分子实验PCR修改稿.doc

实验一 PCR一 . 原理：PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。二 设备： 微量移液器（10l）；离心机(Eppendorf centrifuge 541B)；PCR仪（Bio-Rad S10000TMThermal cycler）三 耗材：吸头，1.5ml，200l PCR八连管，四 试剂和配制方法：上游引物，下游引物，模板质粒，灭菌去离子水， Kit：天根生化 2Pfu Master Mix Kp201（含有pfu DNA聚合酶，dNTPs，镁离子，反应缓冲液，PCR反应的增强剂，loading buffer）。五 步骤： 1依次在管中加入：（25l PCR体系）按照kit的说明书： Primer 1(10uM) 1lPrimer 2(10M) 1l2Master Mix 12.5lddH2O 9.5lTemplate 1l注：空白对照不加模板；其余先加ddH2O，最后加模板。注意加样顺序：ddH2O，Primer，2Master Mix，Template。2 瞬离，将样品甩至管底。3PCR参数： 94 5min 35(94 25sec - 60 25sec - 7230sec)- 72 20min（第一个10min后每管加1l的普通Taq，然后继续72 10min）若无需加A尾，只需72 10min4. 立即电泳或保存于4注意事项：PCR只需几个DNA分子作模板就可大量扩增，应注意防止反应体系被痕量DNA模板污染和交叉污染，假阳性结果往往来自痕量污染和交叉污染，尤其在待扩增靶序列浓度低的情况下，更有必要采取防备措施。（1）DNA处理最好用硅烷化塑料管以防粘附在管壁上，所有缓冲液吸头、离心管等用前必须高压处理，常规消耗用品用后作一次性处理，避免反复使用造成污染。 (2）PCR在超净台内进行，操作前后紫外灯消毒。超净台内设内供PCR用微量离心机、一次性手套、整套移液器和其它必须品；移液品用一次性吸头和活塞的正向排液器，防止移液器基部污染。（3）PCR操作应戴手套并勤于更换。（4）成套试剂，小量分装，专一保存，防止它用。配制试剂用新器具，用后作一次性处理。（5）试剂管用前先瞬时离心（10s），使液体沉于管底，减少污染手套与加样器机会。（6）最后加模板DNA（包括在石蜡油后），马上盖好，混匀，瞬时离心（10s），使水相与有机相分开。加入模板且忌喷雾污染，所有非即用管都应盖严。加模板DNA后应更换手套。（7）实验设阳性、阴性对照（8）如要配多个管，配反应体系时应先在一个管中把所有共同的试剂混在一起，再分装到每个小管中，然后再加各自不同的模板或引物，这样省时省力，均一性好。问题及解决办法：1、出现假阳性的问题：实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。造成假阳性的原因包括样品污染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染等。常见的污染来源包括实验室环境、加样器、操作中形成的喷雾、 DNA抽提仪器、试剂及任何与扩增产物接触的东西。解决办法：(1)工作区隔离。(2)改进实验操作，如在加样过程中避免试剂飞溅、吸头离心管使用高压处理、试剂分装成小份一次使用后弃去等。(3)操作程序合理化，如后加阳性对照等。2、假阴性的问题：如果实验中设置的阳性对照未能扩增成阳性结果，提示本次实验中可能有假阴性结果。造成假阴性的原因包括: (1) DNA 抽提过程不当。 (2) DNA 样品中含有 Taq 聚合酶抑制剂，如尿素、 DMSO 、SDS 等物质，可抑制 Taq 酶活性， DNA 样品中的蛋白质和重金属离子等亦影响 Taq 酶活性，尤其是含有较多脓液或分泌物的标本，其中虽有待查菌，但却因标本处理不当而出现假阴性。 设置内对照是判断假阴性较好的指示系统。在每一反应管中加入内对照，若内对照未能扩增出来，说明该反应管的结果可能有问题。3.不出现扩增条带：（1）引物：引物质量是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。解决办法：选定合适的引物合成单位；引物的浓度不仅要看OD值，最好用引物原液做琼脂糖凝胶电泳，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应与引物合成单位协商解决，如一条引物亮度高，一条引物亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度；引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏而导致变质降解失效；引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。（2）Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。（3）靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。4.出现非特异性扩增带：（1）PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带出现的原因：一是引物与靶序列不完全互补，或引物聚合形成二聚体；二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。（2）其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。解决办法：必要时重新设计引物；减低酶量或调换另一来源的酶；降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数；适当提