高效液相色谱.ppt

高效液相色谱法的出现 由于气相色谱只能分析M1000 高沸点 难挥发 热稳定差的样品就无能为力了 随着工业生产的需要 高效液相色谱的研究成为一个迫切课题 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相 称为经典液相色谱法 此方法柱效低 时间长 常有几个小时 在经典液相色谱法的基础上 于60年代后期 气相色谱理论迅速发展以及高压泵的研制成功 为高效液相色谱的发展奠定了基础 高效液相色谱又称高压液相色谱法 HPLC 也称现代液相色谱 Stein和Moore获得了1972年的诺贝尔化学奖 研制出氨基酸分析仪 返回 1 高效液相色谱仪举例 2 3 4 5 高效液相色谱法的特点 与经典液相色谱比较 四高 高压 压力可达150 300Kg cm2 高速 流速为0 1 10 0mL min 高效 可达5000块塔板 米 在一根柱中同时分离成份可达100种 高灵敏度 紫外检测器灵敏度可达0 01ng 1ng 109g 同时消耗样品少 如用Lichrosorb ODS色谱柱 采用梯度洗脱 可在不到0 5h内分离出尿中104个组分 6 与气相色谱相比 高沸点 热不稳定有机化合物及生化试样的高效分离分析方法 l 气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物 它们仅占有机物总数的20 对于占有机物总数近80 的那些高沸点 热稳定性差 摩尔质量大的物质 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析 2 气相色谱采用流动相是惰性气体 它对组分没有亲和力 即不产生相互作用力 仅起运载作用 而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体 选择余地大 它对组分可产生一定亲和力 并参与固定相对组分作用的剧烈竞争 因此 流动相对分离起很大作用 相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数 这为选择最佳分离条件提供了极大方便 3 气相色谱一般都在较高温度下进行的 而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作 7 5 2高效液相色谱仪器结构 色谱仪器的流程由液体流动相的输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 信号放大记录系统组成 其中高压泵 色谱柱和检测系统是高效液相色谱的主要部件 返回 8 输液系统 包括流动相储液瓶 过滤器 脱气装置 高压泵 压力脉动阻尼器 梯度洗脱装置等部件组成 返回 9 脱气装置 脱气就是驱除溶解在溶剂中的气体 1 脱气是为了防止流动相从高压柱内流出时 释放出气泡 这些气泡进入检测器后会使噪声剧增 甚至不能正常检测 2 溶解氧会与某些流动相与固定相作用 破坏它们的正常功能 对水及极性溶剂的脱气尤为重要 因为氧在其中的溶解度较大 常用的脱气方法有 低压脱气法 电磁搅拌 水泵抽空 可同时加温或向溶剂吹氮 由于抽空或加热过程中可能引起流动相中低沸点溶剂的挥发而影响其组成 此法不适于二元以上溶剂组成的流动相脱气 吹氦脱气法 氦气经由一圆筒过滤器通入冲洗剂中 在0 5公斤 厘米压力下保持10 15分钟 氦气的小气泡可将溶于流动相中的空气带出 此法简单方便 适用于所有冲洗剂脱气 但由于氦气价格昂贵 在国内尚难于普及 超声波脱气法 将溶剂储液瓶置于超声波清洗槽中 以水为介质超声脱气 一般500ml溶剂约需超声20 30min即可达到驱气目的 此法方便 不影响溶剂组成 并适用于各种溶剂 目前国内使用较为普遍 返回 10 高压泵 目前高效液相色谱使用的高压泵分为恒压和恒流泵 恒流泵使输出的液体流量稳定 而恒压泵则使输出的液体压力稳定 恒流泵中有往复泵 累积型往复泵 注射泵 恒压泵有气动放大泵 各种高压泵均具有以下性能 1 泵体材料能耐化学腐蚀 通常使用普通耐酸不锈钢或优质耐酸不锈钢 2 能在高压下连续上作 通常要求耐压40 50MPa cm 2 能在8 24h连续上作 压力平稳 3 输出流量范围宽 一般在0 01 10mL min 4 输出流量稳定可调 高效液相色谱使用的检测器 大多数对流量变化敏感 高压输液泵应提供无脉冲流量 这样可以降低基线噪声并获较好的检测下限 流量控制的精密度应小于1 最好为0 5 重复性最好为0 5 返回 11 往复泵 往复泵有两类 一种是活塞式 另一种是隔膜式 形成脉冲式供液 返回 12 累积型往复泵 累积型往复泵有两个泵头 以串联方式连接在一起 这样可以提供平稳的液流 所以如此是因为两级泵腔排液体积不同 第一级泵腔是第二级泵控的一倍 1 高压流动相出口 2 二级活塞 3 一级活塞 4 流动相 返回 13 注射泵 注射泵类似于注射器 用一台步进电机驱动注射泵的活塞把液流从泵腔中挤出 泵腔体积较大 250 500mL 密封性好的活塞把泵腔中的液体等速流出 1 电机 2 涡轮 3 螺旋 4 螺杆 5 活塞 6 至色谱柱 返回 14 气动放大泵 气动放大泵是利用气体为动力源 适合于液相色谱柱的装填 近代的液相色谱仪不用这种泵 1 接色谱柱 2 流动相入口 3 高压气入口 4 气体放空 返回 15 梯度洗脱装置 外梯度 将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入混合室 用高压输液泵混合液输入色谱柱 16 内梯度 一台高压泵 通过比例调节阀 将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合 17 进样系统 通常使用耐高压的六通阀进样装置和自动进样系统 分部分进样和整体进样 返回 18 自动进样系统 19 分离系统 色谱柱 柱材料及规格柱连接方式柱温控制柱填充技术 返回 20 柱材料及规格 柱体为直型不锈钢管 内径1 6mm 柱长10 50cm 发展趋势是减小填料粒度和柱径提高柱效 采用直形柱管 标准填充柱柱管内径为4 6mm或3 9mm 长10 50cm 填料粒度5 10 m时 柱效达5000 10000块 m理论塔板数 返回 21 柱连接方式 柱接头通过过滤片与色谱柱管连接 在色谱柱管的上下两端要安装过滤片 过滤片一般用多孔不锈钢烧结材料 此烧结片上的孔径小于填料颗粒直径 却可让流动相顺利通过 并可阻挡流动相中的极小的机械杂质以保护色谱柱 返回 22 柱温控制 以下几种情况需精确控制柱温 1 在一些法定标准分析方法中 要求保留时间具有再现性 2 必须通过改变柱温来提高分离效率 3 对高分子化合物或粘度大的样品 柱温必须高于室温 4 具有生物活性的生物分子 要求分析时柱温应低于室温 5 对某些组成复杂的样品 在单一色谱柱不能实现完全分离 需要使用二维色谱技术 利用柱切换 使两根色谱柱在不同柱温下操作 以实现多组分的完全分离 返回 23 柱填充技术 填充色谱柱的方法 根据固定相微粒的大小有干法和湿法两种 微粒大于20 m的可用干法填充 要边填充边敲打和震动 要填得均匀扎实 直径10 m以下的微粒 不能用干法填充 必须采用湿法 干法装柱与气相色谱法相似 湿法装柱又称等密度匀桨装填法 返回 24 湿法装柱 常用对二氧六环和四氯化碳 或叫氯乙烯和四溴乙烷等溶剂 根据固定相的密度不同 采用不同的溶剂比例 配成密度与固定相相似的混合液为匀浆剂 1 顶替液槽 2 高压泵 3 压力表 4 三通阀 5 匀浆罐 6 色谱柱 7 废液槽 返回 25 检测系统 高效液相色谱检测器按适用性分为选择性检测器和通用型检测器 紫外和紫外 可见分光光度检测器示差折光检测器荧光检测器电化学检测器 返回 26 紫外和紫外 可见分光光度检测器 检测原理 紫外及紫外 可见光吸收光度检测器相当于一台吸收光度计 在高效液相色谱仪的流通池内样品的浓度与吸光度的关系遵循Beer定律 A log I0 I bc式中 A为吸光度 I0为入射光强度 I为透射光强度 是样品的摩尔吸光度 b为流通池的光程长度 c为样品浓度 27 示差折光检测器 检测器原理 示差折光检测器是通过连续监测流动相的折光指数变化来测定样品的浓度 各种物质都具有不同的折射率 溶液的折射率是溶剂 洗脱剂 和溶质 待测组分 各自的折射率乘以各自的摩尔浓度之和 设溶液的折射率为n 则 式中c1和c2为溶剂和溶质的摩尔分数 c1 c2 1 n1和n2为溶剂和溶质的折光指数 28 荧光检测器 检测原理 当某些溶液受紫外光照射后 能吸收紫外光线而处于不稳定的激发状态 紧接着辐射出比紫外光波更长的光线 即荧光 在被测溶质浓度较低时 溶质受激发而发生的荧光强度与被测溶质的浓度成正比关系 29 仪器结构 高灵敏度 高选择性 对多环芳烃 维生素B 黄曲霉素 卟啉类化合物 农药 药物 氨基酸 甾类化合物等有响应 返回 30 电化学检测器 电化学检测器是根据电化学分析方法而设计的检测器 主要有两种类型 一种是根据溶液的导电性质 通过测定流经检测器的离子溶液电导率的大小来测量离子浓度 此类检测器是高效离子色谱采用的主要检测器 另一类是根据化合物在电解池中工作电极上发生的氧化 还原反应 通过测量电位 电流和电量来确定化合物在溶液中的浓度 返回 31 2020 1 8 32 5 3高效液相色谱基本原理 表征液相色谱柱填充性能的重要参数总孔率 柱压力降和柱渗透率高效液相色谱塔板理论高效液相色谱的速率理论 返回 33 总孔率 式中 F 流动相的体积流速 cm3 s u 流动相的平均线速 cm s r一柱内径的半径 cm tM 柱的死时间 L 柱长 cm V 色谱柱的空体积 cm3 T表达了色谱柱填料的多孔性能 当使用全多孔硅胶固定相时 T约为0 85 使用非多孔的玻璃微珠 或硅胶 固定相时 T约为0 40 可认为是柱中颗粒之间的孔率 用 表示 返回 34 柱压力降 式中 一流动相的粘度 MPa s k0 色谱柱的比渗透系数 dp 固定相颗较直径 m 色谱柱的阻抗因子 P1 P0 色谱柱的入口压力和出口压力 MPa 返回 35 柱渗透率 柱渗透率KF 表示流动相通过柱子的难易程度 在高效液相色谱法中 由于使用液体流动相 其粘度大于气体流动相 且固定相粒度又小 为保证柱子在较低压力下正常操作 总希望柱渗透率要大 返回 36 高效液相色谱的速率理论 其中 Cd为填充系数 为一常数 Cm是容量因子k的函数 为一常数 其值取决于柱直径 形状和填充状况 当柱填充均匀紧密时 其值下降 Csm是与固定相颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数以及容量因子k有关 为一常数 Cs是与容量因子k有关的常数 Dm为组分在流动相中的扩散系数 比气相扩散系数小4 5个数量级 Ds为组分分子在固定液内的扩散系数 返回 37 5 4高效液相色谱流动相 一 液相色谱的流动相流动相特性流动相类别流动相选择选择流动相时应注意的几个问题 返回 38 1 液相色谱的流动相又称为 淋洗液 洗脱剂 流动相组成改变 极性改变 可显著改变组分分离状况 2 亲水性固定液常采用疏水性流动相 即流动相的极性小于固定相的极性 称为正相液 液色谱法 极性柱也称正相柱 3 若流动相的极性大于固定液的极性 则称为反相液 液色谱 非极性柱也称为反相柱 组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反 流动相的特性 返回 39 流动相类别 按流动相组成分 单组分和多组分 按极性分 极性 弱极性 非极性 按使用方式分 等度淋洗和梯度淋洗 常用溶剂 己烷 四氯化碳 甲苯 乙酸乙酯 乙醇 乙腈 水 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性 以改进分离或调整出峰时间 40 流动相选择 在选择溶剂时 溶剂的极性是选择的重要依据 采用正相液 液分配分离时 首先选择中等极性溶剂 若组分的保留时间太短 降低溶剂极性 反之增加 也可在低极性溶剂中 逐渐增加其中的极性溶剂 使保留时间缩短 常用溶剂的极性顺序 水 最大 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷 氯仿 溴乙烷 苯 四氯化碳 二硫化碳 环己烷 己烷 煤油 最小 返回 41 选择流动相时应注意的几个问题 1 尽量使用高纯度试剂作流动相 防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加 2 避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子 如使固定液溶解流失 酸性溶剂破坏氧化铝固定相等 3 试样在流动相中应有适宜的溶解度 防止产生沉淀并在柱中沉积 4 流动相同时还应满足检测器的要求 当使用紫外检测器时 流动相不应有紫外吸收 返回 42 5 5高效液相色谱梯度洗脱技术 一 单一洗脱剂 二 等度洗脱 流动相的k值恒定三 梯度洗脱 改变流动相的k值梯度变化速率梯度范围 返回 43 等度洗脱 返回 44 梯度变化速率 返回 45 梯度范围 是指两种流动相起止百分比之差 如 起 80 水 20 甲醇 20 水 80 甲醇 止 初始的试探性实验可进行一次全范围梯度 即5 100 B B是指甲醇或乙腈等 返回 46 5 6高效液相色谱类型简介 液 固吸附色谱液 液分配色谱离子交换色谱离子色谱排阻色谱亲和色谱高效液相色谱分离方法的选择 返回 47 液 固吸附色谱 固定相 固体吸附剂为 如硅胶 氧化铝等 较常使用的是5 10 m的硅胶吸附剂 流动相 各种不同极性的一元或多元溶剂 基本原理 组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样 对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性 缺点 非线形等温吸附常引起峰的拖尾 返回 48 液 液分配色谱 固定相与流动相均为液体 互不相溶 基本原理 组分在固定相和流动相上的分配 流动相 对于亲水性固定液 采用疏水性流动相 即流动相的极性小于固定液的极性 正相色谱 反之 流动相的极性大于固定液的极性 反相色谱 正相与反相的出峰顺序相反 固定相 早期涂渍固定液 固定液流失较多 较少采用 化学键合固定相 将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶 担体 表面的游离羟基上 C 18柱 反相柱 返回 49 正相高效液相色谱 正相高效液相色谱是指以亲水性的填料作固定相 如在硅胶上键合羟基 氨基或氰基的极性固定相 以疏水性溶剂或混合物作流动相 如己烷 的液相色谱 在液相色谱发展的早期 类似于气相色谱把含羟基 氨基或氰基的极性固定相涂渍在硅胶上这样容易被流动相冲洗掉 现在几乎都使用键合固定相了 返回 50 反相高效液相色谱 反相高效液相色谱是指以强疏水性的填料作固定相 以可以和水混溶的有机溶剂做流动相的液相色谱 如在硅胶上键合C18或C8烷基的非极性固定相 以极性强的水 甲醇 乙腈作流动相的高效液相色谱 返回 51 返回 52 正 反相色谱中极性和保留时间的关系 返回 53 化学键合固定相是通过化学反应将有机分子键合在载体表面所形成的柱填充剂 具有稳定 流失小 适于梯度淋洗等特点 这种固定相分离机理既不是简单的吸附 也不是单一的液液分配 而是二者兼而有之 化学键合的表面覆盖度决定哪种机理起主要作用 对多数键合相来说 以分配机理为主 通常 化学键合相的载体主要是硅胶 表面有硅醇基 Si O R 对热不稳定 遇水 乙醇等强极性会水解 使酯链断裂 因此只适于以不含水或醇的流动相 Si R 或Si N 不水解 热稳定性比硅酸脂好 但所用的格氏反应不方便 使用水溶液作流动相时 其pH应在4 8之间 Si O Si R 不水解 热稳定性好 在pH2 8范围内对水稳定 化学键合固定相 返回 54 离子交换色谱 固定相 阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂 流动相 阴离子离子交换树脂作固定相 采用酸性水溶液 阳离子离子交换树脂作固定相 采用碱性水溶液 基本原理 组分在固定相上发生的反复离子交换反应 组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径 电荷 存在形式等有关 亲和力大 保留时间长 阳离子交换 R SO3H M R SO3M H 阴离子交换 R NR4OH X R NR4X OH 应用 离子及可离解的化合物 氨基酸 核酸等 返回 55 固定相 按固定相制作方法可分为 多孔型离子交换树脂 包括微孔型和大孔型 表面多孔型 包括薄膜型 离子交换树脂 离子交换键合型 56 流动相 离子交换