对低分子量化合物PEG 硫酸铵 当两种高聚物水溶液混合物混合后的总组成点落在两相区 如 点M 可形成互不相溶的两相T和B 两相的组成和密度均不同 一般 T相为上层 高聚物PEG含量较高 B相为下层 高聚物KPI含量较高 双水相系统相图的测定 可由实验来测定 将一定量的高聚物P浓溶液置于试管内 然后用已知浓度的高聚物Q溶液来测定 随着高聚物Q的加入 试管内的溶液由均相突然变浑浊 记录高聚物Q的加入量 然后再在试管内加入1ml水 溶液变澄清 继续滴加高聚物Q 溶液又变混浊 记录高聚物Q的加入量 以此类推 由实验可测定出一系列双节线上的平衡组成 进行数据整理 计算出各组数据 以高聚物P的浓度对高聚物Q的浓度作图 即可得到双节线 相图中的临界点K是系统上相 下相组成相同时由两相转变为均相的分界点 双水相萃取的原理 与液液萃取原理相似 依据物质在两相间的选择性分配 但萃取体系的性质不同 当物质进入双水相体系 依据悬浮粒子与其周围物质具有的复杂的相互作用 氢键电荷力疏水作用范德华力构象效应在上相和下相间进行选择性分配 分配系数比常规的萃取要大得多或小得多 双水相中的分配平衡 溶质在双水相中的分配系数 服从Nernst分配定律 相图 当相系统固定时 分配系数为一常数 与溶质的浓度无关 平衡状态下 上相中溶质的浓度 平衡状态下 下相中溶质的浓度 分配系数 双水相萃取过程 主要包括 双水相的形成 溶质在双水相中的分配和两相的分离 由双水相萃取过程可知 在满足成相的条件下 其萃取原理与一般溶剂萃取有许多共同之处 都是利用被分离物质在两相之间的分配差异来实现分离的 其差异主要是形成两相的物系不同 一个是有机相和水相 一个是双水相 两相物性的差异 使双水相萃取具有自身的特征 特征 操作条件温和表面张力大大低于有机溶剂相与水相间的表面张力 两相分散的耗能低 分散程度高 传质面积大 传质速率快 在温和的萃取条件下 达到较高的萃取效率 安全性能高药品生产 双水相萃取质量和安全性好 高聚物一般为不易挥发物质 操作环境对人体无害 操作简便与溶剂萃取操作相同 设备相同 易于实现连续化操作 处理量较大 分离后两相不需要特殊处理 可直接进入下一工序进一步分离纯化 易于放大各种参数可按比例放大 而产物收率并不降低 有利于从实验室走向工业化应用 适合于生物活性物质的分离纯化 对细胞碎片的分离较容易 双水相萃取的理论基础 表面自由能依据两相平衡时化学位相等的原则 可求得分配系数 服从Brownstedt方程式 即 大分子物质的M值很大 的微小变化就会引起分配系数很大的变化 故利用不同的表面性质 就可以达到分离个大分子的目的 双水萃相取的理论基础 表面电荷当盐的正 负离子对上下相有不同的亲和力 即正负离子的分配系数不同时 就会产生电位 电位差为 带电的蛋白质在两相的相间电位亦服从上式 在上述含盐的双水相体系中 蛋白质溶质要受两相电位差的影响 在两相的分配系数为 蛋白质的静电荷 蛋白质在零界面势系统中的分配系数 蛋白质的分配系数 法拉第常数 综合以上结果 Gerson提出下列公式 表面积 两相表面自由能之差 电荷数 电位差 由标准化学位和活度系数等组成的常数 结论 被分配物由于表面性质 憎水作用 氢键作用和离子键作用 选择性地在上相和下相之间分配 理论上很难计算出分配系数 通常要由实验测定 影响分配比的因素 聚合物浓度的影响浓度增加 分相容易 两相的相对组成的差异更大 聚合物组成的影响相对分子质量对聚合物组成的影响取决于聚合物的化学性质 在聚丙二醇 葡萄糖双水相体系 较疏水性蛋白质易溶于较疏水的聚丙二醇相 蛋白的分配系数随葡萄糖相对分子质量的增加而增加 但随聚丙二醇的相对分子质量增加而降低 盐和缓冲液的影响 盐的正负离子在两相的分配系数不同 从而在两相间形成电位差 影响带电的分离物在双水相的分配 如 在8 PEG4000 8 DexD 480 0 5mmol L磷酸钠 pH 6 9的双水相体系 50 mmol L的NaCl即可使溶菌酶 卵蛋白的分配系数不同 溶菌酶的等电点pI 11 0 故带正电 卵蛋白的等电点pI 4 6 故带负电 NaCl介质使PEG上相的电位低于DexD 480下相的电位 溶菌酶易在上相 卵蛋白易在下相 见图 研究发现增加盐的浓度可提高蛋白质的分配系数 如图 原因在于在高聚物 盐双水相体系中 盐的亲水性使蛋白质的亲水性减弱 疏水性增强 因而易分配于高聚物相 pH的影响原因 会影响蛋白质分子中可离解基团的离解度 因而改变蛋白质所带电荷的性质和数量 而这是与蛋白质的等电点有关 影响磷酸盐的离解程度 从而改变H2PO4 和HPO42 之间的比例 进而影响相间电位差 pH值微小变化会使蛋白质的分配系数改变2 3数量级 如果加入的盐不同 pH值的影响也不同 图中所示为4 4 PEG8000 7 DexD48体系中各种不同的蛋白质分别在两种盐作用下分配系数与pH值的关系 在等电点处 由于蛋白质不带电荷 对不同的盐分配系数是相同的 故加入不同的盐所得到的分配系数与pH值的关系曲线的交点即为蛋白质的等电点 这种测定蛋白质等电点的方法称为交错分配法 crosspartitioning 温度的影响主要影响双水相系统的相图 也影响液相物理性质的变化 如粘度和密度 从而影响M 但总的来说 温度对分配系数的影响不是很敏感 大规模操作一般在室温下进行 不需冷却 这是基于 1 成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用 常温下蛋白质不会发生变性 2 常温下溶液粘度较低 容易相分离 3 常温操作节省冷却费用 影响双水相系统萃取过程的因素 两相界面宽度愈大 两相间的密度差愈大 两相间的表面张力愈大 则愈利于分相 但不利于两相的被分离物在两相间的传质而分配 双水相系统萃取 除了亲和双水相系统萃取 涉及化学反应少 在双水相系统中的被分离物传质速度快 因而达到分配的时间短 但因两相密度相差小 分配困难 是其主要矛盾 利用离心沉淀可加快相分离速度 体系的选择和优化 1 体系选择的原则 根据目标pro和共存杂质的HFS M pI Z等的差别 综合利用静电 疏水和添加适当种类和浓度的盐 可选择性萃取目标产物 设计试差实验 确定最佳萃取系统 常利用多组10mL刻度离心管进行分配平衡实验 配制高浓度的聚合物和盐的备用溶液 利用其配制一系列不同浓度 pH和离子强度的双水相 加入料液后 再加水稀释 然后充分混合 离心使两相完全分离 分别测定上 下相中目标产物浓度或生物活性 计算分配系数 Applications 1 蛋白质 酶的纯化2 人生长素的分离纯化 Applications 3 核酸的分离纯化 Applications 4 病毒 细胞 细胞器的分离 大规模双水相萃取由于相混合能耗低 相平衡时间短 故双水相萃取规模放大非常容易 10mL刻度离心管的实验结果可准确放大到处理200Kg细胞匀浆液规模 这种易于放大的优点对于新药研制中生产工艺的开发极为有利 双水相萃取技术的进展 用变性淀粉PPT代替昂贵的Dextran PPT PEG体系已被用于从发酵液中分离过氧化氢 半乳糖甘酶等 PPT PEG体系比PEG 盐体系稳定 和PEG Dextran体系相图非常相似 并具有以下优点 1 蛋白质溶解度大 蛋白质在PPT浓度到15 以前没有沉淀 但在PEG浓度大于5 时溶解度显著减少 在盐溶液中的溶解度更小 2 黏度小