（细胞生物学专业论文）急性分离大鼠下丘脑神经元自发性放电触发机制研究.pdf

博士学位论文 急性分离大鼠下丘脑神经元 自发性放电触发机制研究 博士研究生：吴航宇 指导教师：邹飞教授 摘要 研究背景 细胞温度敏感机制是目前环境生命科学研究的热点之一。近年来围绕温度敏 感的分子感受和调控机制，研究者从多个方面进行了探索，包括钾通道、瞬时受 体电位通道、氨基酸类受体( 包括谷氨酸受体和y 氨基丁酸受体) 、内生阿片样 受体、a t p 受体蛋白等都有参与，这些分子主要参与对细胞放电幅度和频率、对 周围系统的产热和散热系统进行调节。但总的来说，目前对于这些调控分子的研 究还处于起步阶段，可能还存在一些关键的调控分子尚未得到重视或发现。下丘 脑，特别是视前区前部下丘脑( p r e o p t i ca n da n t e r i o r h y p o t h a l a m u s ，p o a h ) 中的 神经元参与了多种机体活动，例如温度调控、饮食行为等等，在众多的功能之中， 其作为机体感受温度变化并调控相应反应的中枢器官尤其为人们所重视及认同。 早在一个世纪以前，人们通过毁损或刺激下丘脑的方法，就己确认下丘脑是 机体温度调控的重要神经结构单位，它能够粗略地感受周围组织温度变化及触发 某些温度调节反应，并在上位结构的调控下，以更加精确的方式控制机体对温度 变化的反应。随着研究的深入以及方法学上的改进，人们更是将下丘脑对温度的 调控位置锁定于p 0 a h 区域，并发现p 0 a h 不仅能够感受中枢神经系统的温度 变化且通过内侧前脑束作用于效应器产生调控作用，还可接受遍布躯体的温度感 受器的传入信息，将外周温度信息与中枢的信息进行比较和整合，从而更加有效 及精确地调整机体对温度变化的反应。虽然人们对下丘脑神经元的热敏感性已有 了越来越清晰全面的认识，但却一直无法确定这种热敏感性的机制，各种结果莫 衷一是，有的认为是短暂的离子流触发了温度感受，也有人认为持续的离子流才 是温度敏感机制的基础。在这些研究中，有研究者认为一种短暂的外向钾离子电 摘要 流( a 电流，i a ) 由于具有较高的温度敏感性，并且a 电流对触发细胞放电的前 电位有重要作用，因而a 电流有可能参与p o a h 温度敏感过程；还有的人则 相信t r p 超家族中的t r p v 通道家族由于具有很高的温度敏感性而在p o a h 发 挥重要作用，其开放可导致内向的n a + 和c a + 混合离子流，从而增加膜电导，促 使神经元放电频率上升。事实上，可改变神经元动作电位时程的因素均有参与神 经元的温度敏感机制形成的可能性，例如超极化激活环核苷酸门控离子通道 ( h y p e r p o l a r i z a t i o n a c t i v a t e d ，c y c l i cn u c l e o t i d e - g a t e dc h a n n e l s ，h c nc h a n n e l ) 可由 细胞膜电位的超极化而激活，造成胞外n a + 及k + 内流，从而使膜电位有去极化 的趋势，进而影响细胞a p 。加上下丘脑中表达有h c n 通道的事实，使得对下 丘脑温度敏感机制的研究又增添了新的线索。 下丘脑对于机体温度感受及调节的重要性早已获得公认，然而由于下丘脑组 织含有种类繁多、性质各异的神经元，加上各种神经元之间相互的作用，使得在 整体动物及脑片上进行的实验研究涉及到太多的影响因素及作用机制：而另一方 面，亦有研究人员对培养状态下的下丘脑p o a h 神经元电生理特性及温度敏感 性进行了研究，但是培养状态下的细胞面对着与体内截然不同的内环境，其细胞 性状及特性还有基因表达等等均会产生或多或少的改变，因此从培养神经元获得 的实验资料并不能准确地反映其在体内真实性状。因此有必要对急性分离的下丘 脑神经元电生理特性进行研究，以使人们对下丘脑的认识更加全面。 h c n 通道功能的纷繁复杂，不同种类细胞中h c n 通道的特性也各不相同， 变化多端，相当多的研究已揭示下丘脑组织区域表达有丰富的h c n 通道，然而 对下丘脑神经元的电生理特性中h c n 通道的功能却少有研究涉及。 目的 1 探讨急性分离的大鼠下丘脑神经元自发放电特性以及其温度敏感性。 2 研究h c n 通道各亚型m r n a 在相应单个自发放电神经元中的表达情况。 3 探索下丘脑神经元的温度敏感内在机制以及其与h c n 通道之间的联系， 从而为下丘脑温度感应及调控机制研究找到新的线索。 方法 i i 博士学位论文 1 利用酶消化下丘脑脑片及机械分离方法获得急性分离的神经元，为 后继实验提供状态良好的神经元。 2 采用全细胞模式膜片钳记录大鼠下丘脑神经元的自发放电活动及i h 电流，明确其电生理特性并施加温度影响。 3 采用单细胞r t p c r 技术检测前述电生理实验确定的各类型神经元 中h c n 通道m r n a 的表达情况，并利用限制性内切酶酶切反应来验证p c r 产 物的特异性 结果 1 利用酶消化下丘脑脑片及机械分离方法可成功获得急性分离的神经元， 神经元状态良好，可保证后继实验的准确性。 2 在总共记录的7 8 个下丘脑神经元之中，共记录到1 2 个自发放电的神经 元，其余均为非自发放电神经元。二者膜电容及输入阻抗无显著差异( p 0 0 5 ) 。 3 下丘脑神经元的自发放电可以由自发去极化或前电位( 包括e p s p ) 触发， 可据此将自发放电的神经元分为两类，即自发去极化神经元( s p o n t a n e o u s d e p o l a r i z i n gn e u r o n ，s d n ) 和前电位驱动神经元( p r e p o t e n t i a l d r i v e nn e u r o n ， p p d n ) 。 4 s d n 与p p d n 静息膜电位及输入阻抗无显著差别，而p p d n 突触后电位 ( p o s t s y n a p t i cp o t e n t i a l ，p s p ) 发生的频率则显著高于s d n ( p o 0 5 ) 3 s p o n t a n e o u sf i r i n g s o f h y p o t h a l a m i c n e u r o n sc o u l db ec l a s s i f i e da s s p o n t a n e o u sd e p o l a r i z i n gn e u r o n ( s d n ) a n dp r e p o t e n t i a l d r i v e nn e u r o n ( p p d n ) b a s e do nt h e i rt r i g g e r i n gm e c h a n i s m s ，s p o n t a n e o u sd e p o l a r i z i n ga n dp r e p o t e n t i a l ( i n c l u d i n ge p s p ) ，r e s p e c t i v e l y 4 t h e r ew a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eb e t w e e nr e s t i n gm e m b r a n ep o t e n t i a l ( r m p ) o fs d na n dt h a to fp p d n ，b u tt h em e m b r a n er e s i s t a n c e ( r m ) o fp p d nw a s s i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a to fs d n a n dp s pf r e q u e n c yi np p d nw a s h i 【g h e rt h a nt h a t i n s d n 伊 0 0 5 ) 。具体参见表1 。 自发放电神经元的放电形式可归纳为三种模式：连续的单个自发放电( 图 4 一b ) ：存在着多个但尚未达到爆发动作电位阈电位的兴奋性突触后电位 急性分离大鼠下丘脑神经元自发性放电触发机制研究 ( e x c i t a t o r yp o s t s y n a p t i cp o t e n t i a l ，e p s p ) ( 图4 - c ) ，图中一部分e p s p s 已经用 箭头标出，一部分专家将这部分神经元称为“静息神经元”，这部分神经元和 e p s p 驱动神经元一起构成次级热敏神经元( s e c o n d a r yw s n ，s w s n ) 的主体， 图中虚线代表距基线l m v 的电压水平，e p s p 定义为高于这个基线水平的电压； 第三类为爆发性的动作电位，在一串动作电位之间存在着短暂的间期( 图4 - d ) 。 f 二1 下丘脑神经元依照自发性动作电位的触发机制可分成两类神经元 下丘脑神经元的自发放电可以由自发去极化或前电位( 包括e p s p ) 触发， 可据此将自发放电的神经元分为两类，即自发去极化神经元( s p o n t a n e o u s d e p o l a r i z i n gn e u r o n ，s d n ) 和前电位驱动神经元( p r e p o t e n t i a l d d v e nn e u r o n ， p p d n ) 。 1 下丘脑神经元自发性动作电位的触发机制。 图5 a 代表着自发去极化触发的动作电位，这类神经元如果对温度敏感， 则被称为初级敏感神经元( p r i m a r yw s n ，p w s n ) ，其温度敏感机制来自于神经 元本身的离子通道对温度的反应；图5 b 则是由前电位触发引起的，这类神经 元如果对温度敏感，通常称为次级热敏神经元( s w s n ) ，其温度敏感机制来自 于周围神经元的突触传递，兴奋性与氨基酸类受体密切相关。但对于s w s n ，当 出现e p s p s 时，神经元的规则放电常被打破( 图5 一c ) 。 2 s d n 与p p d n 膜特性比较。 s d n 与p p d n 静息膜电位及输入阻抗无显著差别，而突触后电位 ( p o s t - s y n a p t i cp o t e n t i a l ，p s p ) 发生的频率则显著高于s d n ( p 4 0 3 0 2 0 1 0 o 1234s67 p e a k 图1 7 注射电流对s d n 和e p s p 驱动神经元放电峰电位的影响。s d n 峰电位随着放电次 数增加而降低( a ) ，而e p s p 驱动神经元峰电位无明显变化( b ) 。 f i g 1 7u n d e ri n c r e a s i n gd e p o l a r i z i n gc u r r e n t s ，t h ep e a ka m p l i t u d eo fs d ns p i k e sd e c r e a s e dw i t h t h es p i k en u m b e r s ( a ) ，w h i l et h a to fe p s p d r i v e nn e u r o ns p i k e sr e m a i n e dc o n s t a n t ( b ) 6 0 博士学位论文 a 2 5 0 p a _ j 5 0 m s -u4 ? 4 j 歹 _ 04 o8 善 = 。12 二：二罢测。 l 6 6 0 m v 1 2 0 m v 酗1 8 全细胞模式r 白发放电人鼠一r r 脑神经元上的i 。电流。a ：神经元钳制丁o m v ，再 施加以6 0 m v 到1 2 0 m v 电压，电压增幅为2 0 m v ，时艮为5 0 0 m s 。a 标准电压钳结果。b 加 入1 0 0 um o l l 特异性h c n 通道阻断剂z d 7 2 8 8 后的电压钳结果。借助于软什消减，可得山 对z d 7 2 8 8 敏感的电流( a - b ) 。b ：应州z d 7 2 8 8 前( 实心三角形) 及以后( 实心圆形) 的 i - v 曲线图，可看到z d 7 2 8 8 降低膜电导。( n = 5 ，p 0 0 5 ) f i g 1 8l hc u r r e n t si nw h o l e - c e l lm o d ei ns p o n t a n e o u s l yf i r i n gr a th y p o t h a l a m i cn e u r o n s a ：i h c u r r e n t se l i c i t e db y5 0 0 m sv o l t a g es t e p sf r o m6 0 m vt o 1 2 0 m vw i t hah o l d i n gp o t e n t i a lo f0 m v c a s e ( a ) i n d i c a t e das t a n d a r dv o l t a g e c l a m pp r o c e d u r ea n dc a s , ec o ) i n d i c a t e dc u r r e n t sa f t e r a p p l i c a t i o n o f1 0 01 1m o f lz d 7 2 8 8 ，as p e c i f i ch c nc h a n n e l b l o c k e r b ys u b t r a c t i o n z d 7 2 8 8 一s e n s i t i v eh y p e r p o l a r i z e d a c t i v a t e dc u r r e n t sc o u l db ei s o l a t e da n ds h o w na sc a s ef a - b 1 b ： i - vr e l a t i o n s b e f o r e ( f i l l e dt r i a n g l e s ) a n da f t e r ( f i l l e dc i r c l e s ) z d 7 2 8 8a p p l i c a t i o n ，w h i c h s u g g e s t e dz d 7 2 8 8r e d u c e dm e m b r a n ec o n d u c t a n c e ( n = 5 ，p 0 0 5 ) 6 1 喜苎一 一； _ 九 一 b 一 图片与表格 a a 泛：= ：一一 + z d 7 2 8 8 - 6 0 m v 3 0v _j m2 5 0 p a 1 三爿 5 “ p r e p u l s e l m 图1 9 人鼠f 丘脑白发放电神经元上i h 和1 a 电流之间的关系。a ：神经元钳制丁i 6 0 m v ，再 施加以一6 0 m v ：f t 1 2 0 m y 电压，电压增幅为2 0 m v ，时长为5 0 0 m s ；最后将电位钳制7 - + 3 0m v 2 0 0m s 以激活电压门控外向k + 电流。a 显示的是标准的电压钳步骤，而b 则是应用1 0 0 i tm o l l z d 7 2 8 8 后的电流图。插幽表示的是持续2 0 m s 从1 2 0 m v ：i ! l j 一8 0 m v 的前脉冲回归l l j 3 0 m v 所完 全激发的i a 电流，以此作为i a 电流对照。 b 和c ：应用z d 7 2 8 8 前后的i h 和i a 电流密度变化。 可看出i h 减弱可导致l a 增强。f n = 5 ，p 0 0 5 ) f i g 1 9r e l a t i o nb e t w e e ni ha n di ac m t e n t si ns p o n t a n e o u s l yf i r i n gr a th y p o t h a l a m i cn e u r o n s a h y p e r p o l a r i z i n gs t e p sf r o mah o l d i n gp o t e n t i a lo f 6 0m vi nah y p o t h a l a m i cn e u r o nr e v e a l e da n l hc u r r e n t s t e p sw e r e5 0 0m sl o n gf r o m 一6 0t o 1 2 0m vf o l l o w e db yar e t u ms t e pt o + 3 0m v t h er e t u r ns t e ps h o w st h ev o l t a g ea c t i v a t e do u t w a r dk 十c u r r e n t ( t h ep e a ks u b s t i t u t ef o rj ac u r r e n t a m p l i t u d e ) n ol e a ks u b t r a c t i o nw a su s e d t h eu p p e rc a s e ( a ) s h o w e das t a n d a r dv o l t a g e c l a m p p r o c e d u r ea n dt h em i d d l eo n ei n d i c a t e dc u r r e n t sa f t e ra p p l i c a t i o no f1 0 0um o l lz d 7 2 8 8 ( b ) t h e i n s e ti n d i c a t e dt h em e m b r a n es t e pt o3 0 m va f t e rc o n d i t i o n i n gp r e p u l s er a n g i n gf r o m 一1 2 0 m vt o 8 0 m vf o r2 0m s i hw a so b t a i n e dw i t hr e s p e c tt ot i m el e s st h a nl hc u r r e n ta c t i v a t et i m ec o n s t a n t ( 5 2 m s ，d a t an o ts h o w e n ) b c u r r e n td e n s i t yw a sa p p l i e dt os t u d yt h ei n f l u e n c eo fl ho ni aa c t i v i t y u n d e rd i f f e r e n tp r e p u l s ev o l t a g e ( b ) b e f o r ea n da f t e ra p p l i c a t i o nz d 7 2 8 8 ( c ) f n = 5 ，p 4 3 。c ) s u f f i c i e n t l yh o tt oc a u s ep a i ni nh u m a n sa n do t h e rm a m m a l s h o w e v e r ，t h i st h r e s h o l d d o e sn o ts t a ys t i l la l lt h et i m e i ti sm o d u l a t e db yc h e m i c a ll i g a n d sa n dt h e p h o s p h o r y l a t i o n s t a t eo ft h ec h a n n e l t h ev a r i o u sa c t i v a t i n gl i g a n d sh a v es y n e r g i s t i c e f f e c t s ，s ot h a ta n ys p e c i f i cc h e m i c a ll i g a n dc o n c e n t r a t i o nw i l lr e s u l ti nau n i q u e s e t t i n go ft h et e m p e r a t u r es e n s i t i v i t yo ft h ec h a n n e l t h u s ，c h a n g e si ne n d o g e n o u s l i p i dl i g a n dc o n c e n t r a t i o nm i g h t b ee x p e c t e dt ov a r yt h et h e r m a ls e n s i t i v i t yo ft h e c h a n n e l s t h ep h o s p h o r y l a t i o ns t a t eo ft h ec h a n n e l si sa l s oi m p o r t a n t f o re x a m p l e ， p h o s p h o r y l a t i o no ft r p v lb yp r o t e i nk i n a s ec r e s u l t si na c t i v a t i o no ft h ec h a n n e la t n o r m a lb o d yt e m p e r a t u r e 12 1 t h i sp l a s t i c i t yp o t e n t i a l l yc o n f e r saw i d es p e c t r u mo f t e m p e r a t u r es e n s i t i v i t yo fc e l l se x p r e s s i n gt r p v l t h e r e f o r e ，r e s p o n s e si n r e c o m b i n a n te x p r e s s i o ns y s t e m ss u c ha sh e k 2 9 3c e l l si ns t a n d a r dc u l t u r ec o n d i t i o n s m a yb eq u i t ec o n s i s t e n t ，b u tt h e r ei sm u c hm o r ep o t e n t i a lf o rar a n g eo fr e s p o n s e si n 综述 n a t i v ec e l l s t r p v 2s h a r e sa b o u t5 0 s e q u e n c ei d e n t i t yw i t ht r p v la n dh a st h ew i d e s t d i s t r i b u t i o ni nm a n yt i s s u e si nt h e s ef o u rm e m b e r s t h i sc h a n n e ld o e sn o tr e s p o n dt o a n yo ft r p v ll i g a n d s ，b u tc a nb ea c t i v a t e db ye x t r e m e l yh o tt e m p e r a t u r e s ( 5 2 。c ) r e p e a t e dh e a t i n gr e s u l t si ns e n s i t i z a t i o ns u c ht h a tt h ec u r r e n tt h r e s h o l dm o v e d t o m u c hl o w e rt e m p e r a t u r ea ta r o u n d4 0 。c1 1 3 1 a l la t t e m p t st om e a s u r et r p v 2c u r r e n t i nt r a n s f e c t e dc e l l sh a v eb e e nc l a i m e dt ob ef a i l u r e s ，s u g g e s t i n gan e c e s s a r yc h a i ni n t h en e e do fd i s c o v e r y h o w e v e r ，f i n d i n g st h a ts o m es o l u b l ec o f a c t o r sa r en e e d e di n t h eh e a tr e s p o n s i v e n e s so ft r p v 4 ( s e eb e l o w ) m a yb eah i n tf o rt h i sp o i n t t r p v 3c a nb ea c t i v a t e db yw a r mt e m p e r a t u r e s ( 3 2 3 9 。c ) r e g a r d i n gi t s d i s t r i b u t i o ni nc n s ，i ti sr e a s o n a b l et os u s p e c ti t si n v o l v e m e n ti nt h e “w a r m s e n s i t i v e n e s s ”p r o c e s si np o a h u n l i k eo t h e rt e m p e r a t u r e s e n s i t i v et r p v c h a n n e l s ，t r p v 3e x h i b i t sp r o g r e s s i v e l yl a r g e rr e s p o n s e su p o nr e p e a t e dh e a t s t i m u l a t i o n t h i sm a yb eo n er e a s o nw h yt h e r ei ss o m ev a r i a t i o ni nt h er e p o r t e d t h r e s h o l do fa c t i v a t i o no ft r p v 3 t h i n g sb e c o m ef u r t h e rc o m p l i c a t e da f t e rp e o p l e f o u n dt r p v 3c o u l dh e t e r o m i s ew i t ht r p v lw h e ns i m u l t a n e o u s l ye x p r e s s e di nh e k 2 9 3c e l l s t h ef a c tt h a tt r p v 3 g e n ei si m m e d i a t e l ya d j a c e n tt ot h a to ft r p v li nt h e h u m a na n dm o u s eg e n o m e s ，c o u p l e dw i t ht h eo v e r l a p p e dc h a n n e ld i s t r i b u t i o ni nc n s a n ds e n s o r yn e u r o n s ，r a i s e st h ei n t e r e s t i n gp o s s i b i l i t yt h a tt h e ym a y h e t e r o m u l t i m e r i z e 【14 1 w h i l et h ec o 1 0 c a l i z a t i o no ft r p v la n dt r p v 3i nn a t i v ed r g c e l lb o d i e ss u g g e s t st h a tt h i sm a yh a p p e ni nn a t i v ec e l l s 1 4 1 t h er e m a i n i n gh e a t g a t e dt r p vs u b t y p e ，t r p v 4 ，w a so r i g i n a l l yd e s c r i b e da sa n o s m o s e n s o r o p e n i n gi nr e s p o n s et oh y p o t o n i cs w e l l i n go ft h ec e l l 【1 5 】i na d d i t i o nt o b e i n gr e s p o n s i v et ot h o s eo s m o t i ca n dc h e m i c a ls t i m u l i ，t r p v 4c a nb ea c t i v a t e db y w a r n lt e m p e r a t u r e s ，w i t ha c t i v i t yb e c o m i n ga p p a r e n ta tt e m p e r a t u r e s ( 2 53 4 。 c ) 【1 6 h o w e v e r ，i nc o n t r a s tt ot r p v lo rt r p v 3 ，i s o l a t e dm e m b r a n ep a t c h e st h a t c o n t a i n e df u n c t i o n a lt r p v 4c h a n n e l ss h o w e dn oc u r r e n ta c t i v a t i o nw h e ne x p o s e dt o i n c r e a s i n gt e m p e r a t u r e t h i ss u g g e s t st h a ta d d i t i o n a ls o l u b l ef a c t o r sa r er e q u i r e dt o m e d i a t e