（发酵工程专业论文）l组氨酸高产菌株的选育及发酵条件的优化.pdf

湖北工业大学硕士学位论丈 摘要 l 一组氨酸是一个含咪唑杂环的氨基酸，它是构成人体蛋白质的2 0 种氨基酸之 一是人体半必需氨基酸，其等电点为7 5 9 ，同时，还以多种形式广泛参与机体的 各种生理生化过程，其中包括组成多种生理生化的活性成分、清除细胞内氧化物和 参与免疫调节等。目前，国内正在努力研究利用发酵法生产l 一组氨酸，并努力使 其可以达到工业化生产。 本文主要的工作是菌种选育及摇瓶发酵条件的优化： ( 1 ) 本文探讨了l 一组氨酸的检测方法，最终对p a u l l y 显色法作出了改进，即在 其它条件不变的情况下，改变l 一组氨酸的添加体积，将原来的l m l 增加为改进后的 3 m l ，并利用改进后的p a u l l y 显色法作出了l 一组氨酸的标准曲线，其r 2 为0 9 9 9 8 ， 可将其用于大批量发酵后发酵液中l 一组氨酸的检测。 ( 2 ) 本文以一株谷氨酸棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u m 百u t a m i c u m ) s 。m 作为出发菌 株，利用紫外线( u y ) 、硫酸二乙酯( d e s ) 、亚硝基胍( n t g ) 进行多轮多次诱变， 并经过d 一组氨酸、6 一巯基嘌呤两种结构类似物的抗性梯度平板筛选，最终筛得一 株菌n 。产量达到5 6 1 m g l ，比出发菌株s 。提高了1 5 2 7 0 。 ( 3 ) 本文对摇瓶发酵的条件进行了优化，最终确定了种子培养基的最佳菌龄为 1 5 小时：菌种发酵的周期为7 0 h ：确定了培养基四种主要因素的添加量：葡萄糖 为1 0 ，硫酸铵为4 ，玉米浆为i 5 ，硫酸镁为0 2 ：3 0 0 m l 摇瓶的最佳装量为 3 0 m l ；种子培养液的最佳接种量为7 5 ；最佳起始p h 是7 ，4 ：摇床的最佳转速为 1 3 0 r m i n ； ( 4 ) 本文通过发酵条件的优化，将得到的最佳工艺条件应用于高产菌株s 。和n 。 其最高产量分别达到了5 7 7 m g l 和7 2 0 m g l ，l - 组氨酸的产量比进行优化之前分别 提高了4 6 。4 和2 8 3 。 关键词：l 一组氨酸，诱变育种，梯度平板，发酵条件优化 湖北工业大学硕士学位论文 a b s t r a c t l h i s t i d i n ew a sa na m i n oa c i dw i t hah c t e r o c y e l i ci m i d a z o l e i tw a sa l s oo n eo ft h e t w e n t ya m i n oa c i d sw h i c hc o m p o s e t h eh u m a np r o t e i n s ，i tw a sah a l f - n e c e s s a r ya m i n o a c i dw h i c he q u i p o t e n t i a lp o i n tw a s7 5 9 ，a tt h es a m et i m e ，i te x t e n s i v e l ya t t a c h e di t s e l f t om a n yk i n d so fp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lp r o c e s sw h i c hi n c l u d i n gi tc o m p o s i n g m a n ye l e m e n t so fs o m eb i o c h e m i c a lp r o c e s sa n de l i m i n a t i n go x i d ea n da t t a c h i n g m o d u l a t i o no fi m m u n i t y n o wi no u rc o u n t r yw ea r ed o i n gh a r dw o r kt op r o d u s e l h i s t i d i n eb yf e r m e n t a t i o na n dw eh o p et h a tw ec a na p p l yt h i st e c h n i q u et oi n d u s t r y i n t h i sa r t i c l eo u rc e n t r a lw o r kw a st og e tah i g h e rl h i s t i d i n ep r o d u c e ra n dm a k i n gt h e o p t i m i z a t i o no f b o t t l ef e n m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ： ( d i nt h i s a r t c l ew ed i ds o m er e s e a r c ho ft h em e a n so fs u r v e y i n gt h e l h i s t i d i n e ，f i n a l l yw em a d es o m ei m p r o v e m e n t sw h i c hw ec h a n g e dt h ev o l u m eo f l h i s t i d i n e ，c o n f i r m e das i m p l ea n df a s tm e a n so fp a u l l yc o l o r i m e t r yb yw h i c hw e c o u l ds u r v e yt h el h i s t i d i n ei nt h ef e r m e n t a t i o n a lf l u i d ：e x t r a c t e d3m ll h i s t i d i n et ot h e c u v e t t e ，t h e nw eg o tt h es t a n d a r dc u r v eo fl h i s t i d i n e ，a n dt h er zw a s0 9 9 9 8 ，w ec o u l d a p p l yi tt ol a r g es c a l es u r v e y i n g ( 2 ) w eu s e dc o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u m $ 9 11 4a st h eo r i g i n a ls t r a i n ，t h e nw eg e t t h em u t a n tb yp r o c e s s e dw i t hu v 、d e s 、n t g ，a n dt h e nc u l t i v a t eo nt h eg r a d sf l a t s w h i c hc o n t a i n e dd - h i s t i d i n ea n d6 - m g ，f i n a l l yw eg e tam u t a n ts t r a i nn a m e dn 1 3w h i c h c o u l dp r o d u c el h i s t i d i n e5 6 1 m g l ，a n dt h ep r d u c tw a si n c r e a s e d1 5 2 7 0 m o r et h a n s 9 1 1 4 ( 3 ) i nt h i sa r t c l ew eo p t i m i z e dt h eb o t t l ef e n m e n t a t i o nc o n d i t i o n s , f i n a l l yw ed e c i d e d t h eb e s to ft h es e e d sa g ew a s1 5h o u r s ；t h ec y c l eo ft h es l l a l nf e r m e n t a t i o nw a s7 0 h o u r s ；a n dw ed e c i d e db e s tf e r m e n t a t i o nc u l t u r em e d i u mc o m p r i s e d1 0 g l u c o s e ， a m m o n i u m4 s u l f a t e ，1 5 c o m s t e e pl i q u o r ，0 2 m a g n e s i u ms u l f a t e ；a n ew ed e c i d e d t h eb e s tv o l u m eo f f e r m e n t a t i o n ai i q u i dw a s3 0 m l i nt h e3 0 0 m lb o t t l e ；a l s ow ed e c e d e d t h eb e s te x t r a c t e ds e e d sf l u i dw a s7 5 ；t h eb e s to r i g i n a lp ho ft h ef e r m e n t a t i o nc u l t u r e m e d i u mw a s7 4 ；w ea l s od e c i d e dt h eb e s tr o t a t es p e e do ft h ec u l t u r em a c h i n ew a s 1 3 0 r m i n ( 4 ) b yt h eo p t i m i z i n go ft h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，w em a d et h eb e s tp r o c e s s a p p l y i n gt h es t r a i n ss 6 a n dn t 5 ，t h e nw eg e tt h ep r o d u c to fl h i s t i d i n ew a s5 7 7 m g l a n d7 2 0 m g lr e s p e c t i v e l y , a n dt h et h ep r o d u c tw a si n c r e a s e d4 6 4 a n d2 8 3 r e s p e c t i v e l ym o r et h e nb e f o r et h e k e y w o r d s ：l - h i s t i d i n e ，m u t a t i o nb r e e d i n g ，g r a d sf l a t s ，o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s 佩毒亡工爨火港 学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工 作所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个 人或集体己经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体， 均己在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：司德超日期：加i ；年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和 借阅。本人授权湖北工业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 学位论文作者签名：羽德超 指导教师签名：郡雁悔 日期：如年6 月 6 日 日期：摊名为6 日 湖北工业大学硕士学位论文 第1 章引言 1 1 l 一组氨酸的生理功能 l 组氨酸( a 氨基b 咪唑丙氨酸) ，l - 组氨酸是一个含咪唑杂环的氨基酸， 其分子式如下图所示： l 组氨酸是构成人体蛋白质的2 0 种氨基酸之一，是人体半必需氨基酸”1 ，其等电点 为7 5 9 1 2 1 ，同时，还以多种形式广泛参与机体的各种生理生化过程。其中包括组成多 种生理生化的活性成分、清除细胞内氧化物和参与免疫调节等。因此，组氨酸在动 物营养中有重要的作f f 3 1 。 1 1 1l 一组氨酸与免疫功能的关系 患有类风湿性关节炎病人的血清中游离组氨酸浓度偏低。研究表明l 一组氨酸 有抗类风湿性关节炎的活力，机理是它可以影响花生四烯酸代谢，降低了前列腺 素合成，而前列腺素是引起类风湿性关节炎炎症的一个重要中介物口1 。有人在青鱼 饲料中添加组氨酸做试验，发现了青鱼饲料添加组氪酸可以提高青鱼的生长速度， 降低饲料系数。减少青鱼养殖成本。并且发现组氨酸可促进青鱼饲料营养平衡性 4 1 。 1 1 2l 一组氨酸的抗氧化的作用 l 一组氨酸具有细胞内抗氧化作用。k u k r e j a 等f 1 9 9 3 ) 在对组氨酸的这种特殊作用 进行了详细研究【3 1 ，通过观察老鼠心脏“缺血一再充盈”后对组氨酸灌注或不灌注 的反应发现，组氨酸可以维持在“缺血一再充盈”条件下正常的心肌收缩( 9 4 5 9 ， 灌注反应值不灌注反应值，下同1 和冠状流量( 9 2 7 8 ) 。降低“缺血一再充盈” 所致的心率失常发生率以及持续时间，提高窦性节律持续时f n ( 1 0 6 6 6 2 6 ) 。“缺 血一再充盈” 使心肌细胞的超微结构明显受到损伤，表现为线粒体肿胀以及破 坏肌纤维膜和肌原纤维。灌注组氨酸可以减轻破坏程度。组氨酸对心肌的这种保 护作用主要是通过有效清除单个活性氧而实现的，而且保护效果要优于“超氧化 物歧化酶一过氧化氢酶一甘露醇系统”( s u p e r o x i d ed i s m u t a s es o d - c a t a l a 湖北工业大学硕士学位论文 s e m a r m i t 0 1 ) 。c a i 等( 1 9 9 5 ) 1 构 i ) q ：究也表明l j j ，组氨酸维持“缺血一再充盈”心脏细 胞的正常形态，并且减弱心肌细胞的酶释放。灌注组氨酸后，心脏中总腺苷酸代 谢池和能量释放速度明显优于末灌注组，其中a t p 和肌酸磷酸水平在充盈后可以恢 复到正常水平的7 3 和6 8 。因此，组氨酸除了清除氧化物外，还能保持高能磷 酸化合物水平，从而避免心脏受到严重破坏。组氨酸处理后的“缺血一再充盈” 大脑可以明显防止由于缺血所导致的延迟性神经元坏死，并且保持神经元分布密 度的均匀性。以上结果表明，组氨酸在细胞内具有清除氧化物、保护细胞正常功 能和维持细胞正常结构的作用。 1 1 3 组氨酸是动物的一种必需氨基酸 由于动物体呵以由普通的中间代谢物合成组氨酸，因此组氨酸一直被认为是 一种非必需氨基酸然而，随着研究的深入，人们发现幼龄动物和婴儿体内组氨酸 的合成量不能满足机体正常生长，即使是成年动物，如果不从食物中补充组氨酸， 体内合成的组氨酸也不能满足需要。组氨酸缺乏动物会表现相应的缺乏症状，许 多学者研究了组氨酸的缺乏症。组氨酸缺乏时出现的症状主要为：( 1 ) 负氮平衡； ( 2 ) 血清白蛋白下降；( 3 ) 血浆和肌肉游离组氨酸下降；( 4 ) 血红蛋白下降；( 5 ) 血细 胞比容下降；( 6 ) 肌肉中肌肽含量下降：( 7 ) 全血中铜和锌含量降低；( 8 ) 血清铁升。 补充组氨酸后，上述症状被缓解或消除。因此，为保证机体的正常功能，必需从 日粮中摄入定量组氨酸。组氨酸已经被列为猪和鸡的必需氨基酸。1 。 1 2 国内外氨基酸生产现状 目前，我国的药用氨基酸产量由1 9 9 4 年的6 0 0 多t 增长4 0 0 0 多t ，1 8 种必需氨基 酸中已有1 7 种实现了国产化。氨基酸类药物最大的应用领域是氨基酸输液，2 0 0 0 年约消费l 亿瓶【6 l 。据1 9 9 3 年公布的资料统计，全世界氨基酸产量达1 0 0 万t ，据估 计现在已不低于1 2 0 万吨l 。 国际氨基酸生产厂家主要有日本味之素、协和发酵田边制药以及德国的d e g u s s a 公司。日本在氨基酸产量、品种和技术水平均居世界领先地位，并在美国、法 国以及我国的四川、上海建有合资公司【8 】o 日本是氨基酸生产大国。1 9 8 1 年在华沙召开第一次氨基酸国际会议以后，r 本看准了氨基酸产业，1 9 8 7 年日本为保持其氨基酸生产与出口大国地位，通产省 湖北工业大学硕士学位论文 成立了由企业、大学和政府有关专家组成的“氨基酸化学研究会”，着手研究建 立以氨基酸为基础的新型化学产业体系。这进一步促进了日本氨基酸工业的发展 和技术进步。目前，日本的世界市场占有率为3 5 ，销售额占5 0 。日本除谷氨酸、 赖氨酸和蛋氨酸外，小品种氨基酸占总产量的1 2 ，大多数是氨基酸输液原料，控 制着世界氨基酸输液原料的一大部分市场。 欧美厂商一方面巩固和维持自己的传统市场，法国r h o n e p o u l e n e 公司和德 国d e g u s s a 公司控制着家畜补充饲料市场上占有最大份额的蛋氨酸市场，它们以 化学合成法年产2 0 力- t ，近年开始从事发酵法生产氨基酸。r h o n e p o u le n e 公司 还在美国、东欧寻找伙伴生产蛋氨酸、赖氨酸和苏氨酸、色氨酸。d e g u s s a 公司也 在开辟东欧市场，它与斯洛伐克b i o t i k a w g k 合资建立f e r m e s 公司，1 9 9 5 年其苏 氨酸产量达3 0 0 0 t 、色氨酸2 0 0 t 、赖氨酸1 0 0 0 t ”“。 1 3l 一组氨酸的国内外生产现状 在国内有能力生产组氨酸的厂家只有：湖北省八峰药业、上海味之素氨基酸 有限公司、武汉久安药业( 武汉第二制药厂) 、广州侨光药厂、深圳万和制药、 华瑞制药【“1 i n 2 ，并且目前国内l 一组氨酸主要是水解法生产，而发酵法生产还处于 实验室研究阶段，江南大学的顾正华、张伟国等利用谷氨酸棒杆菌a t c c 1 3 7 6 1 为出发菌株，经硫酸二乙酯( d e s ) 和亚硝基胍( n t g ) 诱变处理，d 组氨酸( d h i s ) 、 6 一氮尿嘧啶( 6 a u ) 等结构类似物平板和以卜组氨酸( l h i s ) 为惟一氮源平板 定向筛选，获得一株l 一组氨酸生产菌h 一2 4 ( d h i s 6 一a u h i s a s e ) ，在加有1 5 0 9 l 葡萄糖、3 5 9 l 硫酸氨以及1 0 m g l 玉米浆的发酵培养基中发酵7 2 h ，产l 一组氨酸 1 6 9 u 1 1 3 近年来有多家单位开展发酵法生产组氨酸的研究活动但因产酸率较低， 尚无法运用于实际生产。 国外如日本从七十年代开始研究“i 1 1 5 1 1 6 1 ，开始是利用理化诱变得到高产菌 株，日本的a r a k i 等人利用亚硝基胍对谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌进行诱变，然后 在培养基中加r n a 聚合酶抑制剂，再依次赋予2 - t h i a z o l e a l n i n e ( 2 噻唑丙氨酸) 、 6 一m e r c a p t o g u a n i e ( 6 一巯基鸟嘌呤) 、6 - a z a g u a n i n e ( 6 一氮鸟嘌呤) 6 一a z a u r a c i l ( 6 一氮尿嘧 啶) 、6 - m e t h l p u i n e ( 6 一巯基缬呤) 和5 - m e t h y p t o p h a n e ( 5 一甲基色氨酸) 抗性，得到产量 最高为1 0 5 9 l 。 随着分子生物学的发展，基因工程技术的广泛应用，开始利用基因重组的方 湖北工业大学硕士学位论文 法来得n l - 组氨酸的高产菌株，日本味之素株式会社在2 0 0 2 年公布一项专利，该 专利利用基因重组的方法得到l - 组氨酸的高产菌株。它的方法是从具有组氨酸拮 抗剂耐性的芽孢杆菌属的变异染色体获得d n a ，然后与媒介d n a 一起组入高产的 l 一组氨酸生产菌株中，通过筛选得到高产组氨酸的基因重组菌。该菌的产量最好 为2 3 9 l 。目前国外利用诱变筛选和基因工程技术相结合，l 一组氨酸的最高产量达 至u 4 0 9 l ，可进行工业化生产j 。 1 4l 一组氨酸菌种的选育途径 在一般情况下细胞只合成本身所需要的中间代谢产物，严格防止氨基酸、 核苷酸等物质的积累。当有氨基酸或嘌呤物质进入细胞后细胞立即停止该物质 的合成，一直到所供应的养料消耗到很低浓度，细胞才重新开始合成。细胞中这 种调节控制主要依靠两个因素，即参与调节的有关酶的活性和酶量，也就是反馈 抑制与反馈阻遏，如果要是某种中间代谢产物大量积累，必须解除反馈抑制和反 馈阻遏，破坏微生物正常的代谢途径，对它的代谢进行人为调控，以积累我们需 要的中间代谢产物。 1 4 1 l 一组氨酸的生物合成途径 l 一组氨酸是通过h m p 途径得到的氨基酸，由h m p 途径产生的5 一磷酸核糖经 过一系列的酶促反应得到。其代谢途径如下所示： 5 磷酸核糖一5 磷酸核糖焦磷酸一磷酸核糖a t p 磷酸核 糖a m p 一磷酸核糖亚甲胺基一5 一氨基咪唑一4 一甲酰胺核苷酸+ 磷酸 核酮糖亚甲胺基5 氨基昧唑4 甲酰胺核菅酸一5 氨基咪唑4 甲酰胺 核苷酸+ 味唑磷酸丙酮醇磷酸组氨醇 胡氨醇一 1 4 2 组氨酸代谢调节机制 湖北工业大学硕士学位论文 图ll 一组氨酸的代谢调节机制 在鼠伤寒沙门氏菌中，从磷酸核糖焦磷酸( p r p p ) 和a t p 生成组氨酸需要1 1 步酶促反应，因有两个酶是双功能酶，所以共有9 个酶所催化。组氨酸操纵子有9 个结构基因组成，决定了与组氨酸生物合成有关的9 个酶的分子结构，9 个结构基 因按大致的生化顺序在d n a 上形成一束，集中存在于d n a 某一区域内，组成一个 组氨酸操纵子，途经中的第一步是由磷酸核糖a t p 焦磷酸化酶所催化的限速反应 ，该酶受l - 组氨酸的反馈抑制。当组氨酸量超过微生物的生理需要时，组氨酸就 会反馈阻遏参与组氨酸生物合成的所有酶的合成，这种阻遏属于协调阻遏1 1 8 】 选种的原则是，一方面通过选育抗组氮酸结构类似物突变株的方法来解除终 产物组氨酸的反馈调节，因为结构类似物在其结构上与代谢终产物相似，可竞争 性地与变构酶或阻遏蛋白结合，抑制菌株的生长繁殖，从而抗终产物结构类似物 的菌株也可大量积累终产物，例如抗l ，2 ，4 一三唑丙氨酸( t r a ) 和抗2 噻唑丙氨 酸的菌株可以积累大量终产物l 组氨酸；一方面设法增 j i l 一组氨酸生物合成的5 一 磷酸核糖焦磷酸和腺嘌呤核苷酸的用量来解除它们生物合成中的反馈调节。这样 是设想在某些其它微生物中所指的l 一组氨酸生物合成和有关反应的调节机制，也 可适用于谷氨酸棒杆菌和黄色短杆菌。逐步赋予各种结构类似物抗性，可提高组 氨酸产率。由于在菌株的原来一个突变加上一个突变，再加上一个突变，这样逐 步地引入多个抗性标记，进一步解脱了组氨酸生物合成途径上的终产物调节，使 产量不断提高。 合成组氨酸的前体p r p p 也是合成腺嘌呤核苷酸的前体，所以p r p p 合成受各种 嘌呤核苷酸、嘧啶核苷酸的调节，或色氨酸的调节，而从p r p p 到腺嘌呤核苷酸的 合成还受到各种嘌呤核苷酸的调节，故对谷氨酸棒杆菌或黄色短杆菌的组氨酸生 湖北工业大学硕士学位论文 产菌进一步赋予嘌呤结构类似物、嘧啶结构类似物、色氨酸结构类似物抗性，则 可以解除对合成p r p p 及嘌岭核苷酸的调节，促进两者的生成、进而提高组氨酸生 产，例如赋予菌株嘌呤的结构类似物8 一氮鸟嘌呤、6 一巯基嘌呤抗性，也可提高l - 组氨酸产量。 1 5 本课题的选题意义和研究内容 1 5 1 本课题的选题意义 目前，l 一组氨酸同l 一色氨酸，l 精氨酸，l 一丝氨酸为市场上急需的氨基酸品种， 是影响我国实现氨基酸输液原料全部国产化目标的四种氨基酸之一，l 一纽氮酸生 产已经成为制约我国氨基酸行业发展的瓶颈之一。 当前，l 一组氨酸生产先进技术主要掌握在欧、美、日等发达国家手里，国外 l 一组氨酸的生产方法主要采用发酵法。国内有些单位和院校也曾开展l 一组氨酸的发 酵法研究，但由于菌种产酸水平较低，稳定性不够好等原因，始终没能形成产业 化能力。目前国内主要以猪血为原料，经强酸水解后，以离子交换层析法分离提 纯得到l 组氨酸。这种生产方法落后，操作条件恶劣，对环境造成很大污染，且 原料来源少，不宜大规模生产。通过本课题的研究，可以降低环境污染，降低生 产成本，对于淘汰落后的水解提取工艺具有示范作用。同时可推动我国氨基酸行 业的进步与发展，为我国氨基酸原料药提供实验和理论依据，发酵法与化学水解 提取法相比，具有极大改善环境状况，减少环境污染的优点，符合国家环保政策 和工业可持续性发展要求。 1 5 2 本课题研究内容 本课题为湖北省工业微生物重点实验室开放基金。拨款2 万元。 本课题的研究目标是将组氨酸生产菌进行理化诱变，然后让诱变株在含有l 一 组氨酸结构类似物的平板培养上培养，能够长出的菌在一定程度上解除了反馈调 节，能够积累一定的组氨酸。本课题的研究内容如下： ( 1 ) 将有产l 一组氨酸能力的菌株经平板筛选和摇瓶复筛，选出一株产l 一组氨酸较 高的菌株，作为出发菌株。 湖北工业大学硕士学位论丈 ( 2 ) 用各种物理化学方法( 紫外线、亚硝基胍、硫酸二乙酯) 对出发菌株进行 诱变，并作出致死曲线然后从平板上随机挑取单菌落并经发酵复筛得到产l h i s 量最高的一株菌。将其作为下一步诱变的出发菌株。 ( 3 ) 将获得的出发菌株按照致死盐线所获得的最佳诱变时间与剂量进行诱变， 然后利用l 组氨酸的结构类似物的抗性梯度平板进行筛选，定向选育得到解除终 产物l 组氨酸反馈抑制和阻遏的抗性变异菌株，从而使组氨酸大量积累。 ( 4 ) 经多次传代培养，得到稳定高产l 组氨酸的突变菌株。 ( 5 ) 进行培养基及培养条件、工艺技术参数优化试验，筛选有利于l 组氨酸突 变株生长和l 组氨酸大量积累的种子和发酵培养基，改进发酵工艺提高l 组氨酸 的产酸率。 湖北工业大学硕士学位论文 第2 章l 一组氨酸的检测及出发菌株的筛选 2 1 l 一组氨酸的检测方法改进 为了迸一步掌握组氨酸的生产环节提高生产得率，改进工艺，需对用于制 备组氨酸的母液进行分析。因此，建立一种简便可行的测定母液中组氨酸含量的 方法，对于生产具有指导意义。目前已有报导的组氨酸测定方法主要有：以电位 法确定终点的库仑滴定法【1 9 1 ：用碳糊修饰电极的伏安法【2 0 1 ；采用实验室组装的离 子交换色谱分析仪和柱后衍生荧光检测的高效液相色谱法1 2 1 i ；微分脉冲极 谱法1 2 2 i ； 微生物法f 2 3 1 ；荧光法f 2 4 l 及反相高效液相色谱法【2 5 1 等方法。 以上这些方法相对比较复杂，如果要进行大规模发酵筛选检测，利用这些方 法就会使效率降低，延长筛选出高产菌株的时间，因此，必须寻找一个简单快捷 的测定方法。因此，本实验采用p a u l l y 反应法1 2 6 j 1 2 7 1 【2 s 】1 2 9 】进行。组氨酸的检测， 此方法具有成本低廉，所需时短，很适合用于大规模的发酵检测筛选。 当有过量酸存在时，对氨基苯磺酸和亚硝酸钠可发生重氮化反应生成重氮苯 磺酸。在弱碱性条件下，后者可与组氨酸发生偶联反应( p a u l l y 反应) ，形成橘红色 的偶氮化合物。 亚邑严匀 重氮盐j 下离子作为亲电试剂，还可与酚类物质发生芳环上的亲电取代生成偶氮 化合物，酪氨酸带有酚基侧链，它也可与重氮化的对氨基苯磺酸反应形成橘黄色 化合物。因此在2 0 种氨基酸中，酪氨酸最有可能直接干扰该方法的测定结果。比 色法测定组氨酸的测定步骤1 2 9 】：移取适当稀释的h i s 溶液至2 5m l 的比色管中，加 入l m l l 对氨基苯磺酸溶液和i m l5 n a n 0 2 溶液，混匀后使其反应1 5m i n ：用 吸管快速吹入1 0 的n a 2 c 0 3 溶液3m l ：振荡l o s 后， j 1 , & 1 0 m l 2 0 乙醇溶液，混 晷一事y镘雪y 卜一_ 湖北工业大学硕士学位论文 匀，同时盖上瓶塞室温下静置5 m i n ；定容至2 5 m l 在7 2 2 分光光度计上于51 0 n m 处 比色。1 9 2 0 年p ，有人依据重氮苯磺酸与组氨酸可发生偶氮反应的原理，设计了 组氨酸的比色测定法。但该法颜色消退很快。并且需要烦琐的冰浴处理，碱浓度 的变化对测定结果有较大影响。随后许多人对这种方法进行了广泛的研究1 9 4 2 年， h t m a - c p h e r s o n 3 q 用对氨基苯磺酸和亚硝酸钠代替不稳定的重氮苯磺酸以碳酸 钠取代氢氧化钠调节反应体系至弱碱性研究发现，加入2 0 乙醇有利于反应产 物颜色的稳定p a u l l y , 显色反应。之前h a n k e - 与k o e s s l e r | 3 2 1 1 1 3 3 1l 3 4 1 及其以前的研究者 们在研究该法时，都是通过滤光片获得透射光：h f r a e n k e l - - c o n r a t 等使用的波长 为5 1 0a m ；p a u l l y 反应产物在可见光范围内的吸收情况及最大吸收波长未见详尽报 道，一般都认为在5 1 0n l n 附近。后来，有人【35 l 对此进行了一些探讨，发现经u v 3 0 0 0 扫描分析，p a u l i y 反应产物在4 7 6 n m 处具最大吸收峰。 对于分光光度法，必须使 显色反应反应完全才能进行0 d 值的测定，而在不影响结果的前提下，时间越短则 该法应用起来越方便。潘军华、张星元等p 5 j 经过研究发现，反应5 3 0m i n 后进行比 色，其结果差异不大，反应时间超过5m i n 后o d 值己变化不大，超过1 0m i n 后基本 持平，故而确定反应时间为1 0 m i n 。前人在进行比色法测定组氨酸的研究中，发现 温度对显色反应有较大影响，一般在冰浴条件下较稳定，而温度高的时候显色反 应的产物会不稳定。h i t m a c p h e r s o n p 2 9 1 发现，通过加入乙醇可以使所形成的颜色 在室温( 2 5 ) 下保持稳定而潘军华、张星元等【3 5 1 在研究中发现，温度及乙醇的加 入量对显色反应影响都不大，而在反应后加入2 0 乙醇时的结果较稳定。为方便 起见，反应温度为室温即可。 以前研究者遇到的问题就是偶氯化台物不稳定，产生的橘红色很快消退【3 6 1 。 后来有人1 3 卅测定了反应产物放置不同时间后的o d 值以确定其稳定性。结果发现显 色反应还是比较稳定的，褪色现象也不明显，6h 后仍能基本维持原来的a 值，而 经过l o s 的振荡就可进行a 值的测定了。并且，不同质量浓度的组氨酸与显色剂反 应后，其产物都比较稳定。 苯丙氮酸对该显色反应最可能产生干扰，而其他杂环氨基酸也是潜在的干扰 源， 有研究表明，大量精氨酸存在的情况下( 组氨酸质量浓度的2 0 倍上) 对结果没 有影响，赖氨酸、谷氨酸、苏氨酸、亮氨酸、色氨酸等在一定质量浓度范围内对 测定也没有明显的影响，当质量浓度偏高时对曲线的线性相关系数则有轻微影响。 色氨酸、酪氨酸一般在发酵液中质量浓度极低，而酪氨酸在水中的溶解度更是很 低，其对测定的影响也在可允许的范围内。潘军华张星元等在在一定浓度范围 内，0 i ) 4 7 6 。与组氨酸的量之间呈直线关系；组氨酸添加量大于此值，目, q o d 4 7 6 。值 趋于平稳：故而初步确定在线性范围的l 一组氨酸浓度为3 9 3 1 2ug m l 。 湖北工业大学硕士学位论文 用上述的方法法测定了其中组氨酸的含量，并以氨基酸分析仪的分析结果作 为参照进行比较以检验此法的实际应用性，比色法与氯基酸分析仪的分析结果 相比相对偏差不超过5 1 3 5 j 。并且由于其方法简单，大大降低成本，可用于大规 模的实验室摇瓶发酵检测。 通过以上分析，最终确定p a u l l y 反应产物的最大吸收峰在4 7 6 n m 处，室温下添 加2 0 的乙醇溶液显色产物稳定，静置6h 以上o d 值没有明显衰减，因此测定可在 室温下进行l 组氨酸浓度为3 9 3 1 2ug m l 时p a u l l y 反应产物o d 值与组氨酸质 量浓度呈线性关系。比色法测定结果与氨基酸分析仪所测定的结果相比较，相对 偏差不超过5 。 2 1 1 材料与方法 2 1 1 1 材料 2 1 1 1 1 试剂 l 组氨酸标准品 亚硝酸钠 对氨基苯磺酸 无水碳酸钠 2 1 1 1 2 仪器 a r a r a r a r g w - 7 2 2 型可见分光光度计 3 0 w 紫外灯 2 1 1 2 试验方法 武汉新锐生物公司 湖北大学化工厂 中国医药集团上海化学试剂公司 上海虹光化工厂 上海精密仪器有限公司 顺德市展达电器厂 2 1 2 tp a u l l y 显色法的改进 按照p a u l l y 显色法进行操作时，发现一个问题：在分光光度计4 7 6 n m 处检测a 值时，得到的a 最大只有0 1 8 9 ，所得的标准曲线不够精确，因此，从所添加的l 一 组氨酸的体积着手对p a u l l y 显色法进行改进，在其他条件不变的情况下，改变加入 l 一组氨酸的体积，设计加入的l 一组氨酸的体积分别为l m l 、1 5m l 、2m l 、2 5m l 、3 m l 、3 5m i 、4m l ，然后对比，选出最佳的l 组氨酸添加体积，用以制作l 一组氨酸 标准曲线。 2 1 1 2 2 用改进后的p a u i f y 显色法制作l 一组氨酸标准曲线 在l 一组氨酸的最佳添加体积确定后，其它条件不变，再用p a u l l y 显色法制作l - 组氨酸的标准曲线。 2 1 ，2 结果与分析 湖北工业大学硕士学位论文 2 1 2 1p a u i i y 显色法的改进结果 在p a u l l y 显色法，改变l 组氨酸的添加体积后，反应产物经检测a 值后，其a 值的最大值如下表所示： 表1p a u l l y 显色法改进结果 从上表可以看出，当l 组氨酸的添加体积为3 m l 时，a 大小适度，低于3 m l 时太 小，高于3 m l 时则太大，因此，在制作l 组氨酸的标准曲线时， l 一组氨酸的最佳 体积为3 m l 。 2 1 2 2 利用改进后的p a u | i y 显色法制作标准曲线结果 配置不同浓度的标准l h i s ( m g m l ) 溶液，通过改进后的p a u l l y 法，得到其吸 光值a ，如下表所示： 表2 不同标准l 一组氨酸浓度的吸光值a 以l h i s 的浓度为横坐标，吸光值a 为纵坐标，将表中的数据进行线形回归分析， 得到回归方程，并绘制l h i s 的标准曲线如下图所示： 0 5 m 4 制0 3 蠢oz 0l o 0 m0 0 5 0o l o 0 1 500 20 0 2 50 0 30 0 3 5 组氨睦旅度( m g 向1 ) 图ll h i s 标准曲线 标准曲线的方程为y = 1 4 8 x 一0 0 0 1 6 ，相关系数r 2 = o 9 9 9 8 ，可以用于以后实验中 发酵液的检测不过在测定发酵液中l 一组氨酸的含量时，要先对发酵液进行处理。 2 1 3 结论 ( 1 ) 本节探讨了l 一组氨酸的测定方法，并对p a u l l y 显色法作了一定改进，将l 一组 氨酸的添加量由l m l 改为3 m l ，使l - 组氨酸的标准曲线更加准确可以利用这个标 湖北工业大学硕士学位论文 准曲线来测定发酵液中l 组氨酸的含量，为以后大规模发酵检测提供了实验依据。 ( 2 ) 本实验利用改进后的p a u l l y 法制作了l i l i s 的标准浓度曲线，其线形方程为 y = 1 4 8 x 0 0 0 1 6 ，相关系数r 2 = o 9 9 9 8 ，可以用于以后试验中发酵液的检测。 2 2 出发菌株的筛选 l 一组氨酸定向育种选育优先考虑的菌株有黄色短杆菌( b r e v i b a c t e r i u m f l a v u m ) 、谷氨酸棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u m g l u t a m i c u m ) 和粘质赛氏杆菌，本实 验室有前面两种菌，即谷氨酸棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u m ) 和黄色短杆 菌( b r e v i b a c t e r i u m f l a v u m ) 根据出发菌株选择的一般要求3 7 1 本试验将从这两种菌 种筛出l 组氨酸产量稍高的一株菌作为出发菌株，用于以后的诱变育种。 2 2 1 材料与方法 2 2 1 1 材料 2 2 1 1 1 菌种 以谷氨酸棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u m ) s 9 1 1 4 、黄色短杆菌( b r e v i b a c - t e r i u m f l a v u m ) w h 、黄色短杆菌u v h - - 种菌株为平筛菌株，由湖北工业大学工业 微生物重点实验室再生资源微生物转化研究室提供。 2 2 1 1 2 培养基( g l ) ( 1 ) 完全培养基( c m ) ：葡萄糖l o ，蛋白胨1 0 ，牛肉膏1 0 , y a o5 ，琼f l 旨2 0 ( 起始 p h 7 0 ) 。 ( 2 ) 种子培养基：葡萄糖2 5 ，( n 1 4 ) 2s 0 45 ，玉米浆3 0 ，k h zp 0 4 | ，m g s 0 4 。7 h 2 0 o 5 ，c a c 0 3l o ( 起始p h 7 o ) 。 ( 3 ) 发酵培养基：葡萄糖1 0 0 ，( n 1 4 ) 2 s 0 4 3 0 ，玉米浆5 ，k h zp 0 4 1 ，m g s 0 4 7 h 2 0 0 5 ，c a c o s 2 0 ( 起始p h 7 o ) 。 2 2 1 2 3 试剂 亚硝酸钠 a r 湖北大学化工厂 对氨基苯磺酸 a r 中国医药集团上海化学试剂公司 无水碳酸钠 a r 上海虹光化i ：厂 2 2 1 2 4 仪器 手提式压力蒸汽灭菌器 上海华线医用核子仪器有限公司 湖北工业大学硕士学位论文 g w ，7 2 2 型可见分光光度计 上海精密仪器有限公司 3 0 3 2 电热培养箱上海崇明实验仪器厂 t c l 1 6 c 台式离心机上海安亭科学仪器厂 2 2 1 2 试验方法 2 2 ，1 ，2 1 菌携培养方法“1 ( 1 ) 种子培养：从完全培养基接l 环菌到装有2 0 m 1 种子液的3 0 0 m l - - - 角中，1 0 0 r r a i n3 0 振荡培养。 ( 2 ) 发酵培养：在装有2 0 m l 发酵培养基的3 0 0 m l z 角瓶中接a 1 m 1 种子液，在往复 式摇床上3 0 ，振荡培养7 2 h ，转速1 0 0 r m i n 。 2 2 1 2 2 发酵液中l 一组氨酸的测定 首先处理发酵液，将发酵液7 0 0 0 d m i n 离一e , 7 m i n 后，稀释一定的倍数，用改进 后的p a u l l y 显色法显色后在紫外分光光度计上测得吸光值，然后对照前面作出的l 一 组氨酸标准曲线，算出发酵液中l 组氨酸的含量。 2 2 2 结果与分析 2 2 2 1 出发菌株的选择的结果 将三种出发菌株经摇瓶多次发酵后，用改进后的p a u l l y 法检测l 一组氨酸的含量， 检测结果如下表所示： 表3 三种出发菌株l - 组氨酸发酵结果( r a g l ) 其直观图如下所示 湖北工业大学硕士学位论文 晤面丽i 蔺 ! ! s ! u 。jit s 9 1 1 4 i q tt l v i _ i 出发菌株 图2 三种菌株l h i s 产量 由图2 可知，s 9 经发酵后其l 组氨酸的含量明显高于其它两株，且经过五次 以上传代发酵检测后，产酸稳定，因此选择s 9 4 作为出发菌株。其对数生长期在 8 - 1 2 h 之间，因此在以后的诱变中，选择培养1 2 h 的菌株进行诱变。 2 2 3 结论 本试验从三种出发菌株s 9 1 1 4 、w h 、u v h 中挑选出l h i s 产量较高的一株s 9 1 1 4 ， 其l - h i s 产量为2 2 2 m g l ，可用此作为原始出发菌株进行理化诱变，以得到高产l - h i s 的突变菌株。 啪 啪 啪 o 湖北工业大学硕士学位论文 第3 章三种诱变方法致死曲线的制作 l 一组氨酸的生物合成途径中没有支链代谢途径，并且终产物l 组氨酸过量时可 抑制前面酶促反应中酶的活性和阻遏酶的合成，因此，高产l 组氨酸的育种原则 一方面是在通过在一定程度上解除l 一组氨酸结构类似物的抗性抑制，从而积累终 产物，达到育种的目的：另一方面则是通过增加前体物的合成【1 8 】。要得到大量的 突变株，仅靠菌种自发的突变是远远不够的，因为一个基因的自然突变率仅1 0 8 l o 。o 左右。为了