猪瘟活疫苗传代细胞源成品检验ppt课件.ppt

猪瘟活疫苗 传代细胞源 成品检验 1 内容 共有九个质量项分别是 物理性状检验 无菌检验 支原体检验 鉴别检验 外源病毒检验 安全检验 效力检验 剩余水分测定和真空度测定 2 1物理性状检验 本品为淡黄色海绵状疏松团块 易与瓶壁脱离 加稀释液后迅速溶解 3 2无菌检验 1按现行 中国兽药典 附录进行检验 应无菌生长 2用T G培养基50ml 接种疫苗 先做10倍稀释 1ml 置37 培养 3日后吸取培养物 分别接种T G小管和G A斜面各2支 每支0 2ml 1支置37 1支置25 另取0 2ml 接种一支G P小管 置25 均培养7日 应无菌生长 4 无菌检验 抽样 1应随机取样并注意代表性 2按每批或每个亚批进行 每批按瓶数的百分之一抽样 但不应少于5瓶 最多不超过10瓶 每瓶分别进行检验 5 3支原体检验 按现行 中国兽药典 附录进行检验 应无支原体生长 检测猪瘟活疫苗 传代细胞源 用支原体培养基 见 中国兽药典 附录24 25页 3 1样品处理 每批制品取样5瓶 加液体培养基或生理盐水复原成混悬液后混合 3 2接种与观察 每个样品需同时用以下两种方法检测 6 3支原体检验 3 2 1液体培养基培养将疫苗混合物5 0ml接种装有20ml液体培养基的小瓶 摇匀后 再从小瓶中取0 4ml移植到含有1 8ml培养基的2支小管 1 0cm 10cm 每支各接种0 2ml 将小瓶与小管置37 培养 分别于接种后5日 10日 15日从小瓶中取0 2ml培养物移植到小管液体培养基内 每日观察培养物有无颜色变黄或变红 如果无变化 则在最后一次移植小管培养 观察14日后停止观察 7 3支原体检验 3 2 1在观察期内 如果发现小瓶或任何一支小管培养物颜色出现明显变化 在原pH值变化达 0 5时 应立即将小瓶中的培养物移植于小管液体培养基和固体培养基 观察在液体培养基中是否出现恒定的pH变化 及固体上有无典型的 煎蛋 状支原体菌落 8 3支原体检验 3 2 2琼脂固体平板培养在每次液体培养物移植小管培养的同时 取培养物0 1 0 2ml接种于琼脂平板 置含5 10 CO2 潮湿的环境 37 下培养 在液体培养基颜色出现变化 在原pH值变化达 0 5时 也同时接种琼脂平板 每3 5日 在低倍显微镜下 观察检查各琼脂平板有无支原体菌落出现 经14日观察 仍无菌落者时 停止观察 9 3支原体检验 3 3每次检查需同时设阴 阳性对照 在同条件下培养观察 检测猪瘟活疫苗 传代细胞源 疫苗 用猪鼻支原体作为阳性对照 3 4结果判定3 4 1接种样品的任何一个琼脂平板上出现支原体菌落时 判疫苗不合格 3 4 2阳性对照中至少有一个平板出现支原体菌落 而阴性对照中无支原体生长 则检验有效 10 3支原体检验 3 4结果判定3 4 1接种样品的任何一个琼脂平板上出现支原体菌落时 判疫苗不合格 3 4 2阳性对照中至少有一个平板出现支原体菌落 而阴性对照中无支原体生长 则检验有效 11 4鉴别检验 中和试验将疫苗用灭菌生理盐水稀释成为每毫升含有100个兔MID的病毒悬液 与等量的抗猪瘟病毒特异性血清充分混合 置10 15 作用60分钟 其间振摇2 3次 同时设立病毒对照和生理盐水对照 12 4鉴别检验 注射 观察与判定中和结束后 分别耳静脉注射兔2只 每兔1 0ml 按效力检验 1 项进行观察和判定 除病毒对照组应出现热反应外 其余2组在接种后120小时内不出现热反应 13 5外源病毒检验 按现行 中国兽药典 附录进行检验 应无外源病毒污染 5 1样品处理取样品2 3瓶 将样品混合 用相应的特异性阳性血清中和后作为检品 5 2细胞的选择与样品培养5 2 1细胞的选择Vero MDBK ST传代细胞 14 5外源病毒检验 5 2 2样品的接种与培养 1 至少1 0ml 制品至少含10头份 已处理被检样品应接种到已长成良好单层的上述细胞 另至少设一瓶正常细胞对照 2 细胞培养物传代方式 上一代细胞培养物冻融3次后接种新细胞单层的方式继代 至少继代一次 总培养时间应不少于14日 最后一次继代的细胞单层数量和培养面积应符合荧光抗体检查法 致细胞病变检查法和红细胞吸附性外源病毒检验的要求 15 5外源病毒检验 5 2 3判定在至少14日的培养期内 要对细胞培养物进行常规检查 如果培养期间出现细胞病变 则判为不符合规定 如无细胞病变 培养结束时 细胞单层应按5 2 4进行检验 16 5外源病毒检验 5 2 4检查方法使用BVDV PPV荧光抗体 5 2 4 1荧光抗体检查法最后一次继代的细胞单层应培养5 7日后用于荧光抗体检查 对每一种特定外源病毒的检验应至少含三组细胞单层 1 被检样品细胞培养物 2 在最后一次继代时接种100 300FAID50特定病毒的阳性对照 3 正常细胞对照 每一组细胞单层检查面积应不小于6 0cm2 17 5外源病毒检验 荧光检查判定细胞单层样品经丙酮固定后 用适宜的荧光抗体进行染色 检查每一组单层是否存在特定外源病毒的荧光 当阳性对照出现特异荧光 正常细胞无荧光时 如果被检样品出现外源性病毒特异性荧光 判为不合格 如果阳性对照组荧光不明显 或者正常细胞出现不明显荧光 判为无结果 应重检 18 5外源病毒检验 5 2 4 2致细胞病变检查法取经传代培养至少7日的敏感细胞单层 每个至少6 0cm2 进行检验 用适宜染色液对细胞单层进行染色 观察细胞单层 检查包涵体 巨细胞或其他由外源病毒引起的CPE的出现情况 如果出现外源病毒所致的特异性CPE 判为不合格 如果疑有外源病毒污染 又不能通过其他试验排除这种可能性时 则判为不合格 19 5外源病毒检验 5 2 4 3红细胞吸附性外源病毒检验取经传代后至少培养7日的细胞单层 每个至少6 0cm2 进行检验 以PBS洗涤细胞单层2 3次 加入适量0 2 的豚鼠红细胞和鸡红细胞的等量混合悬液 以覆盖整个单层表面为准 红细胞悬液可在加入前混合 亦可分别滴加于不同的细胞单层上 20 5外源病毒检验 5 2 4 3选2个细胞单层 分别在2 8 和20 25 放置30分钟 用PBS洗涤 检查红细胞吸附情况 若出现外源病毒所致的红细胞吸附现象 判为不合格 若疑有外源病毒污染 又不能通过其他试验排除这种可能性时 则判为不合格 21 6安全检验 6 1猪瘟病毒中和试验方法6 1 1先测定猪瘟病毒兔化弱毒 抗原 对兔的最小感染量 MID 试验时 将抗原用灭菌生理盐水稀释成100个兔MID ml 作为工作抗原 如果抗原对兔的MID为10 5 0 ml 则将抗原稀释成1000倍使用 22 6安全检验 6 1 2将被检猪血清分别用灭菌生理盐水作2倍稀释 与含有100个兔MID ml的工作抗原等量混合 摇匀后 置10 15 中和2小时 其间振摇2 3次 同时设含有相同工作抗原量加等量生理盐水 不加血清 的对照组 与被检组在同样条件下处理 23 6安全检验 6 1 3中和完毕 被检组各注射兔1 2只 对照组注射兔2只 每只兔耳静脉注射l 0ml 观察体温反应 并判定结果 24 6安全检验 6 1 4结果判定体温反应标准同效力检验项 当对照组2只兔均呈定型热反应 或1只兔呈定型热反应 另一只兔呈轻热反应 时 方能判定结果 被检组如果用1只兔 须呈定型热反应 如果用2只兔 每只兔应呈定型热或轻热反应 被检血清判为阴性 25 6安全检验 6 1 5注意如被检组用2只兔 其中1只兔无反应或呈可疑反应时 可采血复归或对2只兔进行攻毒 如被检血清出现阳性反应或复归兔仍为可疑反应时 则该头被检猪不得用于猪瘟疫苗的安全 或效力 检验 被检组用1只兔时 不得复归或攻毒 用中和试验方法选择易感猪 无论是否同窝猪 均须逐头检测 26 6安全检验 6 2测常温及安全检验注射剂接种前观察5 7日 每日上 下午各测体温1次 挑选体温 精神 食欲正常的易感猪使用 每批疫苗按瓶签注明头份用灭菌生理盐水稀释成每毫升含6头份 肌肉注射猪5头 每头5 0ml 含30头份 27 6安全检验 6 3测温及判定接种后 每日上 下午各观察并测体温1次 观察21日 体温 精神 食欲与接种前相比没有明显变化 或体温升高超过0 5 但不超过l 稽留不超过4个温次 或减食不超过l日 疫苗可判为合格 如果有l头猪体温超过常温l 以上 但不超过1 5 稽留不超过2个温次 疫苗也可判为合格 28 6安全检验 6 3测温及判定如果有1头猪的反应超过上述标准 或出现可疑的其他体温反应和其它异常现象时 可用5头猪重检1次 重检的猪仍出现同样反应 疫苗应判为不合格 29 6安全检验 6 3测温及判定也可在猪高温期采血复归猪2头 每头肌肉注射可疑猪原血5 0m1 测温观察16日 如果均无反应 疫苗可判合格 如果第1次检验结果已经确证疫苗不安全 则不应进行重检 30 7效力检验下列方法任择其一 7 1用兔效检按瓶签注明头份 用无菌生理盐水将每头份疫苗稀释1 7500头份 ml 耳静脉注射体重为1 5 3 0kg兔2只 每只l 0ml 接种后 上 下午各测体温1次 48小时后 每隔6小时测体温1次 根据体温反应和攻毒结果进行综合判定 31 7效力检验 7 1 1兔接种疫苗后 体温反应标准如下 定型热反应 潜伏期48 96小时 体温上升呈明显曲线 至少有3个温次超过常温1 以上 并稽留18 36小时 如稽留42小时以上 必须攻毒 攻毒后无反应可判为定型热 轻热反应 潜伏期48 96小时 体温上升呈明显曲线 至少有2个温次超过常温0 5 以上 并稽留12 36小时 可疑反应 潜伏期48 96小时 体温曲线起伏不定 稽留不到12小时 或潜伏期在24小时以上 不足48小时及超过96小时至120小时出现热反应 体温反应呈二次高峰 有一次高峰符合定型热反应 或轻热反应 标准者 均须攻毒 攻毒后无反应时 该兔热反应可判为定型热或轻热反应 无反应 体温正常 32 7效力检验 7 1 2结果判定 注苗后 当2只兔均呈定型热反应 或1只兔呈定型热反应 另1只兔呈轻热反应 时 疫苗判为合格 注苗后 当1只兔呈定型热反应 或轻热反应 另1只兔呈可疑反应 或2只兔均呈轻热反应 时 可在注苗后7 10日攻毒 接种新鲜脾淋毒或冻干毒 攻毒时 加对照兔2只 攻毒剂量为50 100倍乳剂 每兔耳静脉注射1ml 33 7效力检验 攻毒后的体温反应标准如下 热反应 潜伏期24 72小时 体温上升呈明显曲线 超过常温1 以上 稽留12 36小时 可疑反应 潜伏期不到24小时或72小时以上 体温曲线起伏不定 稽留不到12小时或超过36小时而不下降 无反应 体温正常 攻毒后 当2只对照兔均呈定型热反应 或1只兔呈定型热反应 另1只兔呈轻热反应 而2只注苗兔均无反应 疫苗判合格 34 7效力检验 注苗后 如有1只兔呈定型热 或轻热反应 另1只兔呈可疑反应 或无热反应 可对可疑反应兔或无反应兔采用剖杀或采心血分离病毒的方法 判明是否隐性感染 或注苗后 2只兔均呈轻热反应 亦可对其中1只兔分离病毒 35 效力检验 分离病毒方法是 接种疫苗后96 120小时之间 将兔剖杀 采取脾脏 用生理盐水制成50倍稀释乳剂 脾乳剂应无菌 或采取心血 全血 接种2只兔 每只兔耳静脉注射1ml 凡有1只兔潜伏期24 72小时出现定型热反应 疫苗可判为合格 36 7效力检验 重检规定接种疫苗后 由于出现其他反应情况无法判定时 可重检 用兔做效力检验 应不超过3次 37 7效力检验 用猪检验 7 2稀释与免疫按瓶签注明头份 用灭菌生理盐水将每头份稀释1 3000头份 ml 肌肉注射无猪瘟中和抗体的健康猪5头 每头l 0ml 38 7效力检验 用猪检验 7 2攻毒与判定10 14日后 连同条件相同的对照猪5头 各注射猪瘟病毒石门系血毒1 0ml 105 0MLD 观察16日 对照猪全部发病 且至少死亡3头 免疫猪全部健活或稍有体温反应 但无猪瘟临床症状 39 8剩余水分测定 按现行 中国兽药典 附录进行检验 应符合规定 8 1将干净的称量瓶逐个做好标记 然后置150 干燥箱中烘干2小时 待温度下降至60 70 时 移入由无水氯化钙的玻璃干燥瓶中备用 8 2接通天平电源 开显示器 校准 校准前至少预热60分钟 8 3接通真空干燥箱电源 打开开关 将温度调节到40 进行预热 40 8剩余水分测定 8 2接通天平电源 开显示器 校准 校准前至少预热60分钟 8 3接通真空干燥箱电源 打开开关 将温度调节到40 进行预热 41 8剩余水分测定 8 4取出待检样品 8 5天平的显示屏全零时 置称量瓶于称盘上 天平的显示屏自动显示称量瓶的重量 称量瓶重W1 待稳定后读数 记录称量瓶的重量及标记号 8 6取下称量瓶上的称量瓶 打开疫苗瓶 迅速将样品捣碎 倒入已知重量的称量瓶中 然后盖好瓶盖再次称重 瓶重 样品重W2 记录读数 然后将其移入无水氯化钙的玻璃干燥瓶中 以此类推各瓶依次进行 42 8剩余水分测定 8 7待被检样品称重全部结束后 立即将玻璃干燥瓶中盛有样品的称量瓶全部移入有五氧化二磷的真空干燥箱内 使瓶与瓶之间摆放有一定距离 然后打开瓶盖 关闭真空干燥箱门 8 8接通真空泵电源 打开开关 关闭真空干燥箱进气阀 开抽气阀 抽真空在2 67kpa 20mmHg 以下 加热至60 70 连续烘干3小时 第一次烘干 43 8剩余水分测定 8 9切断真空泵电源 关抽气阀 缓慢打开进气阀通入经过无水氯化钙过滤的干燥空气 待压力表指针慢慢回 时 开启箱门