数字PCR技术原理及应用.docx

李春勇(中国科学院亚热带农业生态研究所 湖南长沙 410125)摘要:数字PCR(dPCR)是近年来引起重视并迅速发展起来的一种突破性的核酸定量分析技术。该技术先将核酸模板进行稀释,分配到大量独立的反应单元中,使每个反应单元中只有单个模板分子,然后进行PCR扩增反应,扩增结束后对每个反应室的荧光信号进行统计学分析,来定量DNA 拷贝 数。数字PCR 采用先扩增后定量,因此不依赖扩增曲线的循环阈值( Ct),也无需采用内参基因和标准曲线,准确度高、重现性好,可以实现绝对定量分析。由于其独特的技术优势,已经在临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达分析、环境微生物检测和下一代测序等研究领域显示出巨大的优势和应用 前景。本文对数字PCR 技术原理、定量分析方法、系统分类和应用等进行概述。关键词:数字PCR 有限稀释 泊松分布中图分类号:R450文献标识码:A文章编号:1674-2060(2014)11-0010-04数字PCR(digital PCR,dPCR)是近年来引起重视并迅速发展起来的一种突破性的定量分析技术。1992年Sykes等1检测复杂背景 下低丰度的IgH重链突变基因时,利用样品的有限稀释,让每个孔中 只获得单个模板分子,通过计算PCR后的扩增信号, 以期准确地确 定起始分子的数量, 虽然没有明确提出“数字PCR”的概念,但是已 经建立了数字PCR基本的实验流程,并且确定了数字PCR检测中一 个极其重要的原则以“终点信号的有或无”作为定量方法。这是数字PCR的雏形。1999年Vogelstein等2在检测粪便中进行癌变组织脱离细胞的BRAF特异突变型基因时,因受到体细胞基因的干扰,而 碰到检测灵敏度和检测分辨率的瓶颈,而采用了在384孔板中对每 个反应孔的样品量进行极限稀释并增加反应孔数进行检测的方式, 从而提出了数字式PCR的概念,同时也提出如果采用更多孔板其检 测灵敏度会更高,从而指出了数字PCR 系统的发展方向。1 数字 PCR 技术的原理阳性反应阳性目标分子阴性阴性反应(a) (b) (c) (d) 图 1 数字 PCR 原理示意图 (a)样品,(b)样品被分成多个微小的反应单元,(c)PCR反应,(d)检测荧光计数图 2 微反应室 / 孔板数字 PCR1010生物技术世界 BIOTECHWORLD生物技术图 3 微流控芯片数字 PCR 11,122 定量分析方法数字PCR采用直接计数的方法进行定量分析,即在PCR扩增结 束后有荧光信号的反应单元记为1,无荧光信号则记为0,有荧光信 号的反应单元中至少包含一个拷贝的目标分子。理论上,在样品中 目标DNA浓度极低的情况下,有荧光信号的反应单元数目等于目标 DNA分子的拷贝数。但是,在通常情况下,数字PCR的反应单元中可 能包含两个或两个以上的目标分子,这时需要采用泊松概率分布公 式(Poisson distribution)进行计算3,4。图4 液滴数字PCR 示意图15表 1 数字 PCR 应用实例kp( X k ) e Z Z( k 0,1,2, ) (1)n!上式中为每个反应单元中所含目标DNA 分子的平均拷贝数(浓度),p为在一定的条件下,每个反应单元中所含k个拷贝目标 DNA 分子的概率。由样品的稀释倍数m决定,有=cm,其中c为样品的原始拷 贝数( 浓度) 。当k=0(不含目标DNA 分子) 时,上式可简化为p=e=ecm,p可以看作是无荧光信号的反应单元数与反应单元总数的比 值,即n f e cm (2)n其中,n为反应单元总数,f 为有荧光信号的反应单元数。上式两边取对数(ln)得到数字PCR 一般包括两部分内容, 即PCR 扩增和荧光信号分析。在PCR 扩增阶段, 数字PCR 先将样品稀释到单分子水平, 再平均分 配到几十至几万个单元中进行反应。与qPCR 对每个循环进行实时 荧光测定的方法不同,数字PCR是在扩增结束后对每个反应单元的 荧光信号进行采集,有荧光信号记为1,无荧光信号记为0,有荧光信 号的反应单元中至少包含一个拷贝的。理论上, 在样品中目标DNA 浓度极低的情况下,有荧光信号的反应单元数目等于目标DNA 分 子的拷贝数。但是,通常每反应单元中可能包含两个或两个以上的 目标分子,就需要使用泊松概率分布函数(Poisson distribution)进 行计算,根据反应单元总数、有荧光信号的单元数以及样品的稀释 系数,就可以得到样本的最初拷贝数(浓度)。数字PCR的关键是稀释模板,通过将一个样本分成几十到几万 份,分配到不同的反应单元,每个单元包含0个或一个(至多数个拷贝) 的目标分子,在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增,扩增 结束后对每个反应单元的荧光信号进行统计学分析。(如图1所示)fcm ln(1 ) (3)n根据数字PCR 反应单元总数和有荧光信号的单元数以及样品的稀释倍系数,就可以得到样本的最初拷贝数(浓度) 。 因为数字PCR通过终点检测计算目标序列的拷贝数,所以无需采用内参和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测3,5;此外,由 于数字PCR采用终点检测, 因此也不依赖于Ct 值, 所以数字PCR反 应受扩增效率的影响大大降低,对PCR反应抑制物的耐受能力也大 大提高,具有很高的准确度和重现性6,7。而且在数字PCR标准反应体系分配的过程(稀释过程)能够极大 的降低与目标序列有竞争性作用的背景序列浓度,因此数字PCR技 术也特别适合在复杂背景中检测稀有突变8,9。3 数字 PCR 系统分类BIOTECHWORLD 生物技术世界11领域 应用实例 临床诊断 无创产前诊断16- 18 癌症标志物检测19- 22 病毒检测23,24 拷贝数变异分析25- 27 突变检测28- 31 基因表达分析 基因表达分析7,32- 34 单细胞基因表达分析35,36 下一代测序 测序结果验证37- 41 测序文库质控42,43 转基因成分定量 转基因成分分析44- 46 微生物检测 水样微生物检测47,48 病原微生物检测49,50 检验检测世界数字PCR的灵敏度,除了与检测器的灵敏度和PCR扩增效率等因素有关外,很大程度上取决于反应单元的数目。反应单元的数目 越多,数字PCR的灵敏度越高,准确度也越高。根据反应单元形成的 不同方式, 主要有微反应室/ 孔板、微流控芯片和微滴等三类数字 PCR 系统。3.1 微反应室 / 孔板数字 PCR早期的数字PCR技术采用96/384孔板作为反应单元2。但是数 字PCR技术的灵敏度取决于反应单元的总数,反应单元数越多越有 利于提高灵敏度和准确度,普通的96/384孔板无法满足检测的需 要。因此,出现了成倍提高反应单元数目的做法,反应体积从微升级 降至纳升级10。但是随着反应单元数目的增多、反应体积的减少,人 工操作无法实现快速精准取样,就需要借助高通量自动上样设备, 大幅提高了仪器成本和操作复杂性。（如图2所示）3.2 微流控芯片数字 PCR随着微流体技术、纳米制造技术和微电子技术等的发展,微流 控芯片技术的使用使数字PCR 能够快速并准确地将样品流体分成 若干个独立的单元,进行多步平行反应,成本低、体积小和高通量, 是理想的数字PCR平台11,12。目前Fluidigm公司的Bio-MarkTM基 因分析系统,Life Technologies公司的QuantStudioTM 3D数字 PCR 系统均均为采用微流控芯片技术的数字PCR 系统。3.3 液滴数字 PCR液滴数字PCR源于乳液PCR(emulsion PCR)技术13,14,利用 微滴发生器可以一次生成数万乃至数百万个纳升甚至皮升级别的 单个油包水微滴, 作为数字PCR 的样品分散载体。PCR 反应结束后 检测每个微滴的荧光信号。通过油水两相间隔得到的以液滴为单位 的PCR反应体系,更容易实现小体积和高通量,而且系统简单,成本 低,因此成为理想的数字PCR技术平台。但是,上述技术需要将单拷 贝DNA模板与磁珠同时包裹在一个液滴中,增加了系统的复杂性和 定量分析的难度。目前Rain Dance公司的Rain DropTM数字PCR 系统,Bio-Rad公司的QX100系统、QX200系统均为采用液滴技术的 数字PCR 系统。（如图3 所示）4 数字 PCR 技术应用与传统qPCR技术相比,数字PCR技术具有极高的灵敏度、特异 性和精确性,使其在临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达分 析、环境微生物检测和新一代测序验证等研究领域显示出巨大的优 势和应用前景,已经有大量实验数据和结果证明了dPCR技术的优 良性能(见表1)。5 展望虽然数字PCR概念提出至今已经有二十多年,但其应用仍处于 初级阶段, 截止目前, 数字PCR对广大科研工作者仍然是一种全新 的检测方法。但是由于其独特的技术优势和应用前景,近几年来其 产业化发展相当迅速,应用也越来越得到重视。作为一个新的检测 平台,数字PCR开辟了一种全新的技术思路和手段,在未来几年内, 数字PCR有望从一种小众技术发展成为实验室中的标准工具。参考文献1Sykes PJ,Neoh SH,Brisco MJ,et al.Quantitation of targets forPCR by use of limiting dilution.Biotechniques 1992,13:444-449.2Vogelstein B,Kinzler K WDigital PCR.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America,1999,96:9236-9241.3Dube S1,Qin J,Ramakrishnan R.Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device.PLoS One,2008,3(8):e2876. 4林彩琴,姚波.数字PCR技术进展.化学进展,2012,24(12):2415-2423.5Sanders R,Huggett JF,Bushell CA,et al.Evaluation of digitalPCR for absolute DNA quantification.Analytical Chemistry,2011,83(17):6474-6484.6Zimmermann BG,Grill S,Holzgreve W, et al.Digital PCR:a pow- erful new tool for noninvasive prenatal diagnosis Prenatal Diagnosis,2008,28(12):1087-1093.7Hindson CM,Chevillet JR,Briggs HA,et al.Absolute quantifica- tion by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.Nature Methods,2013,10:1003-1005.8Dingle TC,Sedlak RH,Cook L,et al.Tolerance of droplet-digi- tal PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. 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