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抗肿瘤药物评价技术 抗肿瘤药物药效学指导原则 细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则 化学药物一般药理学研究技术指导原则 中药 天然药物一般药理学研究技术指导原则 指导原则 体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型 其中至少一种为人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型 试验结果三种模型均为有效 再重复一次也为有效 体外实验选用10 15株人癌细胞株 至少重复一次 抗肿瘤药物药效学研究的要求 体内 体外实验方法相结合 以体内实验为主 体外抗肿瘤活性试验 体外抗肿瘤活性试验 选用10 15株人癌细胞株试验还应考察受试物对耐药肿瘤细胞系和正常人源细胞的作用和影响使用MTT还原法 磺酰罗丹明B SRB 染色法药物与细胞共培养时间一般为48 72小时 贴壁细胞需先贴壁24小时后再给药 试验应设阴性 阳性 溶媒对照组 阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药 试验至少应重复一次 四氮唑盐还原法 体外抗肿瘤活性试验 试验原理 四氮唑 MTT 3 4 5 dimethylibiazol 2 yl 2 5 diphenyl tetrazoliumbromide 是一种能接受氢原子的染料 活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的甲 月替 formazan 而死的细胞则无此功能 用二甲基亚讽 DMSO 溶解甲 月替 后 在一定波长下用酶标仪测定光密度值 即可定量测出细胞的存活率 方法要点 受试样品处理细胞结束后 加入5mg mlMTT液20微升 孔 继续培养四小时 再加三联液并培养过夜 在酶标仪上于490nm波长处检测OD值 观测指标直接指标为96孔板上各被测孔的OD值 然后按公式 对照组OD值 治疗组OD值 对照组OD值 100 计算出相应的细胞生长抑制率 剧情况可进一步采用Logit法计算50 生长抑制浓度IC50值 磺酰罗丹明染色法 体外抗肿瘤活性试验 试验原理 SRB sulforhodamine是一种蛋白质结合染料 粉红色 可溶于水 SRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合 其在515nm波长的OD读数与细胞数呈良好的线性关系 故可用作细胞数的定量 MTT法的一个缺点是OD值可随放置时间而变 而SRB法无此现象 因此更适用于进行大规模的试验 方法要点 用10 冷三氯乙酸与4 固定已经受试样品处理的细胞1h 洗涤 干燥 加入4mg mlSRB液100微升 孔染色15min 1 冰醋酸洗涤 干燥 最后加入150微升 孔的Tris溶液 在酶标仪上与515nm波长处检测OD值 观测指标同MTT法 另外 NCI目前采用以下指标评价化合物的体外抗肿瘤活性 测定的OD值包括对照组 加药组及加药时的细胞的OD值C T 和T0 据此计算 生长抑制率 T T0 C T0 100 按生长抑制率或细胞死亡率对样品浓度绘出量效关系曲线图 并求出IC50 染料排斥法 体外抗肿瘤活性试验 试验原理 活细胞有排斥某些染料如伊红 台盼蓝 苯胺黑等的能力 而死细胞由于膜完整性的破坏 可被着色 因此培养的肿瘤细胞中加入这些染料 一定时间后 对着色和未着色的细胞进行计数 即可算出被杀死的细胞比例 方法要点 向一定容积的待检细胞悬液加入定量的某种染液 最常用的是0 4 台盼蓝液 混匀 室温染色5 15min 将已染色的细胞悬液滴加至血细胞计数板 直接在光镜下计数活细胞数和细胞总数 观测指标 按 未染色细胞数 细胞总数 X100 计算活细胞率 对照组活细胞率应在90 以上 根据活细胞率计算受试样品的半数致死剂量 LD50 作为药物抗肿瘤活性的指标 阿拉马蓝法 体外抗肿瘤活性试验 试验原理 非荧光性蓝色底物阿拉马蓝可被活细胞中的线粒体内的NADPH相关的脱氢酶类还原为强荧光性粉红色底物 采用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分别为530nm和590nm处读取荧光强度值 与活细胞数呈良好的线性关系 方法要点 细胞经受试样品处理后 加入10 20ul阿拉马蓝染液 继续培养一定时间 用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分别为530nm和590nm处读取荧光强度值 观测指标 根据荧光强度可以计算细胞生长抑制率 适当时可进一步计算IC50值 集落形成法 体外抗肿瘤活性试验 试验原理 克隆原细胞具有持续增殖能力 当单个细胞分裂6代或6代以上时 其后代所组成的群体 集落 便含50个以上细胞 通过集落计数可对克隆原细胞作定量分析 它反映了单个细胞的增殖潜力 故能较灵敏地测定抗癌药的活性 日前被认为是一种较理想的检测方法 方法要点 将浓度为500个细胞 ml的对数生长期细胞悬液2ml种至35ml的培养皿 并加受试样品适量 培养7d或更长时间 姬姆萨染色 解剖显微镜下计数含50细胞以上的集落 观测指标 根据集落数计算集落形成率 对照组集落形成率不应低于40 再计算用药组的集落形成抑制率 根据情况可进一步采用Logit法计算受试样品的IC50值 集落形成率 集落数 细胞接种数X100 集落形成抑制率 1 用药组集落形成率 对照组集落形成率X100 生长曲线测定法 体外抗肿瘤活性试验 试验原理 在最适条件下 肿瘤细胞在培养液中呈指数生长 如取细胞数的对数与培养时间作图可得一条直线 故称此时为对数生长期 随着细胞密度不断增高 由于代谢产物的积聚及营养物的消耗 细胞生长逐渐减慢以致停止 此时称高坪期或稳定期 因此药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来 方法要点 将浓度为10000个细胞 ml的对数生长期细胞悬液按每瓶5ml种至25ml的培养瓶 或按每孔100微升种至96孔板 并加受试样品适量 培养后分别于即刻和1 2 3 4 5 6 7d进行检测 前者可采用台盼蓝染色计数活细胞 后者可采用MTT法或SRB法读取OD值 并据此进行作图与计算 观测指标1 倍增时间 TD 将实际生在曲线进行直线回归求出0和t时刻的理论细胞数N0和Nt 据此计算 TD 0 301t logNt logN0 2增殖细胞杀伤率 N0 N0 N0 100 3细胞生长饱和密度 Ns 代表高坪期每毫升细胞数的均数 体外抗肿瘤活性试验 白血病 6株 CCRF CEM HL 60 K562 MOLT 4 RPMI 8226 SR肺癌 9株 A549 EKVX HOP 62 HOP 92 NCI H23 NCI H226 NCI H322 MNCI H460 NCI H522乳腺癌 BT 549 HS578T MCF 7 MCF 7 ADR MDA MB 231 ATCC MDA MB 435 MDA N T 47D卵巢癌 IGROV1 OVCAR 3 OVCAR 4 OVCAR 5 OVCAR 8 SK OV 3肾癌 786 0 A498 ACHN CAKI 1 RXF 393 SN12C TK 10 UO 31前列腺癌 DU 145 PC 3中枢神经系统肿瘤 SF 268 SF 295 SF 539 SFB 19 SFB 75 U251黑色素瘤 M14 MALME 3M SK MEL 2 SK MEL 5 SK MEL 28 UACC 62 UACC 257 LOCIMV 美国NCI抗肿瘤药物体外筛选使用的60种人类细胞 体外抗肿瘤活性试验 兼顾选择使用动物 小鼠 肿瘤与人的肿瘤细胞 筛选实验以快速生长的细胞为主 兼顾选择使用贴壁生长细胞与悬浮生长细胞 样品初筛时应该注意三点 体外抗肿瘤活性试验 对于化学合成物或天然产物的提取物初筛时可以选择100 10 1 g mL三个浓度进行初步筛选测定IC50时 至少应该设置5个浓度 浓度间隔可采用等比间隔 例如 1 2 4 8 16或0 01 0 1 1 10 100 美国NCI现用的浓度为10 4 10 5 10 6 10 7 10 8mol L 凯基现用的浓度为1 2 4 8 16 32 64 128 256 药物与细胞共培养时间一般为48 72小时 贴壁细胞需先贴壁24小时后再给药 样品与细胞作用时间 待筛样品的浓度 体外抗肿瘤活性试验 评价标准 以同一样品不同浓度对肿瘤细胞抑制率作图可得到剂量效应曲线采用Logit法计算半数有效浓度 IC50值或EC50值 合成化合物或植物提取纯品的IC50 10 g m1或植物粗提物的IC50 20 g m1时 则判断样品在体外对肿瘤细胞有杀伤作用 体外试验至少重复一次 体外抗肿瘤活性试验 体外筛选其他方法 MTS法 刃天青法以线粒体为作用靶点的受试物不宜采用四氮唑盐还原法溶媒对照组与阴性对照组比较 OD值应在 5 且无统计学差异应考虑到受试物在水溶液中的稳定性 比如环磷酰胺在水溶液中的半衰期为3h脂溶性的受试物常用DMSO助溶 但DMSO终浓度不低于0 1 测出的OD值有事会出现假阴性 加MTT等染色剂时更换培养基 注意事项 体内抗肿瘤活性试验 举例 表化合物XXX对人肝癌细胞HepG 2体外增殖的影响 体外抗肿瘤活性试验 体内抗肿瘤试验结果是评价候选化合物有效性的最重要指标体内抗肿瘤试验必须选用三种以上肿瘤模型 其中至少一种为人癌裸小鼠移植模型或其它人癌小鼠模型 试验结果三种模型均为有效 再重复一次也为有效 评定该化合物对这些实验性肿瘤具有治疗作用 通常情况下 以人癌异体移植模型试验结果来评价细胞毒类抗肿瘤药物的有效性 体内抗肿瘤活性试验 体内抗肿瘤活性试验 小鼠肿瘤模型大鼠肿瘤模型人源异种移植肿瘤模型 自发性肿瘤诱发的肿瘤移植性肿瘤 a 皮下肿瘤模型 b 腹水瘤模型 c 原位接种模型 动物模型 实验动物 体内抗肿瘤活性试验 动物要求健康 符合等级动物要求 三证裸鼠 SPF级 小鼠 清洁级 SPF级实验动物质量合格证实验动物生产许可证实验动物使用许可证雌雄均可 但同一批实验中动物性别必须相同妇科肿瘤使用雌性小鼠 前列腺癌等使用雄性小鼠小鼠鼠龄为5 6周 体重为18 22克裸鼠6周龄以后 会产生体液免疫 NK细胞 B淋巴细胞免疫 成瘤率会下降同批动物体重相差不超过 20 评价同一物质的活性时 不同批次的实验必须采用同一品系的小鼠 体内抗肿瘤活性试验 肿瘤瘤株 用体外试验敏感细胞株进行体内抗人癌裸小鼠移植瘤试验 模型建立和使用应注意 1 移植瘤一般由相应的细胞株移植而建立 对细胞株和移植瘤的化疗敏感性应予了解 2 移植瘤复苏后一般应传2 3代后再用于体内抗肿瘤试验 3 对模型生长情况应全面了解 尤其是生长快的模型 4 为了保持移植瘤的生物学特性和遗传特性 复苏后移植瘤体内传代应少于15 20代 体内抗肿瘤活性试验 体内抗肿瘤活性试验 体内抗肿瘤活性试验 溶于水的药物 用生理盐水或蒸馏水配制 如用酸 碱溶解者 可先用小量酸 0 1 0 5NHCl 或碱 NaHCO3 Na2CO3 NaOH 溶解 调节pH在4 5 9 0的范围内 用乙醇 丙二醇 吐温80 DMSO助溶的药物 或用吐温60 吐温80 2 3 淀粉 0 5 羧甲基纤维素制成混悬液的药物 可腹腔注射或口服 但必须设相同浓度的溶剂对照组 用注射用花生油配制的溶液或乳剂可口服 皮下或肌肉注射 药物配制 体内抗肿瘤活性试验 试验设模型对照组 阳性对照组 治疗组 治疗组设高 中 低三个剂量组 小鼠肿瘤和腹水瘤接种后次日将动物随机分组 裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径 待肿瘤生长至100 300mm3后将动物随机分组 动物数普通小鼠每组10只 裸鼠6只 组别设置 试验设计 体内抗肿瘤活性试验 治疗组设高 中 低剂量治疗组 一般按4 2 1设置如何确定试验剂量临床等效剂量 根据体表面积换算 根据半数致死量 1 10 1 20预摸 或者高剂量使用最大耐受量或LD10的剂量根据文献估计剂量 剂量设置 试验设计 体内抗肿瘤活性试验 模型对照组给予相应的溶剂 阳性对照药选用对该动物敏感的 临床应用的抗肿瘤药物 阳性组必须作出阳性结果 否则有理由怀疑筛选方法和指标的可信度 如受试物为一抗癌药物的衍生物或类似物时 必须选用该抗癌药物作为阳性对照药原型剂对照阳性对照药选择原则疗效确切与被试物质化学结构类似 与被试物质有类似的作用机理 对照组设置 试验设计 体内抗肿瘤活性试验 分组当日开始给药 根据不同药物的代谢动力学和毒性反应等确定给药方案 给药途径应与推荐临床用药的途径相同 给药次数较多 或被试物质溶解性较差 静脉给药有困难时 可考虑使用腹腔给药 但在评价药效时要注意这两种给药途径是有差别的 可采取瘤周 瘤内 肌肉 皮下给药途径 腹水瘤试验时一般不能应用腹腔给药途径 给药方案和给药途径 试验设计 腹水瘤模型接种给药后 观察和记录动物死亡时间 计算生存天数 如阴性对照组20 动物存活时间超过4周 表明腹水瘤生长不良 实验作废 检测指标 裸鼠移植瘤模型推荐使用测量瘤径的方法 动态观察受试物抗肿瘤的效应 肿瘤直径的测量次数根据移植瘤的生长情况而定 一般为每周2 3次 每次测量同时还需称鼠重 免疫缺陷小鼠皮下移植的肿瘤很少发生转移 多数死于原发肿瘤 而临床肿瘤病人大多死于肿瘤转移 动物和临床肿瘤病人的死亡原因不同 因此 对于人癌异体移植试验 生命延长率并不是理想的观测指标 体内抗肿瘤活性试验 体内抗肿瘤活性试验 裸鼠皮下移植瘤模型 肿瘤体积 tumorvolume TV 的计算公式为 V 1