（无机化学专业论文）锌指蛋白znf191（243368）的表达、纯化及其性质研究.pdf

摘要摘要目前研究表明，人类基因组约由3 0 亿个碱基对构成，仅5 左右的基因组序列编码蛋白，而据估计约占全部基因组l 的序列编码锌指蛋白。锌指蛋白中最为典型的就是c y s 2 h i s 2 ( c 2 h 2 ) 型的锌指蛋白，而庞大的c 2 h 2 型锌指蛋白家族究竟在生物体内起到什么样的作用? 就目前对锌指蛋白的认识而言，c 2 h 2 锌指蛋白可以和d n a 、i 州a 或是蛋白质相互作用，从而作为调控因子在许多生理过程中起着重要的作用。而目前获得的锌指蛋白的数目有限，再加上锌指蛋白的晶体结构不易获得，使我们所能得到的锌指蛋白的结构信息更加有限，所以许多有关c 2 h 2 型锌指蛋白结构和功能的基本问题还有待进一步的研究。z n f l 9 1 基因是从人肝的c d n a 文库中获得的，并被精确定位于人染色体的1 8 q 1 2 1 区域。目前己发现这一区域与多种肿瘤和遗传疾病相关，这也提示z n f l 9 l 基因可能是这些遗传疾病和肿瘤的候选相关基因。而刁虾1 9 l ( 2 4 3 3 6 8 )是z n f l 9 1 的锌指区蛋白，含有四个连续的c 2 h 2 锌指结构域，可能具有和特定的d n a 序列结合的特性。我们希望通过研究可以得到z n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) 特异性结合的d n a 序列，可以了解z n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) 中每一个锌指的性质与结构，以及在整个锌指区蛋白中所起到的作用，从而为我们揭示z n f l 9 l 在生物体中的功能提供有用的信息。要想对某一蛋白的性质、结构和功能有较为全面和深入的了解，获得稳定、高效和简便的表达与纯化方法是最基本的保障，是值得研究与探索的课题。我们在研究z n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) 的过程中也发现，该锌指蛋白在表达和纯化上存在一定的困难，尤其是缺失锌指的突变体蛋白不易得到。为了寻求能够稳定表达z n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) 的体系和得到简便的分离纯化方法，我们分别尝试了p t s a 1 8 b l 2 l ( d e 3 ) 、谷胱甘肽s 一转移酶( g s d 、h i s 砌g 和酮类固醇异构酶s i )表达体系，并对得到的蛋白进行了性质研究。p t s a 1 8 b l 2 l ( d e 3 ) 表达体系中，我们构建了z n f l 9 1 ( 2 4 3 3 6 8 ) 及其三个缺失锌指的突变体基因( d f l 、d f 4 、d f l f 4 ) ，在e ，f b l 2 l ( d e 3 ) 菌株中进行了表达。但是我们只得到了z n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) ，并且它的产率很低，4 升l b 培养基才能得到约lm g 的蛋白，这可能与表达体系自身的性质以及缺失锌指的突变体蛋白的稳定性有关。这使得我们必须尝试其它的表达体系，以获得充足的z n f l 9 1 ( 2 4 3 3 6 8 ) 及其缺失锌指的突变体蛋白，来进行性质研究。谷胱甘肽s 一转移酶( g s d 表达体系中，由于g s t 的协同表达作用，使得融合蛋白具有较高的表达水平，并且融合蛋白的纯化也相对简便、快速。同时利用摘要g s t 对g i u t a t l l i o n es 印h a r o 辩4 b 树脂的特异亲和性，将随机合成的寡聚核营酸库与结合着g s t z n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) 融合蛋白的树脂混合，经过反复的洗涤、扩增等步骤，我们得到了和z n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) 结合紧密的d n a 序列。通过这一实验，我们得到了6 9 个d n a 序列，其中3 8 个( 5 5 呦含有“a g g g ”内核；还有1 2 个( 1 7 ) 序列含有同源性较强的a g g a 、a g g c 、a g g t 序列。根据3 8 个含有a g g g 内核的序列，我们推测出z n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) 可能结合的d n a 序列为“g g a g g g g ”。用g g a g g g g ”序列搜索“真核启动子数据库”，发现在人体中许多基因的启动子中含有这一序列，这与z n f l 9 l 蛋白在人体内普遍表达的性质相符，说明z n f l 9 l 在人体中可能具有基因调节功能。我们还用荧光方法研究了z n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) 、e b 对该d n a 序列的竞争结合，结果表明z n f l 9 i ( 2 4 3 3 6 8 ) 与该d n a 序列间存在较强的相互作用。g s t 对于融合蛋白的结晶化有较强的促进作用，我们希望能够从g s t 融合蛋白得到锌指蛋白的晶体结构。h 碡t a g 表达体系是近几年发展起来的，这一体系表达出的外源蛋白带有连续的组氨酸标记( h i s t a g ) ，用n 2 + n t a 树脂就可以简便、快速的纯化蛋白。许多研究表明，较小的h i s t a g 不会影响目标蛋白的结构与功能。所以我们在这一表达体系中构建了z n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) 、它的定点突变以及缺失锌指的突变体基因，最终得到了在n 一端引入了( h i s ) 6 - 缸i g 的( h j s ) 6 - z n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) ，在c 端引入了m i s ) 8 - 诅g 的z n f l 9 l ( 2 4 3 - 3 6 8 ) 一( h i s ) 8 ，( h i s ) 6 一f 3 h 4 ( 锌指3 中的两个c y s 突变为h i s ) ，( h i s ) 6 f 3 s s ( 锌指3 中的两个疏水性的氨基酸残基突变为亲水性的s e r ) 。但是由于该体系中锌指蛋白的表达水平并不高，以及缺失锌指的突变体蛋白的稳定性较差，我们仍然没有得到缺失锌指的突变体蛋白。得到的这些h 融t a g 蛋白一旦脱去锌离子，他们的c d 光谱就发生了明显的变化，尤其是( h i s ) 6 - f 3 s s ，这说明锌离子以及疏水性氨基酸残基的突变对蛋白的结构产生了影响。而随着锌离子的加入，除了z n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) ( h i s ) g 外，蛋白又逐渐恢复了原有的结构，表明c 端的h i s - 协g 干扰了z n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) 在体外的正确折叠。我们还发现( h i s k f 3 h 4 和z n f l 9 1 ( 2 4 3 3 6 8 ) - ( h i s ) 8 具有水解酶的活性，表明4 个h i s 与锌离子的配位，构成了类似于水解酶的活性位点。这可能也是不存在天然的4 个h i s 与锌离子配位的锌指蛋白的原因之一。研究表明，对于依赖于c y s 和h i s 配位的锌指蛋白来说，是否采用引入h i s - t a g 的表达方法仍然需要慎重。虽然，我们采用上述两个融合蛋白体系，得到了z n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) 的d n a结合序列，并对z n f l 9 l ( 2 4 3 - 3 6 8 ) 及它的几个突变体蛋白进行了表达、纯化与性质研究，但是单个锌指的表达纯化在这两个体系中均不成功，而每个锌指的性摘要质与结构到底有什么差别，仍然足我们主要关心的问题之一为了得到单一的锌指蛋白，我们又尝试了酮类固醇异构酶( | r c t o s t e r o i di m e m ，k s i ) 表达体系。k s i 表达体系中，我们以p e t 3 l b 为载体，在k s i 的c 端分别引入了锌指3( z f 3 ) 和锌指4 ( z f 4 ) 的基因k s i 的协同表达作用以及难溶性，使得k s i 与锌指的融合蛋白的表达水平很高，并且主要是以包涵体的形式存在，有效地防止了结构简单的单一锌指被蛋白水解酶所降解。破菌后的沉淀用不同浓度的尿素缓冲溶液进行洗涤，就可得到大量的、纯度较高的包涵体融合蛋白( 纯度在8 0 以上) ，而且该融合蛋白可直接用于c n b r 裂分。根据k s i 与单一锌指在分子量上的差异进行分离，就可得到纯度达到9 5 以上的单一锌指肽，每升培养基的产量可以达到2 0m g 。性质研究表明，锌指3 和锌指4 在结构上存在差异，并且锌离子是锌指正确折叠的必需因素。但是对于单一锌指肽的具体结构仍然有待进步的研究。由以上的研究我们了解到，蛋白的表达与纯化并没有固定的规律可循，要想得到适合的表达体系，需要进行大量的实验来摸索。而在尝试这些表达体系的过程中，我们利用g s t 融合蛋白中g s t 对树脂的亲和性，得到了z n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 )识别的d n a 序列。由h i s t a g 融合蛋白了解到锌离子和构成疏水内核的氨基酸残基是形成锌指结构域的要素，并获得了具有水解活性的突变体蛋白。由k s i 表达体系，成功得到了z n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) 的锌指3 和锌指4 ，并且确定锌指3 和锌指4 在结构上存在这差异。这些结果加深了我们对锌指蛋白z n f l 9 1 ( 2 4 3 3 6 8 ) 的性质、结构和功能关系的认识。关键词：c 2 h 2 型锌指蛋白，z n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) ，谷胱甘肽s 一转移酶，组氨酸标记，酮类同醇异构酶中图分类号：0 6 1 4a b s 乜_ a c ta b s t r a c tt h e r ca a b o u t3b i l j i o n sb a p a i 糟i nh u m 锄g e n o m e ，o n i y5 g e n 啪es c q u 锄c ec 柚e n c o d ep r 吲n b u ta b o u tl 翮c o d e dh u m 锄g 髓o m ee n c o d ez i n cf i n g e rp r o t e i n s a n dc y s 2 h j s 2 ( c 2 h 2 ) z i n cf i n g e rp m t e i ni s ”m o s tt y p i c a lc l a s so fz i n cf i n g e rp m t e i n s w h a ti st h eb i o l o g i c a i 如n c t i o no fc 2 h 2z i n cf i n g c rp r o t c i n鲫p e r - f a m 订y ? al o to f 佗辩a r c h e ss h o wt h a tm a n yc 2 h 2z i n cf i n g e rp m t e i n sf h n c t i o n豳i m p o n a n tm g u l a t o r si no 唱锄i s m sb yb i n d i n gw i t hd n a ，r n ao rp r o t e i n s b u tz i n cf i n g c rp f o t e i n s ，e s p c c i a l i yc r y s t a i so f z i n cf i n g e rp m t c i n sa d i 伍c u l tt oo b t a 氓m 彻yb 私i cq u e s t i o n so fs n l l c t l l 柚db i o l o g i c a lf i l n c t i o no fm i sp r o t e i nf a m 订ys t i un e e dt ob es t u d i e d 如n l l e n n o r e z n f l 9 1g c n ew a so b t a i n e df b mac d n al i b m r yo f h u m 卸l i v e r ，w h i c hw 舔i o c a t e da t1 8 q 1 2 1o f h u m a nc h m m o m e ，a n dt h i sc h r o m o s o m a l 他g i o ni s l a t c dt 0m a n yh e r c d i t a f y 锄dt l l m o rd 洳a 辩s ，s 0z n f l 9 lg e n ep o s s i b i yi sa l s oac o r r e l a t i v eg e n ef | o rs o m eh e d i t a r y 觚dt l l m o rd i 器e s z n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) i st h ez i n cf i n g e r他g i o np r o t c i no fz n f l 9 lp r o t e 札c o n 协i n i n gf o u rc o n t i n u o u sc 2 h 2z i n cf i n g e rd o m a i n s ，w h i c hp r o b a b l yc 舳b i n dw i t hs p e c i n cd n as c q u e n c ea n dh 舔s p e c i f i cg e n er e g u l a t i o nf l i n c t i o n w ea t t c m p tt oi d e n t i 母t h ed n as e q u 明c ew h j c hc 锄b es p e c m c a l l yb o u n d e db yz n f l 9 l ( 2 4 3 - 3 6 8 ) ，柚dt ou n d e 胁n dt i 璩p r o p e n y 锄ds t n l c t l l o f e a c hz i n cn n g e ro f z n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) 嬲w e l ia s 廿忙r o l ep l a y c db y c hz i n cf i n g c ri nw h o l ez n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) ，t l l e r e f 0 1 et h a tw 1 lp r o v i d eu s c m li n f o 啊a t i f o rr c v e a l i n gt h eb i o l o g i c a lf i l n c t i o no f z n f l 9 1 f o rs t i l d y i n gt h ep r o p e r t y s t r i l c t i i 佗柚d 如n c t i o no fap m t c i n ，as y s t e mw h i c hc a ns t a b l y 彻dh i g h - e 街c i e n t l ye x p r c s st h et a 唱c tp r o t e i nw t hs j m p i ep u r i f i c a t i o np m c e d u mi sc m c i a l i ne x p e r i m e n t a lp r o c e s s ，w ef o u n dt h a tt h ep r e v i o u se x p r e s s i o n柚dp u r i f i c a t i o no f 刁师1 9 l ( 2 4 3 - 3 6 8 ) h a v em 锄yd i f f i c u l t i 鸭e s p e c i a l l yt l l ez i n cf i n g c r - d e l e t i o nm u t 觚t sa r ed i m c u l tt 0b eo b t a i n e d s ow eh a v e 谢e d 向u re x p m s s i o ns y 咖m s ，i e 邮a _ 1 8 b l 2 l ( d e 3 ) g l u 鼬i o n es 一舡a i i s 缸私e ( g s t ) ，h i s _ t a ga n dk e t o s t c m i di m e r a ( k s l ) e x p r e s s i o ns y s t c m s a n dw eb a v ec h a m c t c r i z e dt i l e p r d t e i n so b 协i n e df b md i f f b r e n te x p r e s s i o ns y s t e m s w ec o n s n l i 咖ds e v e m ir c c o m b i n 锄tp l a s m i d sc o n t a i n i n gg c n e so fz n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) a n di t st i l m ez i n cf i n g e r - d e i e t i o nm u t 卸t s ( d f l ，d f 4 d f l f 4 ) i np t s a 1 8 b l 2 l ( d e 3 ) e x p m s s i o ns y s t e m t h o u g l lw ec 矾o b 诅i nz n f l 9 l ( 2 4 3 - 3 6 8 )a b s 嘲蕾吣mt l i i ss y s t e m ，砥z i n cf i n g e r - d e l e t i o nm u t a n t sc 舳n o tb eo b t a i n e d a n dt h ey i e l do fz n f l 9 l ( 2 4 3 - 3 6 8 ) i n4l i t c 陪o fm e d i u mi sa b o u tlm g i ti si n 鲫衔c i e n tf o rc o n t i i i u o u s a r c h e s ，懿p e c i a l l yf b rt i i es m j 咖r cs t u d i e s s ow et i yo t i i e re x p r e s s i o ns y 咖mt oo b t a i nm i l l i 舯mq u a n t “i e so fz n f l 9 l ( 2 4 3 - 3 6 8 ) 彻d戤z i n cf i n g * d e l c t i o nm u t a i l t s i ng l u t a t h i o n es - t i _ a n s f b m s ee x p r c s s i o ns y 咖mt l l es y n e 唱i cc x p r e s s i o no fg s tp r o m o t e st h e 麟p r e s s i o no f z n f l 9 l ( 2 4 3 - 3 6 8 ) ，w h j c hm a i ( e st h ee x p r e s s i o ni e v c io fg s | z n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) h i 曲b a s e do nt l l ea f f i n i t yo f g s tt 0g l u 组t i l i o n es e p h a r o 4 b ，w ec a no b t a i ng s l 二z n f l 9 l ( 2 4 3 - 3 6 8 ) s i m p l yb yo n es t e pp u r i f i c a t i o n w bm i x e dt h es e p h a r o s e 他s i nb o u n d e dg s t z n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) w i t has y n t h c t i cd n ao i i g o n u c l e o t i d ep o o l ，卸do b t a i n e d 峙d n ao l i g o n u c l e o t i d e q u 锄c ew h i c hc 肌t i g h t l yb i n dw i t l lz n f l 9 l ( 2 4 3 - 3 6 8 ) a r c rr e p e a t c dw a s h i n ga n d 枷p l i f i c a t i o n b ym e 锄so f t h i se x p e r i m e n tw eo b t a i n e d6 9i n d e p e n d e n tc l o n e sa m o n gw h i c h3 8 ( 5 5 )c o n t a i n e do n ea g g gb a s es e g m e n t ，1 2 ( 1 7 ) c o n t a i n e da g g a ，a g g c 锄da g g ts e g m e i l t t h ec o n n s u sb i n d i n gs e q u e n c ew 船s u g g e s t c dt ob eg g a g g gf b mt h el k q u e n c i e so f t | i eb 够ea te a c hp o s i t i o nu p o nf i x i n go f t h e “a g g g ”c o r e u s i n gt h i sc o n s e n s u sb j n d j n g q u e n c et os e a r c he u k a r y o t i cp 1 0 m o 忙rd a 协b a 辩w ef o u n dm a n yp r o m o t e r so fh u m a ng e n e sc o n t a i n e dt h i sb i n d i n gs i t cw h i c hi s mc o n s i s t c l l c ew i t l lt h ef h c tt l l a tz n f l 9 1i sw i d e l ye x p r e s s e di nh u m 锄t i s 蛐e s 1 1 1 i sr e s u i ti n d i c a t c sm a tz n f l 9 1p o s s i b i yh 舾g e n er e g u l a t i o nf i i n c t i o n u s i n gn u o r e s c e n c es p c c 仃o s c o p yt l l eb i n d i n ga b i l i t yo fg s t - z n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) t ot h eo b t a i n e dd o u b l e s t f 卸dd n as e q u e n c ew 髂a l s oe s t i m a t e db yc o m p c t t i o nw i t he b t h er c s u l ta l s os h o w e dt h a tt h e mw 髂s 口o n gi n t c m c t i o nb e “，嘲it h e m a s 佗p o r t e dg s tc 锄p m m o t et h ec r y s t a l l 妇i o no ff i i s i o np r o t e i n ，w eh o p et oo b t a i nt h es n i l c t i i r ei n f o m a t i o no fz n f l 9 1 ( 2 4 3 3 6 8 ) 疗o mt h eo b t a i n e dg s tf i i s i o np m t c i n s h i s - t a gf i l s i o nc x p r c 嚣i o ns y g mw 舔d e v e l o p e di nr c c e n ty e a r s f o rt h et e m i n a lo fe x o g e n o u sp m t e i nt a g g e dac o n t i n u o u sh i s t i d i n e 陀s i d u e s g m e n tt h et 卸曙e tp m t e i nc 锄b ee a s i l y 卸ds i m p l yp u r i f i e db yn i t n t a 陀s i n s o m e s e a r c h e sd e m o n s t r a t e dt h a ts m a l lh i s - t a gd o e sn o ta 仃b c tt h es n l i c t u 锄df i i n c t i o n 甜m ce x o g e n o u sp m t e i n s ow cc o n s t m 咖dt h eg 翎e so fz n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) ，i t ss i t c d i r e c t e dm u t a n t s 卸dz i n cf i n g e r - d e l e t i o nm u t a n t s p a r a t e l y a tl a s t w co b t a i n e dt h e s ep r o t c i n sw h i c h 撇( h i s ) 6 剧f 1 9 l ( 2 4 3 - 3 6 8 ) ，( h i s ) 6 一f 3 h 4 oc y 蛐 i n em s i d u e so fz i n cf i n g e r3o fz n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) w e 他m u t 种e dt oh i s ) ，( h i s ) 6 一f 3 ，s s ( t w oh y d r o p h o b i c 姗i n oa c i d so fz i n cf i n g e r3w e r em u t a t e dt os e r )a b s t r a c ta n dz n f l 9 l ( 2 4 3 - 3 6 8 ) ( h i s ) 8 u n f o r t u n a t c l y ，w es t i l lc 锄n o to b t a i nt l l ez i n cf i n g e r - d e i e t i m u t a n 协f b rl o we x p 佗s s i o nl e v e ia n di n s t a b i l i t yo ft h ez i n cf i n g c r - d e i e t i o nm u t a i l t si nt h i ss y s t e m 1 1 1 ec ds p c c 们o f t i l e p r o t e i 船w e v i s i b l yc h 卸g e dw h e nz i n ci o nw 啪p 咖o v e d ，e s p e c i a i l yf o rt h e ( h i s ) 6 - f 3 s sp m t c i n s oz i n ci 卸dh y d m p h o b i ca m i n o i d s 陀s i d u e sa me s s e m i a lf o rs u s t a i n i n gt h es n i l c t u mo f z i n cf i n g 盯d o m a i n w h e nz i n ci o nw 勰a d d e dz i n cf i n g c rp m t c i n sc 锄陀s t 0 t l l e i ro r i g i n a ls t m c t u r e se x c e p tt h ez n f l 9 l ( 2 4 3 - 3 6 8 ) - 饵i s ) 8p m t e i n i ti sp o s s i b l et h a th i 酬 a ga tt h ec t c m i 舱li n t e m 螂t h i sp r o t e i np r o p e rf o l d i n g 所咖w ea i f o u n dt h a t( h i s ) 6 一f 3 h 4 粕dz n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) 一( h i s ) 8p o s s e s st l l ea b i “t yo f h y d m j ”i cc l e a v a g cd n a t i l i sr e s u i ti n d i c a t e st i l a tf o u rh i s t i d i n er e s i d u e sc o o r d i n a t e dw i t i lz i n ci o nc a l lf o mas w h i c hi ss i m i l a rw i t l lt l l e t i v es i t eo f h y d r o l a s e ni so n eo f t h ep o s s i b l er e a s o n s ，e x p l a i n i n gw h yi nn a t u r cp r o t e i n sd on o tc o n 组i n 量4 一t y p ez i n cf i n g e rd o m a i n s t h e 佗s u l t si n d i c a t e dt l l a tu s eo fh i s - t a ge x p r e s s i o ns y s t c mn d st 0b ec a u t i o u s l yc o n s i d e r e df o rz i n cf i n g e rp r o t c i n sw h i c hm a n l yd e p e n d t h ec o o r d i n a t i o no f c y s 粕dh i st oz i n c w eh a v ei d e n t i n e dt h ed n a _ b i n d i n gs c q n c eo fz n f l 9 1 ( 2 4 3 3 6 8 ) a n do b t a i n e ds e v e m lm u t a n 峨b u ts t i l lc o u i dn o to b 诅i nt h ez i n c 丘n g e r - d e i e t i o nm u t a n t s i no r d e rt oo b 协i nz i n cf i n g c r - d e l c t i o np r o t c i n s 锄du n d e r s 协n dt h ed i 丘毫r c n c e 锄o n gf o l l rz i n cf i n g e rd o m a i n so f 刁虾1 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) w em e dk e t o 啦m i di s o m e r a ( k s i )e x p r e s s i o ns y s t e ma g a i nw ec o n s t n i c t c dt w og 蛐e so fz i n cf i n g 盯3 ( z f 3 ) 硼d4 ( z f 4 ) o fz n f l 9 lt o g e t h c rw i t hk 曲o s t e r o i di s o m e r a 辩g e n ei l lp e t - 3 l bv e c t o l 辩p a r a t e l y ，粕do v e r e x p r c s s e dt i l ef l l s i o np 1 o t e i n si nt i i ef 0 咖o fi n c l u s i 蛐b o d i e si ne 髓b l 2 l ( d e 3 ) p l y s ss 仃毽i nb e c 卸o f t i l ei l l s o l u b i l i t y 柚ds y n e 喀i ce x p r e s s i o no f k s i 1 1 1 ei n c l u s i o nb o d yw a sp u r i f i e d b yw a s h i n gs c v e r a l t i m e sa i i di t sc o n t e mo f t h ez f 3( o rz f 4 ) i sm o r et h 锄8 0 ，w h i c hc 粕d i r e c t l yb ec l e a v e db yc y 柚o g 锄b r o m i d et o咒l e a s cs 协g l ez i n cf i n g e rp e p t i d e s b a 靼do nt h ed i 仃b r 锄c e so fm o l u l 盯w e i g h to fk s i 锄ds i i l g l ez i n cf i n g c r ，w ec 雏o b t a i ns i n g l ez i n cf i n g e rp 印t i d ew h o s ep u r i t yi sm o r em a i l9 5 a i l dy i e l di sm o t i i a n2 0m g lb ya m i c o ny mf i l m sf i i n 锄i 1 1 1 ec i f c u l 盯d i c h r o i s ms p e c 打ao ft w os i n g l ez i n cf i n g e rp e p t i d 豁t i 竹a t c db yz n ( i i )d e m o n s 仃a t e dt i l a tt l l e yh a v ed i f f b n t c o n 出ys n u c t u m ，卸dz i n ci o ni sn e s 翰r yf o rp c p t i d ef o l d i n g s om i sc x p 嘲s i o ns y s 锄np r 0 v i d e si l sas u i t a b i em e t h o df o re x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o no f 铷a i lp e p t i d e s a n dp r o v i d e sa b u n d 卸tp c p t i d ef o ra b m 嘲p r o p e r i ys t i i d i e s f 煳t l i eg t i i d i e so ff o u rc x p m s s i o ns y 咖m sw e 帅d e 体t a i l dt i i ee x p 化豁i o n 卸dp u r i 丘c a t i o no fp r o t e i nn e e dt ob eg r o p e db yal o to fe x p c r i m e n t s w h i l ew e 研e dt l l e c x p r e s s i o ns y s t 哪sw ei d e 眦讯e dt h ed n a - b i n d i n g q u e n o fz n f l 9 1 ( 2 4 3 - 3 6 8 ) u s i n gt h ea f f i n i t yo f g s ti nf i i s i o np r o t e i nt o s i n w ek n e wt h a tz i n ci 舳dh y d m p h o b i c 锄i n o i d 陀s i d u e sw e 他n e s s a 拶f o r 蛐s 诅i n i n gt l l es t m c t u r eo fz i f i n g e rd o m a i n sa n do b t a i n e dt w op m t e i n sh a v i n gt l l ea b j l i t yo fh y d r o l ”i cc i e a v a g ed n af 沁mh i s - t a g 向s i p m t e i n s w ba l s u c c c s s f i i l i yo b t a i n e dz i n cf i n g e r3 觚dz i n cf j n g e r4o f z n f l 9 1 ( 2 4 3 - 3 6 8 ) u s i n gk s ie x p r e s s i o ns y 咖m ，粕df o u n dt h e 辩t 、oz i n cf i n g e r sh a dd i 仟e r c n ts t n i c t u r a lp r o p e r 啊t h e r c s u l t sd e e p e no t i ru n d e 巧t a i l d i n ga b o u tt i l er e l a t i o n s h i pa m o n gp r o p e r 吼s 扪j c t u m彻df i i n c t i o no f 刁师1 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) k e y w o r d s ：c 2 h 2z i n cf i n g e rp r o t e i f i ，z n f l 9 l ( 2 4 3 3 6 8 ) g l u 协t i l i o n es - t r a n s f e r a 辩，h i s t j d i n el a b e l k c t o s t e r o j di s o m e 翔c l c ：0 6 1 4论文独创性声明本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明并表示了谢意。作者签名：盘主：玺日期：丝丛乏翌论文使用授权声明本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。作者签名：查蛊：邀导师签第一章绪论第一章绪论目前，生物学中存在的令人惊叹的问题之一是：基因足如何在细胞组织中起作用的? 如果基因要被激活，几种作为转录因子的蛋白必须与基因上的启动子相作用，这种作用形式象一个开关：使d n a 的第二个基因片段转录为r n a 。而r n a 分子再作为模板合成特定的蛋白质( 有时r n a 也是最终的产物) 。但是，转录因子怎样确切的从细胞中众多的d n a 中辩别出启动子上的识别位点，仍然有待进一步的研究。而锌指蛋白的发现，以及后来对大量的锌指蛋白的性质、结构和功能的研究及生物体中许多转录因子中含有一个或多个锌指结构域的事实，彻底推翻了关于螺旋折叠螺旋( t h d 是d n a 结合蛋白结构域的普遍形式的论点，表明锌指结构域足一种更为普遍的d n a 结合基元，为解决上述问题带来了希望。自从1 9 8 0 年e n g e l k c 等从x e n o p u so o c y t e s 中纯化得到了转录因子i i l a( t f i i i a ) 后i l ”，人们发现含有锌指结构的蛋白普遍存在于真核生物体中。目前的研究表明：人类基因组约由3 0 亿个碱基对构成，仅5 左右的基因组序列编码蛋白，而据估计约占全部基因组1 的序列编码锌指蛋白【3 l 。因此锌指蛋白家族可以说是人体中最大的一个蛋白质家族。本文不可能对庞大的锌指蛋白超家族的每一个成员作全面的介绍，而将主要关注放在锌指蛋白中最为典型的c y s 2 h i s 2 ( c 2 h 2 ) 型锌指蛋白上。一、c 2 h 2 型锌指蛋白的结构与功能1 c 2 h 2 型锌指的结构c 2 h 2 型锌指，也称k r n p p e l 或经典型锌指。它具有最先从t f l l i a 得到的同源保守序列：y ，f x c - x 2 4 c x 3 一f x 5 l x 2 h x 3 h i s - x 2 6 ( 其中c 代表半胱氨酸，h 代表组氨酸，y 代表酪氨酸，f 代表苯丙氨酸，l 代表亮氨酸，x 代表任何氨基酸) 【3 】。序列中高度保守的两个半胱氨酸之间相差2 4 个氨基酸，两个组氨酸之间相差3 或4 个氨基酸，而半胱氨酸与组氨酸之间准确地相差1 2个氨基酸，每个锌指长约3 0 个氨基酸；其中两个半胱氨酸和两个组氨酸与z n 2 +形成四面体配位，形成一个由两段反平行的阻折叠和一段螺旋组成的稳定的“指头”状结构1 4 j ；而酪氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸正好在指状结构的顶端形成一个疏水内核，从而更加稳定了这一结构，如图l 所示。c 2 h 2 型锌指的o 【螺旋通常为3 1 0 螺旋，这在h x 3 h 一段的结构中尤为典型。第一章绪论f i g u 代l t h es 咖c t u m o f c 2 h 2 z i n c 行n g e r d 伽a i n 对c 2 h 2 型锌指结构的大量研究表明：其结构的稳定性主要是由锌的存在及锌结合位点侧面的保守疏水核来维持【5 l 。维持锌指p d c c 结构的稳定主要足由于锌离子的四面体配位，实验证实在锌缺乏时锌指不能形成折叠结构，而锌离子的缺乏也会导致其生理活性的丧失【6 】。由于单个锌指结构域的结构相对较为简单，并且结构域的正确折叠和功能的保持都有赖于锌离子的存在，而使它成为科学家们研究蛋白中金属离子的功能以及蛋白质折叠机理的理想模型【”。对于含有多个