（微生物学专业论文）耐酸性α淀粉酶产生菌株的选育和发酵产物初步分析.pdf

四川大学硕士论文 声明 文献综述微生物一淀粉酶的研究进展 l前苦 2 a 一淀粉酶来源 3 a 一淀粉酶分子生物学 4 淀粉酶的生产 5 c t 一淀粉酶纯化和酶的特性， 6 特殊1 7 1 一淀粉酶， 7 我国的淀粉深加工工业与耐酸性n 一淀粉酶 8 展望 参考文献 图形目录 图l ：a s a 一1 菌株在筛选培养基产生的透明圈 图2 ：a s a 一1 菌株的扫描电镜照片 图3 ：a s a u d 8 6 菌株生长曲线 图4 ：种龄及接种量对产酶的影响 图5 ：培养基含水量对a s a - u d 8 6 菌株产酶的影响 图6 ：培养基p h 值对产酶影响 图7 ：三角瓶固态发酵产酶曲线 图8 ：耐酸性a 一淀粉酶的盐析曲线 图9 ：a s a - - u d 8 6 菌株耐酸性a 一淀粉酶同工酶 图1 0 ：不同p h 值底物溶液孵化结果 图l l ：复合酶稳定性分析 图1 2 ：复合酶最适p h 值分析 图l 3 ：复合酶最适温度分析，。 图1 4 ：t i mb a r r e lo f 2 t a a ( t a k a a m y l a s e ) 一 图1 5 t i mb a r r e lo f 2 a a a ( a c i d a m y l a s e ) i i 盯弘舛，。犍鼹的 m加趴船孔弘撕弱弱盯卯勰们“ 四川大学硕士论文 耐酸性q 一淀粉酶产生菌株的选育 和发酵产物初步研究 微生物学专业( 工业微生物) 研究生：胡欣洁指导教师：胡承副教授 摘要 从醋醅中分离筛选到一株产耐酸性a 一淀粉酶的野生菌a s a 一1 ， 经初步鉴定为假丝酵母属的水生假丝酵母( c a n & d aa q u a t i c a ) 。经 三角瓶固态发酵实验证明其耐酸性d 一淀粉酶活性为3 0 6 u g 。以 a s a l 为出发菌株，通过紫外诱变( u v ) 和硫酸二乙酯( d e s ) 复合诱变， 产生可遗传变异。以致死率为8 0 的剂量对a s a l 进行第一轮紫外诱 变，从大量的突变菌株中筛选出多株正变菌株，在以致死率8 0 为剂 量标准进行硫酸二乙酯( d e s ) 一紫外( u v ) 复合诱变。从1 4 0 多株突变株 中筛选到一株耐酸性n 一淀粉酶高产菌株，三角瓶固态发酵实验表明 该突变菌株产酶能力与出发菌株相比提高了近4 倍，该突变菌株编号 为a s a u d 8 6 。 以突变菌株a s a u d 8 6 为出发菌株，对其发酵条件进行优化，发 现该菌株最适产酶条件为：培养基以麦麸为主要原料，按照麦麸：豆饼 粉的比例为1 ：0 5 加入豆饼粉补充氮源，培养基固态物与水的比例为 l ：1 2 ，自然p h 值，培养温度为3 0 。 四川大学硕士论文 水生假丝酵母a s a u d 8 6 的培养浸泡液经硫酸铵分段盐析得粗酶， 经耐酸性n 一淀粉酶同工酶电泳分析后发现，在水生假丝酵母 a s a u d 8 6 的发酵产物中有三种酶具有耐酸性a 一淀粉酶活性。 关键词：耐酸性c l 一淀粉酶水生假丝酵母复合诱变发酵条件 产物分析 四川大学硕士论文 s c r e e n i n go fa a c i d s t a b l e a - - a m y l a s ep r o d u c i n g s t r a i na n d s t u d yo n i t sf e r m e n t a t i o np r o d u c t s m a j o r ：m i c r o b i o l o g y g r a d u a t es t u d e n t ：h ux i n j i et u t o r ：h uc h e n g a b s t r a c t as t r a i np r o d u c i n ga c i d s t a b l ea - - a m y l a s ew a si s o l a t e df r o m v i n e g a r f e r m e n t a t i o nm e d i u mo f ac o n d i m e n tf a c t o r y i tw a si d e n t i f i e da sc a n d i d a a q u a t i c aa n dw a sc a l l e da s a - 1 t h r o u g hs o l i df e r m e n t a t i o n ，w ek n e w t h a tt h ee n z y m ea c t i v i t yo fa s a - lw a s3 0 6 u g a f t e rs o m ec o m p l e x m u t a g e n e t i ct r e a t m e n to ns t r a i n sa s a - l ，as t a b l em u t a n ts t r a i nw i mh i 曲 y i e l do fa c i d s t a b l ea - - a m y l a s ew a so b t a i n e d f i r s t ，u s i n gad o s a g ew i t had e a t h r a t eo f8 0 ，t h es t r a i na s a - 1w a st r e a t e db yu va n dw e l e c t e ds o m em u t a n t s t r a i n s s e c o n d ，u s i n g a d o s a g e w i t ha d e a t hr a t eo f 8 0 t h e m u t a n ts t r a i n s w e r e t r e a t e db yd e s - u v ，w eo b t a i n e dam u t a n tc a l l e da s a u d 8 6 ，w h i c hh a sa h i g h o u ta c i d - s t a b l ea - - a m y l a s e t h ee n z y m ea c t i v i t yo fa s a u d 8 6r o s eu pt o 1 4 6 u ga sc o m p a r e dw i t h3 0 6 u go f t h eo r i g i n a ls t r a i n t h es o l i d s t a t ef e r m e n t a t i o nf o rp r o d u c t i o no f a c i d s t a b l ea - - a m y l a s ew a s s t u d i e di nw h e a tb r a nm e d i u m t h ep r o p o r t i o no fb r a nt ob e a nc a k ei sl ：o 5 ：t h e p r o p o r t i o no fs o l i d t o w a t e r i s l ：1 2 i n i t i a lp h i s n a t u r a la n d i n c u b a t i o n t e m i s3 0 c t h ep r e c i p i t a t eo f t h es o a k e ds u s p e n s i o nw a sd i s s o l v e di n t o0 1 ma c e t a t eb u f f e r 四川大学硕士论文 ( p h 4 0 1c o n t a i n i n go 5 n a c i t h er e s u l to fa c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i ss h o w e d t h a tt h ec r u d ee n z y m ei n c l u d e dt h r e ei s o e n z y m e s k e yw o r d s ： a c i d s t a b l e 一a m y l a s e ：c a n d i d aa q u a t i c a ：m u t a g e n e s i s ；f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n ；a n a l y s i so f f e r m e n t a t i o np r o d u c t i o n 4 四川大学硕士论文 耐酸性q 一淀粉酶产生菌株的选育 和发酵产物初步研究 h u舀 淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称，广泛存在于动植物和微生 物中。也是最早实现工业生产并且迄今为l 用途最广，产量最大的酶 制剂品种人类对淀粉酶的应用开始于几千年前，但是酶提取出来使用 是从十九世纪开始的。1 8 3 3 年，p a y e r 从麦芽提取液中加酒精沉淀获 得淀粉酶，1 8 9 6 年日本人高峰让吉用麸皮培养米曲霉，用水提取再以 酒精沉淀得到淀粉酶作为消化剂，并在美国设厂从事微生物酶的生产 和研究。1 9 2 0 年左右，法国人b i o d i n 和e f f r o n t 等又先后发现枯草打 菌可以分泌耐热并且活性更高的n 一淀粉酶，于1 9 2 6 年在德国设厂 生产，为微生物酶的工业生产奠定了基础。在工业高度发达的今天， 淀粉酶占据了工业化酶制剂市场约2 5 的市场份额”。 n 一淀粉酶已经发展成为一个庞大而重要的工业酶制剂家族 f l l s l ，随着工业的不断发展，淀粉酶的应用领域也在不断拓宽，因此特 殊条件生产下就需要特殊的淀粉酶种类。这就为特殊淀粉酶研究提供 了现实需要。对耐热型a 一淀粉酶“，耐碱性n 一淀粉酶“，耐酸性 n 一淀粉酶非常活跃。 耐酸性淀粉酶因其能在极端酸性环境中保持较高活性而受到研 究者的注意，日本以其传统烧酒和清酒工艺为研究重点，是研究耐酸 性淀粉酶较早的国家。1 9 6 2 年，山田指出黑曲霉产生的耐酸性n 淀 粉酶的最适p h 值是4 0 。随后不断从白曲霉发酵产物中分离纯化出 在酸性条件下能保持高活力的耐酸性a 一淀粉酶“l i l t 2 1 。 四j l 大学硕士论文 在我国淀粉深加工工业是农副产品升值的重要途径，其进行的基 础是淀粉质原料的水解，在传统的工业中一般分为液化和糖化两个阶 段进行，由于工业所采用的n 一淀粉酶和糖化酶作用p h 值有差异， 生产过程中不但增加了生产成本，而且影响液化糖化效果，直接影响 下游产品质量，研究和开发在酸性条件下能保持高活性的耐酸性。一 淀粉酶，简化液化，糖化过程，降低淀粉深加工生产成本具有现实意 义。 本研究论文采用菌株是从醋醅中分离得到的一株可以产耐酸性 n 一淀粉酶的野生菌株主要从( 1 ) 复合诱变选育耐酸性a 一淀粉酶 高产菌株( 2 ) 菌株发酵条件和发酵产物分析两个方面进行研究。 四j i i 大学硕士论文 材料与方法 1 实验材料 1 1 样品来源 淀粉厂附近酸性土壤，酒糟，醋醅，黄水，实验室配置酸性富集 培养基 1 2 培养基。4 1 筛选培养基 玉米淀粉l p h2 5 4 5 种子培养基 蛋白胨o 5 1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0 m i n 可溶性淀粉1 白胨1 酵母膏0 5 p h 4 0 1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0 m i n 斜面培养基 可溶性淀粉l k h 。p 0 30 3 p h4 0 产酶固体培养基 麦麸：水为l ：1 2 自然p h 值 生理生化培养基： g o r o d k o w a 培养基： 葡萄糖0 1 蛋白胨l 蛋白胨0 5 ( n h 。) ：s o 。0 2 5 1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0 m i n 2 s 0 m l 三角瓶装量2 5 9 1 2 1 高压蒸汽灭菌2 0 m i n 。 n a c l1 2 水洗琼脂2 蒸馏水配装管 1 1 5 。c 高压蒸汽灭菌2 0 m i n ，搁置斜面。 k l e y n 培养基： 四川大学硕士论文 k h i p 0 40 0 1 2 k 2 h p 0 4 0 0 2 醋酸钠0 5 葡萄糖0 0 6 2 蛋白胨0 2 5 n a c l0 0 6 2 水洗琼脂2 生物素2 0 微克 每1 0 0 毫升加混合盐1 毫升，蒸馏水配，p h6 9 7 1 ，装管， 1 15 高压蒸汽灭菌2 0 m i n ，搁置斜面。 混合盐溶液： m g s 0 4 7 h 2 00 4 n a c l0 4 ， c u s o d 5 h 2 00 0 0 2 m n s 0 4 。4 h 2 00 2 f e s 0 4 4 h 2 00 2 用蒸馏水配。 马铃薯块培养基： 将马铃薯去皮，切成长条斜面，装入试管( 在试管底部预先垫 上一小团湿棉球) ，1 1 5 c 高压蒸汽灭菌2 0 m i n 。 石膏块培养基： 8 份c a s 0 4 l 2 h 2 0 及3 份水混合，制成楔状斜面置于试管内， 管底部垫有棉花，用稀释的1 5 波林麦芽汁湿润，1 1 5 c 高压蒸 汽灭菌3 0 m i n 。 马铃薯琼脂培养基： 去皮马铃薯2 0 9 ，洗净切成小块，立即放入水中，煮沸3 0 分钟， 经纱布过滤后。滤液加水至1 0 0 升，加入琼脂2 9 ，溶解后分装 试管，1 1 5 高压蒸汽灭菌2 0 r a i n 。 糖发酵基础培养基： 1 2 5 豆芽汁：黄豆芽1 2 5 9 加水l 升，煮沸半小时，过滤后补 足至1 升水，1 1 5 高压蒸汽灭菌3 0 m i n 备用。 同化碳源培养基： 附h 4 ) 2 s 0 40 5 k h 2 p 0 40 1 m g s 0 4 7 h 2 00 0 5 c a c l 2 2 h 2 00 0 1 n a c l0 0 1 不同碳源0 5 酵母膏0 0 2 用蒸馏水配，分装试管。 四j i 大学硕士论文 l1 5 c 高压蒸汽灭菌3 0 r a i n 。 同化氮源基础培养基： 葡萄糖2 k h 2 p 0 40 1 ， m g s 0 4 7 h 2 00 0 5 酵母膏0 0 2 ， 水洗琼脂2 用蒸馏水配， 过滤后装大试管，每管2 0 毫升， 1 1 5 高压蒸汽灭菌1 5 m i n 。 1 3 主要设备与试剂 1 3 1 设备 p h s - - 2 c 酸度计：上海康仪仪器有限公司 光学显微镜：日本o l y m p u s 光学显微镜 扫描电镜：h i t a c h i - - 4 5 0 型 7 2 0 分光光度计：上海第三分析仪器厂 d d y - - i i l 8 型电泳仅：托京六一仪器厂 d y c z 一2 8 a 型电泳槽：北京六一仪器厂 1 3 2 主要试剂 主要试剂均为国产分析纯 2 耐酸性淀粉酶酶活测定n “ 2 1 所用试剂 底物溶液：0 5 可溶性淀粉溶液 原碘液：称取0 5 9 碘和5 0 9 碘化钾研磨溶于少量蒸馏水中，然后定 容到1 0 0 m l 。 稀碘液：取l m l 原碘液稀释1 0 0 倍 2 2 酶液浸出 称取固体培养基5 9 ，加入0 i m o l i 的p h 为4 0 的醋酸一醋酸钠 四川i 大学硕士论文 缓冲液( 0 5 的n a c i ) 2 0 m l 浸泡三小时过滤，3 0 0 0 转，分钟离心 1 5 分钟取上清液。 2 _ 3 测定方法 底物5 m l 在4 0 度水浴预热1 0 m i n ，加入酶液0 5 m l ，准确保温 5 m i n 。用0 1 m o l l 的h c l 终止反应。取0 5 m l 反应液与5 m l 稀碘 液显色，在6 2 0 n m 处测光密度。以0 5 m l 水代替0 5 m l 反应液为空 白，以不加没有( 加同体积的缓冲液) 为对照。 酶活力根据下式计算 酶活力( u g ) = ( r o - - r ) r o 5 0 x d 4 式中、r 分别表示对照和反应液的光密度，d 为酶液的稀释倍数。 调箍d 使( r o r ) 在0 2 o 7 之间。 酶活定义：在4 0 、1 3h = 4 0 五分钟内水解l m g 淀粉的酶量为一 个活力单位 3 耐酸性淀粉酶产生菌的筛选与鉴定“”3 1 3 1 耐酸性a 一淀粉酶产生菡的筛选 将不同样品分别经无菌水处理后，稀释成不同浓度梯度的样品溶 液，将溶液涂布于筛选培养基平板上( p h 梯度为2 0 4 5 ) 进行培 养，将菌落周围形成明显透明圈的菌株挑选出来进一步分离纯化。 3 2 耐酸性a 一淀粉酶产生菌的初步鉴定 采用形态观察和生理生化实验相结合的方法，根据形态学特征与 生理生化特征进行分类鉴定。 3 2 1 形态观察 光学显微镜观察美蓝水浸片，碘液水浸片。 扫描电子显微镜制片方法： 1 菌液用0 i m o l l 磷酸缓冲液( p b s ) ( p h 7 2 ) 洗三次 四川i 大学硕士论文 2 最后一次悬于适量的p b s 中。浓度以滴在3 4 m m 2 小玻片 上密度均匀，菌落不重叠为宜( 稍多为宜，因为在固定和脱 水过程中要掉许多) 。 3 将菌悬液稀释到适当浓度后，滴在小玻片上室温静止十分 钟。 4 细胞面朝上把玻片放入小称量瓶底部，用吸管沿瓶壁缓慢加 入1 冷却的戊二醛溶液，加的量只要淹过样本即可，4 。c 固定过夜。 5 用p b s 液洗三次。 6 逐级脱水：3 0 5 0 ，7 0 ，8 5 ，9 5 乙醇各一次， 1 0 0 两次，每次l o 一1 5 r a i n 。 7 用醋酸异戊酯逐级替换乙醇：3 0 ，5 0 ，7 0 ，8 5 ， 9 5 醋酸异戊酯各一次，1 0 0 砖次，每次l o 1 5 m i n 。放 入临界点干燥仪进行干燥。 8 以碳，金分别喷镀。 取出样品，扫描电镜观察。 4 复合诱变”“” 从自然条件下筛选的野生菌株普遍存在酶活低的现象，不适合工 业生产要求，通过各种方式的人工诱变获得高产菌株是科研工作和工 业生产上常用的方法。采用紫；, t - 0 r v ) 诱变和硫酸二乙酯( d e s ) 复合诱 变的方法获得突变菌株。 4 1 菌液制备 利用接种环挑取斜面培养基上处于生长对数期的菌体转入1 0 m l 无菌生理盐水中，充分振荡后，稀释菌液到菌体浓度约为1 0 8 个m l ， 以此作为待处理的菌悬液。 4 2 紫外光诱变 四j i i 大学硕士论文 取上述菌液5 m l ，倾入直径为9 c m 底部平整的平皿中。先预热紫 外灯3 0 m ir l ，然后开启平皿盖，在磁力搅拌器缓慢搅拌条件下，紫外 光垂直距离3 0 c n m 照射o s ，3 0 s ，6 0 s ，9 0 s ，1 2 0 s ，1 5 0 s ，1 8 0 s 。做 梯度稀释，取0 1 m l 涂筛选平板，3 0 c 避光培养，统计诱变致死率。 未照射菌数m l 一接受照射菌数m l 诱变致死率= 未接受照射菌数m 选择致死率为8 0 左右的剂量处理样品。 x 1 0 0 4 3d e s u v 诱变 经紫外诱变后的正变株磷酸缓冲液制备菌悬液，取5 m l 与浓度为 2 的d e s 溶液混合，在3 0 振荡0 ，2 ，4 ，6 ，8 ，1 0 分钟，加入2 n a ：s 。0 。终止反应，然后在紫外灯下照射1 5 0 s 。做梯度稀释，取0 1 m l 涂筛选平板，梯度稀释后涂平板3 0 避光培养。 诱变存活率计算方法同上，选择致死率为8 0 左右的剂量处理 样品。 4 4 筛选方法 4 4 1 初筛方法：用无菌牙签从筛选平板上挑取单菌落并点种在新 的筛选平板上，3 0 培养一定时间后，根据筛选平板培养基上水解透 明圈与菌落直径比值( h c ) 的大小初步比较酶活。 4 4 2 复筛方法：经初筛后，选取酶活较高的菌株经过固态发酵后测 定酶活。 4 4 3 筛选标准： 与出发菌株相比，相对酶活9 0 的为负突变株；相对酶活1 1 0 的为正诱变株；而相对酶活在9 0 1 1 0 之间的则视为非诱变株。 四川大学硕士论文 5 发酵条件的研究” 5 1 生长曲线测定 2 5 0 m l 三角瓶盛放5 0 m 1 种子培养基，从斜面接入l 环菌体置于 旋转式摇床上，2 0 0 r m i n ，3 0 c 培养，每隔6 小时以空白培养基做对 照，用7 2 1 型分光光度计于6 6 0 m n 下测定光密度。 5 2 培养条件 优化出发菌株在斜面上活化一代，然后挑接一环接入种子培养 基3 0 条件下，摇床培养一定时间，再按一定接种量接入三角瓶 固体发酵培养基。 5 ，2 1 培养基优化 固体发酵培养基采用麦麸作为主要原料，考查碳氮比例对菌体产 酶的影响。 5 2 2 培养条件优化 培养条件对菌体生长和酶的产生具有重要影响，培养条件优化包 括种子种龄和接种量的确定，培养基起始初始含水量确定，培养温度 以及培养基起始p h 值的确定。 6 发酵产物分析n ”n 6 1 淀粉酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳 6 1 1 有关试剂配制 ( 1 ) 丙稀酰胺( a c r ) 凝胶贮液：3 0 0 9 a c r ，0 8 b i s ，加水至1 0 0 m l ( 2 ) 分离胶缓冲液：4 8 m l i nk o h ，1 7 2 m l 冰醋酸，加水到1 0 0 m l ， p h 至4 3 ， ( 3 ) 浓缩胶缓冲液：4 8 m l l nk o h ，2 8 7 m l 冰醋酸，加水到1 0 0 m l ， p h 至6 7 。 ( 4 ) 1 0 过硫酸铵( a p ) 溶液：i g a p 加水9 m l 。 四川大学硕士论文 ( 5 ) n ，n ，n ，n 一四甲基乙二胺( t e m e d ) ( 6 )电极缓冲液：8 一丙氨酸，8 m l 冰醋酸混合，加水到i 升，p h 4 5 ( 7 ) 染色液：( 现配) 淀粉溶液：可溶性淀粉1 9 溶于1 0 0 m l 的1 2 n a c i 溶液中 碘溶液：3 0 9 k i 和1 3 9 1 2 溶于1 0 0 m 1 5 醋酸溶液中 6 1 2 操作方法： ( 1 ) 聚丙烯酰胺凝胶制备： 分离胶( 7 5 ) ：a c r 贮液2 5 m l 缓冲液1 2 5 m ! t e m e d1 0 1 1 1加水至9 9 5 m l l o a p5 0 u l 浓缩胶( 3 ) ：a c r 贮液l m l 缓冲液1 2 5 m l t e m e d1 0g t l加水至 9 9 m l 1 0 a pl o ou l ( 2 )样品处理： 盐析曲线的制作： 取9 个烧杯分别加入粗酶液2 0 m l ，搅拌下加入硫酸铵，使其饱 和度分别为o ，1 0 ，2 0 ，3 0 ，4 0 ，5 0 ，6 0 ，7 0 ， 8 0 ，然后4 0 0 0 r l m i n 离心，分别测上清液酶活，根据测定结 果，以硫酸铵饱和度为横坐标，相对酶活为纵坐标，绘出该酶 的盐析曲线。 粗酶液用透析袋透析4 8 小时去盐，与亚甲基蓝指示染料按4 ： 1 混合。 ( 3 ) 点样： 用微量进样器吸取一定体积的样品液注入样品槽。 ( 4 ) 电泳： 按常规方法进行，初电流控制在6 0 毫安，当指示染料进入分 胶后，加大电流至1 0 0 毫安，恒流至电泳结束，电泳时间为6 四川大学硕士论文 小时。 ( 5 ) 孵化： 剥胶后，先将凝胶用水冲洗后浸入l 的可溶性淀粉底物溶液 中，3 74 c 孵化1 小时。 ( 6 ) 染色： 从底物溶液中取出胶片，用水将淀粉附着物冲洗干净后，用稀 碘液染色。 62 复合酶酶学特性初步研究 6 2 1 复合酶最适p h 值测定 用缓冲液配制不同p h 值的底物溶液，按照酶活测定方法测定在不 同的p h 值条件下，复合酶的酶活情况，计算相对酶活，分析复合酶 作用的最适p h 值。 6 2 2 复合酶作用最适温度测定 分别在不同的温度下测定复合酶液酶活，计算相对酶活，分析复 合酶作用的最适温度。 结果 1 耐酸性q 一淀粉酶产生菌株的筛选与鉴定 1 1 耐酸性n 一淀粉酶产生菌株的筛选分离 从酸性土壤，酒糟，醋醅，酸性富集培养基中所得到的样品经筛 选培养基培养后生长大量菌落，但能在筛选培养基上产生明显透明圈 的菌株仅有1 株( 如图1 ) ，经三角瓶固体发酵该株菌具有耐酸性淀粉 酶活性，测其耐酸性淀粉酶活性为3 0 6 u g 。将该菌株定名为a s a l 。 1 2 菌种初步鉴定 1 2 1 形态特征 细胞特征：通过美蓝水浸片观察，细胞单个个体较大，平板培 四川大学硕士论文 图1 ：a s a 一1 菌株在筛选培养基产生的透明圈 条件下能见极出芽和两极出芽的现象，在液体培养条件下可以看到多 极出芽现象。菌体细胞单个分散，呈卵圆形( 图2 ) 长5 1 0 um ， 宽2 7 4um 。( 表1 ) 表1 s 一1 菌体形态特征观察结果 表2 s 一1 菌株培养特征观察结果 1 2 2 培养特征( 表2 ) 菌落特征：菌落为圆形，边缘整齐，乳黄色，质地光滑湿润，较厚。 假菌丝形成实验：在马铃薯琼脂培养基上点接a s a l 菌株，覆盖无 菌盏玻片，培养三天后，假菌丝清晰可见。 四川大学硕士论文 3 5 0 05 0 0 0 图2 s a 一1 菌株的扫描电镜照片 子囊孢子形成实验：g o r o d k o w a 培养基，k l e y n 培养基，马铃薯块培 养基。石膏块培养基培养均未见子囊孢子形成。 1 2 3 生理生化特征 糖发酵实验：a s a l 菌株对五种实验糖类均不能发酵 碳源同化实验：a s a l 菌株能利用实验六种糖类 氮源同化实验：a s a 一1 菌株能同化利用硝酸盐( 表3 ) 根据l o d d e r 分类系统，初步确定a s a l 属于假丝酵母属水生假丝酵 母 2 复合诱变 2 1 紫外( u v ) 诱变 2 1 1 野生菌株a s h - 1 对不同剂量的紫外线照射的敏感性 野生菌株a s a l 所制成的菌液用不同剂量的u v 处理后，取样稀 释，涂布于筛选培养基上，避光培养5 0 小时统计诱变存活率。如表4 所示 2 1 2 不同剂量的紫外线照射对a s a - 1 菌株的诱变效果 1 7 四川大学硕士论文 将菌液用u v 分别照射不同时间后分别涂布与筛选平板上，按 表3 s 一1 菌株生理生化特征 ( + 生长一不生长) 表4a s a 一1 菌株紫外诱变致死率统计 不同剂量各挑取单个菌落i 0 0 株于筛选培养基上，按照筛选标准 比较诱变后菌株酶活，统计不同剂量处理菌株的正变率，如表5 所示。 结果表明：1 5 0 s 剂量效果最好，1 8 0 s 次之。 经初筛，从大量诱变突变菌株中选取几株酶活较高的菌株进行固 体发酵。产酶情况如表6 。 表5 紫外处理菌株的正诱变率 四川i 大学硕士论文 2 2 d e s - u v 复合诱变 2 2 1d e s - u v 复合诱变致死率统计 以野生菌株a s a 一1 为出发菌株，先利用浓度为2 的d e s 3 0 。c 振 荡不同时间，然后在紫外灯下照射1 5 0 s ，统计致死率，如表7 所示。 表7d e s t j v 复合诱变致死率统计 选择致死率8 0 左右剂量处理样品，即2d e s 溶液3 0 振荡6 m i n 后，再用紫外灯照射1 5 0 s 。 根据多菌株出发的原则，在经紫外诱变的正变菌株中选取酶活高 的株菌制成菌悬液，进行d e s u v 复合诱变，通过初筛和复筛，结果 如表8 ( 酶活单位为u g ) 经d e s u v 复合诱变后，通过初筛和复筛得 到高产菌株a s a u v 8 6 ，以该菌株作为发酵条件优化的出发菌株。 表8d e s - u v 诱变效果 菌株编号a s a u d 6 a s a u d 2 8 a s a - u d 5 9 a s a - u d 8 6 a s a - u d 9 3a s a - u d 9 6 酶活( u g ) 1 3 31 2 751 3 0 41 4 61 2 6 71 2 0 6 四川大学硕士论文 将a s a u d 8 6 菌株在斜面培养基上连续传种l o 次，每次接种发酵 测定酶活，结果如表9 。 从表中可以看出a s a u d 8 6 的产酶能力具有较好的稳定性。 3a s a u d 8 6 菌株发酵条件优化 3 1 a s a - u d 8 6 菌株生长曲线测定： 将a s a u d 8 6 菌株接于种子培养基中培养不同试讲，用浊度比色 法测定起生长曲线。如图3 从图3 可以看出，a s a u d 8 6 菌株的延迟期是o 1 2 小时，对数生 长期为l 2 5 0 小时该期菌体的生理状态比较一致，新陈代谢卧盛， 5 0 小时后进入稳定期。 0 8 os 0 4 管 0 _ 2 0 1 0 0i n3 04 0即t o 时问t 0 , 3 图3a s a - u d 8 6 菌株生长曲线 3 2 种龄及接种量对a s a - u d 8 6 产酶的影响 采用液体种子作为种子来源，因为液体种子具有接种量小易于 放大前期污染容易控制等优点。选取处于对数生长期不同时候的菌 液作为种子，保持培养基含水量为麦麸：水为1 ：l 不变的情况r 按 照不同量接入固体培养基中，培养7 0 小时，测定酶活，结果表叫：当 四川i 大学硕士论文 种龄为4 8 小时的时候，接种量为5 m l 瓶时，酶产量较高，随着接种 量的增加，酶活在增加不多之后减少，分析原因可能时接种的液体种 子量过大，菌体量大在生长过程中形成竞争，从而影响了菌体的生长。 1 6 0 奄1 2 0 西8 0 避4 0 0 1 种龄为2 4 小时 2 种龄为4 8 小时 图4 种龄及接种量对产酶的影响 3 3 培养基的确定 3 3 1 碳氮比确定 培养基的氮源和碳氮比( c n ) 对微生物的生长和产酶有一定的影 响，通过在主要原料麸皮中添加不同的氦源进行发酵产酶实验，结果 表1 0 氦源选择 基本培养基氮源辅料添加比例 ? o h 酶活( u 幢) 麦麸 麦麸 麦麸 麦麸 麦麸 豆饼粉 尿素 ( n i t 。) 2 s o 。 ( n h ) z c 0 。 1 ：o 5 1 ：0 1 l ：o 0 5 l ：o 0 5 1 0 4 2 1 6 0 3 邕 四川大学硕士论文 如表1 0 所示。 根据表1 0 可以看出培养基加入豆饼粉后，对菌株产酶有较大影 响，试验中发现以尿素，( n h 。) 。s o 。和( n 吼) 。c o 。作为氮源时，在培养 基表面看不到菌苔生长，而其它两种培养基表面有明显的菌苔生成。 分别按照麦麸：豆饼粉的比例为1 ：0 2 5 ，1 ：0 5 ，1 ：0 ，7 5 ，l ：i 和 1 ：1 2 5 考查碳氮比对菌株生长和产酶的影响，结果如表11 所示。 表1 1 碳氰比例考查 根据表1 1 可以看出，培养基中麦麸：豆饼粉的比例为l ：0 5 和 1 ：0 7 5 都适合菌体生长和产酶，但t ：t , f f , l 为1 ：0 7 5 条件下酶产量增幅 不大，根据经济的原则，选用麦麸与豆饼粉比例为1 ：o 5 作为配制培 养基的标准 3 3 ，2 培养基初始舍水量的确定 在固态发酵培养中培养基的含水量对菌体生长和产酶很重要， 培养基中含水量过低，麸皮培养基过于干燥，一方面在灭菌中麸皮中 的淀粉不易糊化，另一方面菌体接入后不易生长繁殖，对于发酵产酶 产生不利的影响。而培养基含水量过高，灭菌后麸皮会粘成一团，通 气性差，接种后静置培养时也对产酶不利。实验结果( 图5 ) 表明：培养 基初始含水量在5 5 左右即固态培养基：水比例为l ：l _ 2 时，菌株产酶 比较高。 3 4 培养条件确定 3 4 1 培养基起始p h 值对a s a - u d 9 6 产酶的影响 四川大学硕士论文 1 0 0 釜8 0 姆6 0 鬟4 0 罂2 0 0 4 05 06 07 08 0 培养基初始含水量( ) 图5 培养基含水量对a s a - u d 8 6 菌株产酶的影响 为了比较不同的起始p h 值对产酶的影响，用不同p h 值的缓冲溶 液配料，接种培养结果如图6 所示。 在p h 值4 条件下没有看到明显的菌体生长，在其他的p h 条件下， 在培养基表面有明显的菌苔生成。实验结果( 图6 ) 表明：在接近自然 龃值条件下，a s a u d 8 6 产酶量比较高，所以选择自然p h 值作为培养 1 0 0 s8 0 弊6 0 鬟4 0 罂2 0 0 对照46 7 8 p 瞄 图6 培养基p h 值对产酶影响 基的起始d h 值，这样既操作简便，产酶又高。 3 4 2 培养温度对a s a u d 8 6 产酶的影响 温度对于菌体生长和产酶的影响比较大，在不同温度下进行发酵 四川大学硕士论文 实验，结果如表1 2 所示，培养温度控制在3 0 c 对菌体产酶有利。 表12 培养温度对产酶的影响 培养濡度 2 5 1 c 3 0l 3 5 。c 7 0 h 时酶活( u g ) 3 5 发酵产酶曲线的确定 综上所述采用a s h u d 8 6 菌株进行三角瓶固态发酵产生耐酸性 n 一淀粉酶的较佳工艺条件为：以麦麸作为主要原料，按照i ：0 5 的 比例加入豆饼粉补充氮源，培养基初始含水量在5 5 左右，培养温度 在3 0 c ，液体种子接种量为5 m l 2 5 9 。为了确定发酵产酶周期，在上 述最佳条件下测作发酵产酶曲线，如图7 所示，发现产酶高峰期在 6 0 7 2 小时之f s j ，因此在此时期结束发酵。 1 8 0 1 6 0 m o 巡1 2 0 e1 0 0 聪 2 0 0 01 22 43 64 86 07 28 49 6 培养时间t ( h ) 图7 三角瓶固态发酵产酶曲线 4 a s a - u d 8 6 菌株固态发酵产物分析 4 1 盐析曲线制作 根据实验结果作出盐析曲线如图8 所示，d 图可知a s a u d 8 6 耐 四川大学硕士论文 酸性a 一淀粉酶在( n l ) 。s 0 4 饱和度为2 0 时沉淀较少，在饱和度为5 0 时几乎完全沉淀，因此在初酶提取时先用2 0 饱和度( n h 。) 。s 0 。除去一 定杂蛋白，再用5 0 饱和度( n h 4 ) 。s 0 4 沉淀耐酸性a 一淀粉酶。 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 01 0 2 03 04 05 06 07 08 0 ( n l l 4 ) 2 s 0 4 $ $ n 度 圈8 耐酸性d 一淀粉酶的盐析曲线 图9a s a u d 8 6 菌株耐酸性c l 一淀粉酶同工酶 4 2 耐酸性n 一淀粉酶同工酶分析 将a s a u d 8 6 菌株发酵提取的粗酶溶于0 i m o l l 的p h 为4 0 的醋 一96v蝉癌莨罂 四川大学硕士论文 酸一醋酸钠缓冲液( o 5 的n a c i ) ，透析4 8 小时后进行同工酶活性 电泳。实验结果显示( 图9 在a s a u d 8 6 菌株发酵产物中有三种酶具有 耐酸性n 一淀粉酶活性。同工酶电泳后，分别用p h 值为4 和9 的底 物溶液孵化，再用碘液色后发现这三种酶同时具有耐碱性。结果如图 1 0 所示。 1 p h 值4 底物溶液孵化2 p h 值9 底物溶液孵化 图1 0 不同p h 值底物溶液孵化结果 将粗酶液在4 条件下保存一个月以后再做活性电泳分析。结果 如图1 1 所示 由图l l 可以看出一个月后，三种酶仍然具有耐酸性。一淀粉酶 活性，但是在碱性条件f 酶i i i 已经失活。 4 3a s a - u d 8 6 菌株耐酸性n 一淀粉酶复合酶酶学特性初步分析 4 3 1 复合酶液反应最适p h 值 配制不同p h 值的底物溶液，p h 值从2 5 - 9 ，测定酶活，计算 相对酶活得出复合酶液反应的最适p h 值。如图1 2 所示 四川大学硕士论文 1 p h 值4 底物溶液孵化2 p h 值9 底物溶液孵化 1 0 0 舍8 0 船6 0 篓4 0 霉2 0 0 图1 1 复合酶稳定性分析 2 5 3 54 56789 p 瞄 豳1 2 复合酶最适p h 值分析 复合酶液在p h 值2 5 还保持了4 1 的活性，p h 值4 活性为9 j 9 在p h 值9 时仍然保持7 4 8 ( f 活性，最适p h 值为6 。 4 3 2 复合酶液反应最适温度 四川大学硕士论文 分别在不同温度测定酶活，计算相对酶活得出复合酶作用的最适 温度。结果如图1 3 所示，复合酶最适稳定为5 0 c ，但是耐热性较差， 在6 04 c 仅剩5 0 酶活。 1 0 0 量8 0 妲6 0 饕4 0 罂2 0 0 5 06 07 0 温度t ( ) 图1 3 复合酶最适温度分析 四川i 大学硕士论文 讨论 1 菌种筛选 从1 9 6 2 年山田指出黑曲霉产生的耐酸性。一淀粉酶的最适p h 值 是4 0 开始，不少国家逐步开始了对这能在极端条件下保持高活性 的t - 一淀粉酶的研究。所得到的能产隹耐酸性n 淀粉酶的微生物 主要是曲霉和芽孢杆菌如黑曲霉，白曲霉( a s p e r g i l l u sk a w a c h i i ) ， b a c i d o c a l d a r i u sa 2 b a c i d o c a l d a r i u s a t c c 2 7 0 9 b 1 i c h e n i f o r m i s ba c i d o l d a r i u s l o l ”“等等。a s a 一1 经鉴定为假丝酵母属水生假丝酵 母，其在生长条件方面跟酿造工业上广泛应用的酵母在具有共通性， 所以该菌种在工业应用方面，特别是在酿酒工业中具有开发价值。 2 诱变 利用物理和化学方法对野生菌株进行复合诱变是获得高产菌种 的诱交育种中的通用方法，而紫外照射和硫酸二乙酯诱变是传统的诱 变方式。通过紫外诱变和d e s 复合诱变，菌株的产酶能力提高了近五 倍获得了产酶能力较高的a s a - u d 8 6 菌株，酶活从出发菌株的 3 0 ，6 u g 提高到了1 4 6u g 。在诱变过程中，第一轮紫外诱变的效果 明显，通过紫外诱变，菌株产酶缒力跟出发菌株相比提过了将近四倍， 效果较好。d e s u v 复合诱变效果稍微差点，产酶能力仅在第一轮紫外 诱变基础上提商了2 7 左右。所获褥诱变菌株具有较好的稳定性。 通过复合诱变所得到的变异菌株a s a u d 8 6 虽然与野生菌株产酶 能力有显著提高，但是距离工业化生产的要求还很远，如 五i 进一步通 过诱变方式获得高产菌株还需迸步研究 3 培养条件优化 在以麦麸为主要原料的固态培养连中加入不同比例的豆饼粉实 验c l 发现豆饼粉比例增加菌体生长很，但是酶活明显下降，分析原 因一叮能时添加氮源后菌体大量繁殖消耗了过多的营养，而使合成酶蛋 四川i 大学硕士论文 白的营养比例减少，造成产酶下降。 采用p h 4 的摇瓶培养时，菌体生长较快，且聚集成团，但是培养 液中测不到胞外耐酸性n 一淀粉酶活性，其原因还有待于进一步研 究。 4 发酵产物分析 菌株a s a - u d 8 6 的发酵产物中有三种酶具有耐酸性n 一淀粉酶特 性，并且三种酶在高p h 条件下也具有活性，证明这三种酶作用的p h 值范围相当宽，复合酶液无论在低p h 值或高p h 值条件下都保持较 高活性，同时具有了耐酸性n 一淀粉酶和中性o - 一淀粉酶的特性，在 工业利用上就不仅限于酸性条件下的使用了这就更扩大了其应用前 景三种酶的酶学特性还需分离纯化后再做研究。 四j i i 大学硕士论文 小结 1 从醋醅中筛选出能产耐酸性a 一淀粉酶的野生菌株a s a 一1 ， 经鉴定为假丝酵母属的水生假丝酵母。以a s a l 为出发菌株通过u v 和u v d e s 复合诱变后获得稳定遗传的高产菌株a s a u d 8 6 ，其耐酸性 c i 一淀粉酶活力达到1 4 6 u g ，较出发菌株提高了近4 倍。 2 比较固体和液体发酵情况，选用固态发酵，优化发酵条件， 发酵培养基为：以麦麸作为主要原料，按照1 ：0 5 的比例加入豆饼粉 补充氮源，培养基初始含水量在5 5 左右。液体种子接种量为5 m l 2