血细胞染色PPT课件.ppt

细胞化学染色检验 bloodcellschemicalstaininglaboratory 李群 1 瑞士染色 2 POX染色 3 目的要求 1了解各类血细胞化学反应的原理 2掌握细胞化学染色结果的判断及临床意义概念细胞化学染色 是以形态学为基础 结合运用化学反应的原理对血细胞内各种化学物质 代谢成份 如酶类 酯类 糖类 铁 蛋白质核酸等 作定性 定位 半定量的分析方法 4 目的 辅助判断急性白血病细胞类型eg POX酯酶 辅助血液系统疾的诊断和鉴别诊断eg NAP 观察疾病疗效和预后 探讨发病机制 5 基本操作固定 保持细胞结构及化学成份不变 1物理法 干燥 火焰2化学法 甲醛 乙醇 甲醇 丙酮显示 通过化学反应形成稳定的有色沉淀常有的化学反应 1偶氮偶联法酯酶染色2联苯胺法POX3普鲁士兰反应铁染色4雪夫反应PAS5金属沉淀法NAP复染 使细胞显示出来 颜色要与有色沉淀有明显对比度 6 常用血细胞化学染色 1 过氧化酶染色 POX 2 非特异性酯酶染色 NAE 3 糖原染色 PAS 4 中性粒硷性磷酸酶染色 NAP 5 铁染色 7 过氧化物酶染色 POX peroxidase stain 8 POX的性质 酶类 结合蛋白POX的存在 生物体内线粒体和溶酶体中 中性粒细胞含量最多 POX的功能 破坏氧化过程有剧毒的过氧化物 原理 细胞内的过氧化物酶能将底物的过氧化氢分解 产生新生态氧 后者使试剂中的联苯胺氧化为联苯胺蓝 不稳定的中间产物质位于酶所在位置 于空气中可变为蓝黑色 H2O2 H2O O 无色联苯胺 O 蓝色 联苯胺蓝 二苯醌二胺 蓝黑色 不稳定中间产物 在空气中 9 10 结果判断 阴性 无颗粒弱阳性 细小颗粒 分布稀疏 少阳性 颗粒粗 分布密集强阳性 颗粒粗大 充满胞质 11 12 13 14 各类血细胞的染色反应1粒系 分化差的原始粒 阴性分化好的原始粒 中性成熟粒细胞阳性嗜酸粒细胞 阳性颗粒粗大嗜碱粒细胞 阴性2单核细胞系 原始单 阴性幼单 成熟单 弱阳性 大部分 3红系 淋巴 巨核细胞 浆细胞 组织细胞 阴性4组织细胞 阴性吞噬网状细胞有时为阳性5遗传性POX缺乏症 阴性 15 16 17 临床意义1鉴别急性白血病 粒 淋 单 2区别小原粒与原始淋3急性早幼粒白血病与急性单核细胞白血病4急单与组白及恶组病的鉴别成熟中性粒细胞POX活性变化 再障 感染 化脓性细菌性感染 急淋 慢淋 急粒 慢粒 急单 MDS 放射病 退化的中性粒 18 19 瑞士染色 20 POX染色 21 注意事项过氧化氢要保证质量 乙液要新鲜配制 浓度一定要控制 否则反而抑制酶 0 05mol L 在甲液上加乙液后要马上混匀 否则染色情况不一致加过氧化氢低倍镜下出现阳性颗粒 马上就冲 否则弱阳性不好看 22 苏丹黑B染色 sudanblackB stain 23 苏丹黑B SBB 是一种脂溶性重氮染料 能溶解细胞内含酯结构 使酯类物质显示出来 SBB与POX比较 POX特异性高 临床首选SBB敏感性高 24 酯酶染色法 esterase stain 25 26 酯酶性质 水解酶酯酶存在 人和啮齿类动物血细胞内含有多种酯酶及同工酶分类 特异性酯酶染色 氯乙酸AS D萘酚酯酶 AS DNCE 非异性酯酶染色 1中性 醋酸萘酚酯酶 NAE 敏感性高 醋酸AS D萘酚酶 AS D 2酸性 酸性 醋酸萘酚酯酶 ANAE 鉴定T B淋巴细胞3碱性 丁酸萘酚酯酶染色 NBE 特异性高 单核 巨噬细胞的标志酶 27 28 29 中性非特异性酯酶染色 NAE 醋酸萘酚酯酶 原理 酯酶 NAE 在PH中性条件下 将基质液中 醋酸萘酚水解产生 萘酚 萘酚与重氮盐 坚牢兰 偶联 生成不溶的有色沉淀 灰黑色 定位在酶所在的部位 加氟化钠抑制试验 抑制 不被抑制 NAE存在于单核细胞粒细胞及淋巴细胞中 故为中性非特异性酯酶染色 单核细胞的阳性可被氟化钠抑制故做 NAC染色时 同时做氟化钠抑制试验 30 31 结果 阳性 胞浆内有灰黑色或棕黑色弥漫性颗粒状沉淀阴性 无色 32 33 34 35 正常血细胞 NAE染色反应1单核系 分化差的原单 分化好的原单 NaF抑制幼稚单 成熟单 NaF抑制2粒系 各期粒细胞 少数 NaF不被抑制3淋巴系 各期淋巴 少数 NaF不被抑制4红系 各期幼红细胞 少数 NaF不被抑制5其他 巨核细胞 血小板 NaF不被抑制 36 37 38 NAE NAE NaF抑制 39 临床意义 辅助鉴别急性白血病急单急粒急性早幼粒急淋红白或红血病 或 或 幼红细胞 NaF抑制不抑制不被抑制不被抑制不被抑制 40 41 特异性酯酶染色 氯乙酸AS D萘酚酯酶染色 naphtholAS Dchloroacetateesterase 42 特异性酯酶染色 氯乙酸AS D萘酚酯酶染色 特点 特异性高 只出现在粒细胞中 以称粒细胞酯酶 原理 血细胞内AS D萘酚酯酶水解基质液中氯乙酸AS D萘酚 产生AS D萘酚 进而与基质液重氮盐 坚牢兰 偶联 生成不溶的有色沉淀 灰黑色 定位在酶所在的部位 意义 辅助鉴别急性白血病类型 43 正常血细胞染色反应 1粒系 分化差原始粒 分化好原始粒 早幼 成熟中性粒 早幼 中幼阳性最强 嗜酸 嗜碱 或 2单核 个别 3肥大细胞 4自然杀伤细胞 NK 阳性率约50 5其他细胞 淋巴 浆细胞 巨核细胞 幼红细胞 血小板 44 意义 辅助鉴别急性白血病类型1 急粒 M3强 急单 M7 2 急粒 单白血病原 早幼粒 原 幼单 3 急淋 NK白血病50 45 46 47 糖原 PAS 染色 periodicacid Schiffreaction 48 49 50 糖原染色原理 糖原染色又称为过碘酸 雪夫染色过碘酸是氧化剂 能氧化多糖物质 糖原 粘多糖 粘蛋白 糖蛋白及糖脂等 中的乙二醇基 HOH CHOH 形成醛基 CHO CHO 醛基与雪夫试剂中的无色品红结合 使无色的亚硫酸品红 失去亚硫酸重新排列 恢复品红的对醌结构 变成紫红色物质 定位于多糖类的细胞内 51 52 53 54 55 PAS染色形态状描述 颗粒状 小块状 包涵体状 弥漫均匀红色 PAS阳性程度判断 阴性 无颗粒弱阳性 细颗粒阳性 粗颗粒强阳性 大 小块状 56 正常血细胞PAS染色反应 正常血细胞PAS染色反应粒系 分化差的原始粒 分化好的原始粒 中性分叶核 逐渐增强嗜酸 颗粒不着色 颗粒间呈红色嗜碱 颗粒 颗粒间不着色红系 单核细胞系统 分化差的原单 分化好的原单 成熟单 细胞颗粒 弥散分布 边缘可见粗大颗粒 淋巴细胞系统 大多数 20 粗颗粒及块状 巨核细胞系统 血小板 其他 浆细胞 或细颗粒 巨噬细胞 细颗粒 57 58 临床意义 1红血病 红白血病 MDS 块状或均匀红色 2辅助鉴别白血病急淋急粒急单 或 粗颗粒或块状均匀淡红色或细颗粒状细颗粒弥散分布巨核细胞白血病 M7 嗜碱性粒细胞白血病慢淋 粗颗粒或小珠 块状3其他 戈谢 Guqcher 尼曼 匹克 Nieman Pick 强 弱 或 Reed sternberg腺癌组织嗜碱细胞 或 59 60 61 62 63 64 尼曼 匹克 Nieman Pick 瑞士染色PAS染色 65 碱性磷酸酶 NAP 染色 neutrophilicalkalinephosphatase stain 66 存在 成熟中性粒细胞内 主要见于分叶核及杆状核 根据其酶染色强弱而来协助诊断及鉴别于其它疾病 67 NAP染色方法Comori钙 钴法 Kaplow偶氮偶联法试剂盒Kaplow偶氮偶联法原理 成熟中性粒细胞碱性磷酸酶在PH9 4 9 6碱性环境中 水解基质液 磷酸萘酚钠底物 释放出 萘酚 后者与重氮盐偶联 生成不溶性灰黑色沉淀 定位在胞质酶活性所在之处 NAP正常值 阳性率 10 40 积分 40 80分 各单位应建立本实验参考值 68 2020 1 7 69 碱性磷酸酶 NAP 染色钙 钴法原理中性粒细胞中有碱性磷酸酶存在时 可分解 甘油磷酸钠 为磷酸钠和甘油 磷酸钠再与硝酸钙 硝酸钴 硫化铵起一系列的化学反应 最后生成黑色的硫化钴 沉淀于细胞浆中 用来测定中性粒细胞中NAP活性 70 71 72 结果 1阳性反应 胞浆中出现灰色或棕黑色沉淀 2阳性反应分级标准 无色 胞浆浅灰色 均匀无颗粒或仅少部分胞浆有灰黑色沉淀 胞浆灰黑色或出现稍致密棕黑色片状沉淀 胞浆充满棕黑色片状沉淀 但分布均匀 密度较低 较密 团块较少 全部胞浆深黑色 并充满致密团块沉淀 甚致黑色沉淀可遮盖胞核 73 NAP阳性强度判断 74 75 积分法观察100个成熟中性粒细胞 分叶 杆状 按其反应强度求其百分率 各级百分率与其级数乘积的总和即为积分 eg 0 10 20 40 20 10 阳性率 20 40 20 10 90 积分 1 20 2 40 3 20 4 1 200正常值NAP阳性率 10 30 积分 50成熟中性粒细胞 分叶 杆状 呈阳性反应 其他细胞基本呈阴性 76 临床意义 NAP生理变化1年龄 新生儿 儿童 成人 老人 活性 2应急 紧张 恐惧 激烈运动 3月经 经前 经后 经后期恢复4妊娠 2 3月 轻度 分娩 高峰产后 正常 77 NAP病理变化1NAP积分 细菌感染 AA 某些骨髓增殖性疾病 如慢中粒白血病 骨纤 真红 原发性血小板增多症 慢粒 加速期 急变期 急淋 慢淋 恶性淋巴瘤 转移癌 肾上腺糖皮质激素及雄性激素治疗后NAP积分 慢粒 慢性期 急粒 MDS 恶组 PNH ITP 传单 粒缺 病毒感染 78 NAP疾病鉴别 PNHAA病毒感染细菌感染慢粒类白反应慢粒慢中粒恶组淋巴瘤恶组反应性组织细胞增多症急粒急淋继发性红细胞增多 无变化 真红继发性血小板增多症 无变化 原发性血小板增多症 79 80 81 82 重点 难点 基质液的配制 结果判定 临床意义 注意事项 1基质液要新鲜配制2基质液PH一般为9 4 9 6PH 9酶活性下降 PH 10细胞易破碎 3涂片应新鲜 一周内固定 染色 4每次染色要有阳性对照 83 酸性磷酸酶ACP acidphosphataseACP 和抗酒石酸酸性磷酸酶染色 tartyate resistantphosphataseTRAP 84 酸性磷酸酶ACP与细胞的许多生理功能和病理变化有关 血细胞的ACP有7种同工酶 ACP0 1 2 3 3b 4 5 某些血液病与ACP同工酶出现有关 ACP0存在于Gaucher细胞 单核细胞和巨噬细胞 ACP3存在于淋巴细胞 ACP3b存在于各型AL的原始细胞 ACP5存在毛细胞 ACP1 2 4存在于中性粒细胞 ACP染色方法 硫化铅法偶氮偶联法 85 硫化铅法原理 血细胞内ACP酸性条件下 PH5 0 可分解 甘油磷酸钠 产生磷酸根 磷酸根再与硝酸铅作用生成磷酸铅 沉淀于细胞浆中磷酸铅与硫化铵反应 最后生成黑色的硫化铅沉淀 86 抗酒石酸酸性磷酸酶染色 TRAP 抗酒石酸酸性磷酸酶染色 用相同方法制备两份基质液 一份加L 酒石酸 一份不加L 酒石酸 取两张同标本涂片 分别用两种不同基质液做ACP染色 如果血细胞内ACP耐酒石酸 两张均阳性 如不耐酒石酸 则不加酒石酸者阳性 加酒石酸者阴性 87 88 89 铁染色 ferric stain 正常骨髓中有一定量的铁 以铁蛋白和含铁血黄素形式储存 用以合成血红蛋白 这种储存的铁称细胞外铁 幼红细胞内含有铁颗粒 铁蛋白 存在于胞质中 这类红细胞称铁粒幼红细胞 铁染色的目的是了解体内铁的贮存及利用情况 90 91 92 铁染色化学反应原理骨髓粒中的含铁血黄素 细胞外铁 和幼红细胞中的铁粒 细胞内铁 其中三价铁与分子中的蛋白质结合不牢 经稀盐酸处理后 而游离 与酸性低铁氰化钾起反应 形成普鲁士兰色的亚铁氰化铁 根据反应的强弱 了解骨髓中铁的含量 93 94 95 结果 1细胞外铁检查 将铁染色的骨髓片先用低倍镜观察 再用油镜检查片中未尽展开的骨髓碎粒 铁颗粒呈浅蓝色 深兰色 共分五等 无铁颗粒可见 有少数铁颗粒或仅偶见少数铁小珠 有较多的铁颗粒和小珠 有很多铁颗粒小珠和少数小块 有极多铁颗粒小珠 并有很多小块 正常值 2 3的人为 1 3的人为 96 细胞外铁 97 98 99 2细胞内铁检查 幼红细胞核呈鲜红色 浆呈淡黄红色 铁颗粒呈兰绿色 计数100个幼红细胞 并记录含铁颗粒的阳性和阴性比例 算出百分率 并根据细胞内铁颗粒的数目 大小 染色深浅和颗粒分布情况 将铁粒幼红细胞分为四型 I型 含铁1 2粒II型 3 5粒III型 6 9粒III型 含10粒以上铁颗粒正常值 细胞内铁 19 44 以I型为主少数为II型 无环形铁及铁粒红细胞 100 101 102 环形铁粒幼红细胞的标准 粒幼红细胞含有粗大深染的铁颗粒含10粒以上 其中2 3以上的铁粒绕核形成完全或不完全性环形 围核1 2以上的区域有铁粒环绕 铁粒幼红细胞 幼红细胞内出现铁颗粒铁粒红细胞 成熟红细胞内出现铁颗粒环形铁粒幼红细胞 幼红细胞内出现环形铁 103 104 105 106 107 108 109 110 铁染色临床意义 1诊断缺铁性贫血 指导铁剂治疗 2诊断铁粒幼细胞性贫血3MDS RAS环形铁 15 4非缺铁性贫血内外铁正常或 溶贫 巨幼贫 AA 多次输血后 白血病外铁 内铁 感染 肝硬化 慢性肾炎 尿毒症 血色病 111 重点 难点结果和临床意义注意事项 1玻片要干净 去铁处理 2酸性亚铁氰化钾要新鲜配