技术方法名称 RT-PCR.doc

技术方法名称 RT-PCR（定性、半定量）基本原理 逆转录PCR（reverse transcriptase-PCR，RT-PCR）是一种从RNA扩增cDNA拷贝的方法。目前有关RT-PCR的多种变异类型的报道文献已经很多，并且它们有自己的字母缩写形式。尽管其技术细节从不同来源文章略有差异，但是基本的概念是稳定与相对简易的：首要步骤为酶促催化使RNA（总RNA或poly(A)+ RNA，但当应用RT-PCR检测基因的表达强度时，最好以总RNA作为模板，目的是尽量保持样品的真实性）逆转录为cDNA第一链。一条寡聚脱氧核苷酸引物（随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）先与RNA杂交，然后由RNA依赖的DNA聚合酶催化合成互补的cDNA拷贝，后者能进一步用于PCR扩增。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测多个mRNA时比较有用。然而一步法RT-PCR具有其他优点。一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。一步法可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，这是因为整个cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法RT-PCR，一般使用反义的基因特异性引物起始cDNA合成。两步法步骤一步法步骤起始第一链cDNA合成使用：起始第一链合成使用Oligo(dT)GSP引物随机六聚体GSP引物优点优点灵活方便引物选择扩增酶同逆转录酶预先混合扩增酶的选择转管步骤少，减少污染可能性困难RT-PCR的优化能力高灵敏度同Platinum酶结合提高特异性适用于大量样品分析同Platinum Pfx Taq DNA聚合酶结合提高忠实性适用于定量PCR适用于在单个样品中检测几个mRNA关于扩增酶和产物大小应注意：对于小于4kb的产物使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶对于小于12kb的产物使用Platinum Pfx Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity对于大于12kb的产物使用ELONGAE Enzyme Mix对于一步法RT-PCR，如果产物小于3.5kb，使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶；如果产物小于9kb，使用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。用途及受限因素 1. RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。从RNA水平对基因的表达进行检测或定量。2. 此外，RT-PCR对于获得与克隆mRNA的5、3末端序列和从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库方面都是极其灵敏与通用的方法。此外，RT-PCR还易于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性。3. RT-PCR是以RNA为模板，前提是基因有转录。然而，许多基因的转录表达具有组织特异性。而且，许多基因的丰度很低，不易检测。所以这些都使得RT-PCR的应用受到一定的限制。实验材料1. 耗材离心管（规格：0.5 ml）、Tip（规格：0.2 ml）。要求 无RNase和DNase污染。处理方法 一般来说，未开封的进口离心管或Tip均无RNase和DNase污染。但为了慎重起见，需要重新处理。处理程序如下：洗涤饭盒、烧杯和量筒，使之干净 干烤，250 4h，或180 8h以上。干烤时，量筒和烧杯口均需要用铝箔纸 量筒量取无菌去离子水（最好是新鲜制备的水），在烧杯中配制含0.1%DEPC的水溶液，配制时要求混匀，因为DEPC难溶于水 DEPC水溶液加到干烤过的饭盒中，一般需要1.2L，投入适量的离心管和Tip，并尽量使它们均浸泡在水溶液中 37过夜 尽可能地倒去浸泡液，注意不要开盖，以避免RNase的污染 高压蒸气灭菌，15 lbf/in2,（1.034105Pa），20min 烘干，100 2h 置于干净的环境，备用 2. 试剂逆转录酶Taq酶及其缓冲液基因特异性引物Oligo(dT)12-18，或随机引物，或基因特异性引物（GSP）10mM dNTP Mix逆转录缓冲液0.1M DTTRNase抑制剂无菌去离子水所有与逆转录有关的试剂均要求无DNase和RNase污染。基因特异性引物一般由博亚、生工等国内公司合成，PAGE纯化，并用无DNase和RNase的无菌去离子水溶解。Oligo(dT)12-18或随机引物、dNTP Mix、逆转录酶（一般同时带有逆转录缓冲液和DTT）、Taq酶、RNase抑制剂为进口试剂，生产公司有Promega、Invitrogen等。3. 特殊设备自动微量移液器PCR仪实验设计按照逆转录合成cDNA的方法（见其它实验手册）合成cDNA，同时设立阳性对照和阴性对照。阴性对照指样品在RT-PCR实验中不加逆转录所必需的成分，可以设立3支对照管，在一支对照管中加入合成第一链cDNA反应所需要的所有试剂，但不加模板RNA；第二支对照管加入除了逆转录酶外的所有试剂；第三支对照管加入除了引物外的所有试剂。阳性对照的设置则比较复杂，许多研究者倾向于不设这样的对照。为了提高RT-PCR的敏感性，需加热灭活逆转录酶，或酚氯仿抽提去除逆转录酶，或RNaseH水解cDNA-RNA杂交分子中的RNA。合成的cDNA按照PCR反应体系的1/10，与其它成分混匀后进行PCR反应。当应用RT-PCR检测基因的表达时，需要设立内参照。一般来说，内参照为看家基因，较常用的有G3PDH、-actin、tublin等。理论上，内参照与目的基因的扩增应该在同一个反应中进行。为此，对引物设计的要求比较高，即两对引物的熔解温度相近，同时避免两对引物之间发生相互作用。只有当内参照与目的基因的扩增均在平台期之前，才能通过目的基因扩增的产物量与内参照的比例来评价目的基因的相对表达强度。因此，先设立循环数梯度分别扩增内参照和目的基因，确定它们的最适扩增条件（即PCR反应到达平台期之前PCR产物量达到最大）。在此基础上，适当调整扩增条件，在同一反应中同时扩增内参照和目的基因，确保两个基因的扩增均处于平台期之前，且扩增产物量足够大，并无特异性扩增。操作步骤及每步需注意的事项逆转录合成cDNA参考其它实验手册。设计基因特异性引物设计原则与一般的PCR引物相同，具体如下，也可以参考分子克隆第三版。引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。 具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度，产物长度，序列Tm值，引物与模板形成双链的内部稳定性(用G值反映)，形成引物二聚体及发夹结构的能值，在错配位点的引发效率，引物及产物的GC含量等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6. G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G值相对较高的引物。引物的3端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8. 对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。 值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数商业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以“Premier Primer”为最强且方便使用，“Oligo 6”其次，其他软件如“Vector NTI Suit”、“DNAsis”、“Omiga”和“DNAstar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的值得注意的是，应尽可能确保正反义引物位于不同的外显子上。这样，从cDNA和污染的DNA衍生的扩增产物极易鉴别。然而，用无内含子或内含子很少的基因的转录本作模板不易鉴别从污染的基因组DNA衍生的扩增产物。在这种情况下，RNA样品最好用没有RNase的DNase来处理。cDNA的处理1. RNaseH处理 在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，据认为cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，RNaseH处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cDNA目标模板时，RNaseH处理是必需的，比如低拷贝的tuberous scherosis。对于多数RT-PCR反应，RNaseH处理是可选的，因为95保温的PCR变性步骤一般会将RNA：DNA复合物中的RNA水解掉。2. 纯化cDNA 酚氯仿抽提 样品逆转录后，反应液中的逆转录酶必须使之失活，才能是RT-PCR的扩增阶段能更有效地合成产物。有时，逆转录酶仅用加热法使之失活是不够的。在PCR扩增前，对第一链cDNA用酚氯仿抽提，乙醇沉淀等步骤予以纯化。人们推测，逆转录酶的污染会导致扩增反应效率的降低。3. 例外 当用RT-PCR检测基因的表达强度时，不建议进行上述的处理。因为这些处理可能会导致样品失真。PCR扩增ComponentFinal ConcentrationTemplate1/10 体积的cDNAPrimer 10.1-0.5MPrimer 20.1-0.5M10X Reaction buffer1XMagnesium1.0-3.0mMdNTP mix200 mM each dNTPThermostable DNA polymerase1-4 units/100 ml reaction1. 变性温度和时间当核酸所处的缓冲液离子强度低于150mM NaCl时，溶解温度一般低于100。这就是PCR变性温度介于91-97的缘故。Taq酶在95的半衰期大约为30 min，这就是PCR循环数一般不超过30个的部分原因。然而，可以在10个循环之后降低变性温度，因为靶DNA的平均长度减小。如果模板小于或等于300 bp，且GC含量为50%，那么变性温度可以降至88，这样就可以进行40个循环的扩增，同时又不会显著降低酶的扩增效率。变性时间是Taq酶丧失活性的主要原因。因此，若缩短变性时间，则不管变性温度是否下调，都可以增加循环数。通常情况下，94下变性1 min即可，对于短的模板，则可以缩短至30 s甚至更少。2. 退火温度和时间退火温度与引物的长度和碱基组成直接相关。首次PCR，采用的退火温度Ta(annealing temperature)比两条引物中最小的Tm低5。Tm的简单计算公式为：Tm = 4(G+C)+2(A+T)。如果每隔一个循环，Ta提高1，那么扩增的特异性和小于1 kb的产物量都将得到提高。如果Ta太低，引物中的一条或两条会与非靶序列退火，因为内部序列中单碱基错配或部分退火是容许的。这种情况有利于扩增相似或相关序列，但是它会导致非特异性扩增，从而降低目的产物的量。如果Ta太低，会导致扩增产物的量大大减少，因为引物退火的可能性下降。另外一个值得考虑的重要因素是，如果两条引物的Ta相差太大，将导致目的产物的量严重下降，甚至会引起不对称或单链扩增。对于退火时间，除非Ta与Tm很接近，或者引物太长，否则大多数引物在30 s或更短的时间内即可高效退火。3. 延伸温度和时间通常情况下，延伸的温度和时间分别是70-72 和0.5-3 min。实际上，普通的Taq酶在37下就有特异性活性，这与大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段相似。因此，在退火的同时，延伸反应也在进行。虽然退火是短暂的，但伴随的延伸反应大大提高了模板与引物杂交分子的稳定性，这也使得延伸可以在更高的温度下进行。70下Taq酶的活性达到最佳，延伸速率大约为100 bp/s。延伸1 min足以扩增2 kb的片段。更长片段需要更长的延伸时间，对于3 kb和更长的片段，需要3 min。当PCR反应后期扩增产物的浓度超过酶浓度，dNTP和（或引物）因消耗而成为限速因素时，延长延伸时间将有利于扩增。4. 循环数扩增条带在胶上可见时所需的扩增循环数很大程度上取决于靶DNA的起始浓度。当靶DNA只有5个分子时，建议扩增40-45个循环，当靶DNA有3105个分子时，则需要扩增25-30个循环才能得到相同的产量。这种非线性主要是由平台效应引起的。反应物（dNTPs, 酶）的降解，反应物（引物、dNTPs）的损耗，终产物的抑制（形成焦磷酸盐酯），与非特异扩增产物竞争反应物，模板与高浓度的扩增产物退火从而抑制模板与引物的结合，所有这些都导致平台效应的产生。如果扩增30个循环也未见目的条带，那么可以取1 ul扩增产物重新建立反应体系，再扩增20-30个循环。当模板的浓度受限时，与纯粹增加循环数相比，采用这种方法可以得到很好的结果。另外一种可行的方法是巢式PCR，即先用一套引物扩增，然后取部分扩增产物直接（或通过纯化去除反应物）进行第二轮扩增，采用的引物则位于内部，示意图如下。巢式PCR增加了特异性，因为第一轮PCR产生的非特异性扩增产物在第二轮PCR中得不到扩增。本图显示巢式PCR对系列梯度稀释的CAV DNA(Chicken anaemia virus)的扩增结果。从图中可以看出，第一轮PCR(PCR1)可以检测到1000个模板分子，而两轮扩增(PCR2)则可以检测到1个模板分子。结果观察及分析的原则1. 定性RT-PCR1) 与阴性对照（包括逆转录和PCR扩增两种阴性对照）作比较。只有当阴性对照中无相应的扩增条带时，才能进行进一步分析。2) 与Marker作比较，确定扩增条带的大小。当扩增条带的大小与预期大致相符时，可以初步判定扩增条带为目的条带。3) 通过相关软件分析扩增产物的限制性酶切位点，选定相应的限制性内切酶。回收PCR产物，进行酶切反应。当PCR产物内部存在相关的酶切位点时，可以进一步判定扩增条带为目的条带。（可选）4) 制备特异探针，行Southern Blot。当扩增条带的杂交信号为阳性时，则可以进一步判定扩增条带为目的条带。（可选）5) 将PCR产物克隆到载体上，转化宿主菌，筛选重组子，测序，或PCR产物直接测序。通过序列比对，即可确定扩增条带为目的条带。2. 半定量RT-PCR1) 采用各种方法判定扩增条带为目的条带，判定方法见定性RT-PCR。2) 只有当无非特异扩增条带时，才能进行半定量分析。3) 通过软件分析，得出每条扩增条带的强度和面积，计算它们的乘积。根据目的基因扩增条带强度和面积的乘积与内参照的比值，即可计算出该基因的相对表达强度。实验成功或失败的关键因素实验成功或失败的关键因素1. 逆转录合成cDNA 详见技术方法“逆转录合成c