基因编辑技术PPT课件.ppt

基因编辑技术的发展 1 通过精确识别靶细胞DNA片段中靶点的核苷酸序列 利用核酸内切酶对DNA靶点序列进行切割 从而完成对靶细胞DNA目的基因片段的精确编辑 基因编辑定义 2 第一代 ZFN 锌指核酸酶 1996年 第二代 TALEN 转录激活样效应因子核酸酶 2011年 第三代 CRISPR Cas9 成簇的规律性间隔的短回文重复序列 2013年 第四代 NgAgo gDNA 韩春雨 2016 四代基因编辑技术 3 第一代 锌指核酸酶 Zinc fingernucleases ZFN 4 ZFN组成 ZFN DNA识别域 核酸内切酶DNA识别域 由一系列Cys His锌指蛋白 zinc fingers 串联组成 3 4个 每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基 核酸内切酶FokI 非特异性核酸内切酶FokI 形成二聚体时切割双链DNA 锌指蛋白 5 DNA识别域能识别特异位点并与之结合 而由Fok 构成的切割域能执行剪切功能 两者结合可使靶位点的双链DNA断裂 DSB 于是 细胞可以通过同源重组 HR 修复机制和非同源末端连接 NHEJ 修复机制来修复DNA HR修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰 而NHEJ修复极易发生插入突变或缺失突变 两者都可造成移码突变 因此达到基因敲除的目的 ZFN的工作原理 6 ZFN诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种及基因位点 具有较好的发展潜力 但是目前有3个方面的缺陷制约了该技术的推广 1 以现有的策略设计高亲和性的ZFN 需要投入大量的工作和时间 2 在细胞中持续表达ZFN对细胞有毒性 3 虽然三联体设计具有一定特异性 但仍然存在不同程度的脱靶效应 ZFN的特点和不足 7 第二代 转录激活样效应因子核酸酶 transcriptionactivator like TAL effectornucleases TALENs 8 TALEN的组成 TALEN DNA识别域 核酸内切酶DNA识别域 由一系列TALE蛋白串联组成 20个左右 每个TALE蛋白识别并结合一个对应的碱基 核酸内切酶 非特异性核酸内切酶FokI 形成二聚体时切割双链DNA 9 TALEN技术原理 TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶 它借助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对 TAL效应子可被设计识别和结合所有的目的DNA序列 对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割 从而导入新的遗传物质 10 TALEN已经成功应用于酵母 哺乳动物和植物的位点特异性基因打靶 与锌指核酸酶系统相比有较大的应用优势 设计更简单 特异性更高 但仍然有些问题需要解决 如脱靶效应 TALEN与基因组进行特异结合与染色体位置及邻近序列有关等 TALEN的特点和不足 11 第三代 成簇的规律性间隔的短回文重复序列 12 CRISPR cas系统的发现 1987年发现苗头 大阪大学研究者对一种细菌碱性磷酸酶基因研究中发现 其基因编码区域附近存在一小段简单重复的DNA序列片段 但不太清楚其生物学意义 随后十年不断确认 约40 细菌和90 古细菌基因末端 有多组DNA序列 反向序列 约30bp空格序列 spacerDNA 组成成簇的 规律间隔的短回文重复序列 被称为CRISPR 2005年提出假说 CRISPR中空格DNA能与噬菌体DNA序列互补匹配 细菌CRISPR序列可能与细菌的免疫保护机制相关 细菌转录形成RNA后与入侵的外源噬菌体DNA结合 起到类似RNA干扰的作用 13 2007年实验验证 Danisco公司的Barrangou和Horvath等发现 通过插入或删除嗜热链球菌 乳酸菌 中几个CRISPR序列的空格DNA片段 就可以改变细菌对噬菌体的免疫力 Science 2007 德国学者机制研究 Helmholtz Doudna和 Charpentier分别对不同的CRISPR及相关系统进行了研究 阐明了DNA空格序列在细菌免疫防御中的机制 目前已经发现了3种CRISPR Cas系统 其中依赖Cas9蛋白的CRISPR系统更简单 CRISPR cas系统的发现 14 15 CRISPR Cas9系统组成 CRISPR Cas系统是细菌和古细菌中免疫系统 对付攻击者的基因武器 CRISPR序列 包括空格序列 成簇的 规律间隔的短回文重复 ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeatSequences Cas CRISPR相关基因 CRISPR associatedgenes 16 RISPR Cas系统由Cas9核酸内切酶与sgRNA构成 转录的sgRNA折叠成特定的三维结构后与Cas9蛋白形成复合体 指导Cas9核酸内切酶识别特定靶标位点 在PAM序列上游处切割DNA造成双链DNA断裂 并启动DNA损伤修复机制 从不同菌种中分离的CRISPR Cas系统 其CrRNA 或者是人工构建的sgRNA 靶向序列的长度不同 PAM序列也可能不同 CRISPR Cas9的工作原理 17 三代主流技术对比 相关视频 18 第四代 NgAgo gDNA技术 19 文章的发表 CNS 2016年5月2日 河北科技大学的韩春雨与合作者的文章在被 Science 审稿小半年后被拒 历时9个月终被 NatureBiotechnology IF 42 接收并发表 沈啸 左 韩春雨 中 高峰 右 20 NgAgo gDNA技术原理 NgAgo gDNA技术是以DNA作为引导工具的基因编辑技术 NgAgo gDNA技术的工作原理与CRISPR Cas9技术有些类似 都是在引导工具的引导下 令核酸酶对特定位点的基因序列进行切割 从而进行基因编辑 不同的是NgAgo gDNA技术中所用到的引导工具是一段引导DNA gDNA 而不是CRISPR Cas9技术中的RNA 由于也不需要通过蛋白 如锌指蛋白 来寻找需要替换的序列 因此 NgAgo gDNA技术与CRISPR Cas9技术一样 较之前的基因编辑技术 在操作上要简单方便得多 利于其在应用中的推广 21 NgAgo gDNA的优势 1 向导设计制作简便 可以像合成PCR引物一样合成短单链DNA向导 向导可直接转染细胞和组织而无需构建向导表达载体 由于向导核酸是DNA而非RNA 因此避免了RNA易于形成复杂的二级结构而带来的失效或者脱靶效应 2 可编辑基因组内任何位置 Cas9基因组的靶点选择受到PAM区和富含GC区的限制 而NgAgo对靶点选择没有限制 对基因组任何位置都能有效引入双链断裂 22 3 新的基因编辑工具精确性更高 脱靶率更低 李伟介绍 NgAgo要结合24个碱基 比Cas9结合的19个碱基要长5个碱基 理论上其精确性会提高1024倍 4 韩春雨团队就是利用格氏嗜盐碱杆 Natronobacteriumgregoryi 的Argonaute蛋白实现了DNA引导的基因组编辑 并发现NgAgo作为一种DNA介导的核酸内切酶 适合在人体细胞 37 中进行基因组编辑 大大扩充了基因编辑的取材范围 NgAgo gDNA的优势 23 同行评价 自然 杂志执行主编尼克 坎贝尔评论说 虽然这项新技术还处于初期 但有一些理由让我们相信它与现在普遍使用的 技术相比有多种优势 特别是在更精准的基因编辑方面 韩春雨的工作是国际一流的技术推进 北京大学理学部主任 生物学家饶毅教授如此评论 他担任主编的科学类新媒体 知识分子 刊文 介绍了这项成果的学术细节和价值 24 相关争议 2016年7月29日 澳大利亚国立大学研究者盖坦 布尔焦称 尽管他和同事在过去的一个月做了多次尝试 但最终发现 NgAgo无法进行基因编辑 2016年8月8日 自然 杂志网站发表一篇报道 指出 来自澳大利亚 西班牙等国的科研人员表示实验不可重复 另有一些科学家表示曾重复出韩春雨的部分实验 但还需进一步确认2016年10月11日 河北科技大学副教授韩春雨接受科技日报记者采访 回应无法重复他的NgAgo实验 他依然认为 别人重复不了