（分析化学专业论文）纳米颗粒在细胞分析和环境毒物检测中的应用.pdf

摘璎 纳米颗粒在细胞分析和环境毒物检测中的 应用 分析化学专业硕士研究生祁文静 指导教师黄承志教授 摘要 纳米颗粒由于具有独特的光 电 磁等特性 在环境分析 食品检测 生化分析 细胞 成像 催化等领域得到了广泛的应用 本文利用纳米颗粒与细胞 生物分子等特殊的作用研 究了纳米颗粒在细胞成像分析和环境有毒物质的检测方面的应用 具体内容包括以下四个方 面 1 采用液相还原法一步式合成了粒径均匀 散射光较强且颜色纯净的氧化亚铜纳米颗粒 c u 2 0n p s 该纳米颗粒散射性能好 暗场散射光学成像中散射纯净的蓝色光 之后将其应用 在细胞暗场光学散射成像中 发现转铁蛋白介导的c u 2 0n p s 可以进入到人神经瘤母细胞中 在细胞质中仍然发射蓝色散射光 同时它还可作为蛋白构象分析的一种探针 2 d n a 的四种碱基中 只有t 碱基可与三聚氰胺形成三个氢键 基于三聚氰胺和t 碱基 间这种特异性的氧键作用 单链d n a s s d n a 可以缠绕在金纳米颗粒 a u n p s 表面 保 护金胶不聚集 而加入交联剂后 由于其与d n a 分子可以结合 从而将缠绕着d n a 分子的 a u n p s 拉近 使a u n p s 发生聚集 结合这些理论本文发展了一种具有很高的特异性 灵敏地 检测奶制品中三聚氰胺的等离子体共振散射法 线性回归方程为 d p m s 一1 1 2 1 4 1 0c m e l a m i n e r i m 相关系数为0 9 9 0 5 线性范围为8 0n m 一1 0 0 0n m 该方法的检测限为2 0n m 同时该方法还可实现可视化 简单 快速 最低检测三聚氰胺的浓度为4 0 0n m 3 从金汞齐形成的角度 以c t a b 包被的正电a u n p s 为材料 研究了在水溶液中汞齐快 速形成的过程 在h 9 2 存在时 该a u n p s 可以由红色变为橙红至黄色 形态由球形变为棒状 直至变为不规则的较大的石头状 我们用等离子体共振吸收 散射和扫描电镜表征了这一过 程 用x 射线电光子分光光度计证明了汞齐的形成 同时基于此现象还建立了可视化 快速 检测环境有毒重金属离子h 9 2 的方法 4 基于多壁碳纳米管 m w c n t s 能有效猝灭荧光染料的荧光 s s d n a 能缠绕在 西南大学硕士学位沦文 m w c n t s 双链d n a d s d n a 则不能缠绕在m w c n t s 本文发展了 种基于t h g t 复 合物荧光法检测h g 的方法 在优化条件下 发现体系在波长为5 7 9l i r a 处的荧光强度 劲与 h 9 2 的浓度在0 2 9 m 一0 9 i t m 范围内呈线性关系 线性回归方程为 i f 一1 8 7 7 0 0 9 c r o 9 8 6 0 检出限为0 0 2p m 关键词 氧化亚铜纳米颗粒汞离子三聚氰胺氢键多壁碳纳米管 a b s t r a c t a p p l i c a t i o n so fn a n o p a r t i c l e s i nc e l l i m a g i n g a n dd e t e r m i n a t i o no ft o x i c 一 j 1 n sud s t a n c e si ne n v i r o n m e n t m a j o r a n a l y t i c a lc h e m i s t r yp o s t g r a d u a t e w e nj i n gq i s u p e r v i s o r p r o f c h e n gz h ih u a n g a b s t r a c t o w i n gt ot h eg o o de l e c t r i c a lp r o p e a i e s o p t i c a lp r o p e r t i e s m a g n e t i s ma n ds oo n n a n o p a r t i c l e s h a v eb e e nw i d e l ya p p l i e di nt h et h ef i e l d so fe n v i r o n m e n ta n a l y s i s f o o dd e t e r m i n a t i o n b i oc h e m i c a l a n a l y s i s c e l li m a g i n g c a t a l y s i s e t c s o i nt h i st h e s i s b a s e do n t h e s p e c i a lp r o p e a i e so f n a n o p a r t i c l e sw i t hc e l l sa n db i o m o l e c u l e s w ei n v e s t i g a t et h ea p p l i c a t i o no fn a n o p a r t i c l e si nc e l l d a r k f i e l dl i g h ts c a t t e r i n gi m a g i n ga n dd e t e r m i n a t i o no ft o x i cs u b s t a n c e si ne n v i r o n m e n ts u c ha s m e l a m i n ea n dh 9 2 a sf o l l o w s 1 af a c i l es o l u t i o n p h a s es y n t h e s i sr o u t eo fh i 曲l yu n i f o r mc u 2 0n a n o s p h e r e s c u 2 0n p s i n o n es t e pw a sd e v e l o p e da n dt h ep r e p a r e dn a n o p a r t i c l e ss c a t t t e rp u r eb l u el i g h t w ea p p l i e dt h e ma s a no p t i c a lp r o b ef o rl i v ec e l li m a g i n gb yd a r k f i e l dm i c r o s c o p y t h et r a n s f e r r i n e o n j u g a t e dc u 2 0 n p sc a l lg e ti n t ot h et h eh u m a nb o n em a r r o wn e u r o b l a s t o m ac e l l sa n ds h o ws t r o n gp u r eb l u el i g h ti n c y t o p l a s mm a y b eo w i n gt ot h er e c e p t o r m e d i a t e de n d o c y t o s i s c u 2 0n p sc a na l s oa c ta sap r o b ef o r c o n f i g u r a t i o no fp r o t e i n sl e a d i n gt ot h el o c a ls t r u c t u r a la l t e r a t i o no fp r o t e i n s 2 i n c l u d i n ga d e n i n e g u a n i n e c y t o s i n ea n dt h y m i n e o n l yt h y m i n eo ff o u rd n a b a s e sc a n f o r mt r i p l eh b o n d sw i t hm e l a m i n e s i n g l e s t r a n d e d s s d n a c a na d s o r bo n t ot h es u r f a c e so f a u n p si no r d e rt om a k en a n o p a r t i c l e sw e l l d i s p e r s e d h o w e v e rw h e nt h ec r o s s l i n k i n gm o l e c u l e s e x i t t h e yc a nr e a c tw i t hd n a a n dl e a dt ot h ed i s t a n c eo fa u n p sd e c r e a s i n g o nt h eb a s i so ft h i s w e p r e s e n tan e wa n ds i m p l es e n s i t i v ep l a s m o nr e s o n a n c el i g h ts c a t t e r i n g p r l s m e t h o df o rm e l a m i n e i nm i l kp r o d u c t sw i t hp o l y t w s t a b i l i z e da u n p s m e l a m i n ei nt h er a n g eo f8 0n m 一1 0 0 0n mc o u l d b es e l e c t i v e l yd e t e c t e dw i t ht h el i n e a re q u a t i o no f4 机 一l1 2 1 4 1 0c m e l a m i n e r i m t h e c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t 厂 o f0 9 9 0 5a n dt h el i m i to fd e t e r m i n a t i o n l o d o f2 0n m i tc a na l s o a c h i e v ev i s u a ld e t e c t i o nw i t h o u ta n yi n s t r u m e n t a t i o no rc o m p l i c a t e dd e s i g n 3 t h ea m a l g a m a t i o np r o c e s so fc e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e c t a b c o a t e dg o l d n a n o p a r t i c e l s a u n p s f r o ms p h e r i cn p si n t oe r o s es t o n e l i k en p si nt h ep r e s e n c eo fh g i i w a s i n v e s t i g a t e db yp r i ss p e c t r a p l a s m o nr e s o n a n c ea b s o r p t i o n p r a s p e c t r aa n ds c a n n i n ge l e c t r o n 两南大学硕士学位论文 m i c r o s c o p e s e m w ea l s oc o n f t r r at h es u r f a c ec o v e r a g eo fm e r c u r yo c c u r si n d e e di nt h ea u n p s s o l u t i o nb yx r a yp h o t o e l e c t r o ns p e c t r o s c o p y x p s t h ec o l o rc h a n g e sf r o mr e dt oo r a n g et o y e l l o wg o i n gw i t ht h ef o r m a t i o no fa u h ga m a l g a ma n di tc a nd e v e l o pas i m p l e c o l o r m e t r i c d e t e r m i n a t i o no fh g 4 m u t i p l e w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s m w c n t s h a v et h ep r o p e r t yo fe f f e c t i v e l yq u e n c h i n g t h ef l u o r e s c e n c e s s d n ac a nw r a po n t ot h es u r f a c eo fm w c n t s w h i l ed s d n ac a l ln o t i nt h i s t h e o r yw ed e v e l o paf l u o r e s c e n c ed e t e r m i n a t i o no fh 9 2 o nt h eb a s i so ft h g t i nt h eo p t i m u m c o n d i t i o n h 9 2 i nt h er a n g eo f0 2g m 一0 9p mc o u l db es e l e c t i v e l yd e t e c t e dw i t h t h el i n e a r e q u a t i o no f f 一18 7 7 0 0 9at h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n t r o f0 9 8 6 0a n dt h e l i m i to f d e t e r m i n a t i o n l o d o fo 0 2b m k e y w o r d s c u 2 0n p s h 9 2 m e l a m i n e h y d r o g e nb o n d m u f i p l e w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s m w c n t s i v 缩写符弓对照表 缩写符号对照表 v 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果 论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果 文中已加了 特别标注 不存在抄袭 伪造等学术不良行为所获的相关内容 对本 研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师 朋友 同仁在文中作了明确 说明并表示衷心感谢 对本文所呈内容由本人负全部学术责任 学位论文作者 幕p 支穆 签字日期 劾一年6 月尹日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留 使用学位论文的规 定 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘 允 许论文被查阅和借阅 本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采用影印 缩印或扫 描等复制手段保存 汇编学位论文 保密的学位论文在解密后适用本授权书 本论文 孵保密 口保密期限至年月止 学位论文作者签名 瘌支移 签字日期 7 0 年孑月9 日 学位论文作者毕业后去向 工作单位 通讯地址 电话 邮编 第l 章绪论 第1 章绪论 1 1 纳米颗粒概述 纳米颗粒指几何尺寸处于1 1 0 0n m 之间各种颗粒的总称 1 1 近年来 纳米颗 粒由于在催化 滤光 光吸收 医药 磁介质及新材料等方面独特的性能引起了 人们研究的极大兴趣 同时表现出了广阔的应用前景 纳米颗粒具有以下四个基本性质 2 4 1 表面与界面效应 即纳米颗粒表面原子 数与总原子数之比随粒径变小而急剧增大后所引起的性质上的变化 小尺寸效应 即随着颗粒尺寸的量变 在一定条件下 即当纳米微粒尺寸与光波波长 传导电 子的德布罗意波长及超导态的相干长度 透射深度等物理特征尺寸相当或更小时 会引起颗粒的性质发生现象的质变 量子尺寸效应 即当颗粒尺寸下降到某一数 值时 金属费米能级附近的电子能级由准连续变为离散能级的现象和纳米半导体 微粒存在不连续的最高被占据分子轨道和最低未被占据的分子轨道能级 能隙变 宽韵现象 宏观量子隧道效应 即微观颗粒具有贯穿势垒的能力 1 2 常见纳米颗粒的种类 从纳米颗粒的形态角度来看 常见的有球形 棒状 三角形 片状 角状 管状 线状 海绵状等纳米颗粒 从纳米颗粒的物质组成角度来看 常见的有金 属纳米颗粒 例如 金纳米颗粒 银纳米颗粒 铂纳米颗粒 铜纳米颗粒等 氧 化物纳米颗粒 例如 氧化铜或氧化亚铜纳米颗粒 二氧化硅纳米颗粒 氧化铁 纳米颗粒等 非金属纳米颗粒 例如 碳纳米管 足球烯等 稀土纳米颗粒 例 如 氟化镧纳米颗粒等 此外还有很重要的一类半导体纳米颗粒 即 量子点 常见的有锑化镉 硫化锌等 1 3 纳米颗粒的应用 纳米颗粒的的诸多优异性已经使它们在环境分析 食品检测 生化分析 细 胞成像 催化分析等领域得到了广泛的应用 并表现出了无可估量的应用前景 1 3 1 在环境分析中韵应用 环境分析很重要的一个领域就是重金属离子的检测 自从震惊世界的日本汞 中毒事件一 水俣病一事件发生以后 人们均加大了对重金属离子如h g 瞰l p b 9 c u 1 1 2 1 a s 3 晌等的研究 尤以h 9 2 的研究最为突出 检测方法包 括色谱法 抗原抗体免疫检测法 荧光法n 4 1 5 1 电化学法 1 3 1 色度法 1 6 1 等离子 趟南大学硕士学位论文 体其振吸收和散射法胛肄 目前研究较热的是基于纳米颗粒实现对重金属离子实 现的灵敏 简单 快速 可视化的检测 例如 利用h 2 2 与富含t 碱基的d n a 序列可形成稳定的t h g t 复台物 图1 划以实现对h g n 的等离子体共振散 射法 荧光法 i 色度法 2 1 等的检测 此外还可以利用h 9 2 与巯基或含硫化合 物特殊的配位作用 2 实现对h 快速 灵敏的检测 w g c g t g t c c i g tt g g c t 5 l t t c j 矧黧篙 图l 基于t h g t 复合物拉测h 9 2 环境样品的分析检测中除了金属离子的检测外 还包括一些阴离子如c n 罔 2 利用c 对吸附着荧光染料罗丹明b 的a u n p s 的腐蚀作用实现对c i x r 快速灵 敏地捡测斟l r 1 u 里 呦旧 冬 a un p s r h o d a m l n eb 图2 纳米颗粒与荧光方法结合检测c n 3 2 在食品检测中的应用 目前随着社会的进步 人们对食品质量检测控制十分严格 食品的安全关系 着人们的生命安全 非法添加或者加入过量的有害物质后都会对人们的身体健康 造成危害 近来三聚氯胺成为了人们研究的热点 牛奶中加入三聚氰胺可提高蛋 白质的含氨量 但婴儿服用填加 聚氰胺的牛奶后会出现肾结石 甚至死亡 目 前三聚氰胺检测的方法主要是高效液相法 h p l c 高校液相法与质谱联用法 肿l c m s 口5 3 等 这些方法耗时长 有时还需要将二聚氰胺衍生 需要大型 第1 军绪论 仪器 操作不方便 最近k d o n ga i 课题组田 报道了基于a u n t s 的聚集建立了一 种检测牛奶中三聚氟胺的新方法 该方法简单 快速 可视化 开辟了纳米技术 检测牛奶中三聚氟胺的新领域 此外 染料添加剂如苏丹红也是对人体有害的 它是一类人工偶氯类染料 世界上部分地区的辣椒制品中已经被检验出含有苏丹 红染料 尤其是苏丹红i 它有致癌作用1 3 仉3 1 l 武丽萍 3 2 等人利用苏丹红中含有的 氨氮职键和酚羟基韵还原性 将其与硝酸银发生氧化还原反应 生成银纳米颗粒 a g n p s 溶液颜色由苏丹红的红色变为a g n p s 的棕色 并且导致体系的等离子 体共振光散射 a u c u a i 口日 在c u 0 形态占主要 成分的阶段 体系的散射相对较弱 随着反应的进行 c u z on p s 逐渐增多 体系 在5 2 0n m 处的散射强度逐渐增强 图2 右 我们同时还做了暗场光学散射成像 通过成像我们直观地观测到c 2 0n p s 呈现较强的纯净的蓝色散射光 测定单个纳 米颗粒的散射光谱发现 单个c 2 0n p s 在4 7 0n r n 处的散射最强 即对应蓝色光 的波段范围 图3 通过散射光学研究 我们发现c 2 0 n p s 溶液的散射相对较强 该纳米颗粒有望成为一种很好的光散射材料 誓 至箸 监誊 耋鎏翟望磬 鐾墨2 喾 2 錾 罟詈 2 t i m 3 5 0 4 0 04 5 0 期5 e v o6 7 7 r o o l 仰 图2 不同反应时阃后溶液的暇牧光谱 散射光谱围和量终溶液的照片图 实验蘩 曲线l 分别对应的是厦 l s m n2 k 9 k l l h 1 2 k 1 6h 岳的嚷收光谫 c r a b 与n a b 凡m 座 比值是 7 图3c u 2 0 的暗场成慷围和单个颗粒的做射光谱围 c r a b 与n a i l i 度 值是o5 7 3 3c u 2 0n p s 的细胞成像分析 近年来金属纳米颗粒的共振散射特性研究越来越热 人们已经成功地将这种 散射特性应用在纳米颗粒本身所处的环境及其周围微环境的研究及定位等方面 蚓 鉴于此 我们开展了c 2 0 n p s 在细胞暗场光学散射成像上的应用 通过图4 两市大学硕士学位论文 ii 我们可以观察到 转铁蛋白介导的c u 2 0n p s 可以进入到人神经瘤母细胞巾 同时 其独特的蓝色散射光在细胞质中仍然可以实现发光 通过这种散射发光可以观测 到c u 2 0n p s 在细胞小同部位的富集 可见 c u 2 0n p s 小仪散射光相对较强 并 月散射光颜色单一 这是c u 2 0 n p s 与金银纳米颗粒相比最大的优势所存 圈4 转铁蛋白介寻的c l l 2 0n p s 在人神经囊母细胞中的暗场成像图 宴验豢 翻a 为空自 m 借b 为 自修饰e c u 2 0 n p s 与目 育3h 岳的 忙幽 箭头指m 的芷 c u 如n i s 进八t 细胞质 3 4 c u 2 0 n p s 与蛋白作用的掏象分析 我们将c u 2 0n p s 与p r b s a l y s o z y m e t r y p s i n 四种蛋白相互作用 通 过c d 表征蛋白构象的变化发现了有趣的现象 c u 2 0n p s 与r r p c b s a 作用后 能够使这两种蛋白的c d 信号的强度发生明显的变化 而c 2 0 n p s 与l y s o z y m e t r y p s i n 两种蛋白作片j 后则币会类似的现象 通过对照宴验 c u 2 和c t a b 对蛋白 第2 章新型c u 2 0 n p s 撵针在活细胞散射成像和蛋白构象分析中应用 的c d 信号影响很小 投有上述类似现象 图5 据文献报道 c d 信号的变化可 以反映蛋白本身的构象的微小变化 上述蛋白的c d 光谱峰形没有很大变化 推测 蛋白三级结构没有发生明显变化 可能是由于蛋白周围微环境 例如蛋白的疏水 结构等发生较小变化后使得c d 光谱中强度发生了变化 l 硎 具体原因有待进一 步研究 0 莒 1 0 善渤 u 2 1 0 2 2 02 3 02 4 0 瑚2 s o2 7 0 w a v e i 倒 2 1 02 2 0z 3 02 4 02 5 02 6 02 7 0 w 目 i 酣h 田5 c u 舢n p s 与p r p c 左围 b s a 右围 两种蛋白作用后的c d 光谱田 实验条件 m 圈十曲垃i j 丹剐对戍时足单独的蛋白 单植的c u 扣n p s 蛋白与o o n 作用后 虽自与c u 作用后 蛋臼与c r a b n p s 作用后的c d 光谱 p r 旷和b s a 的浓度是0 0 7 m 咖la n d0 6 5 m b m l 缓冲溶液为 i e p e s 缓冲 州为7 4 第4 节本章小结 我们通过一种间接的液相还原法 首先还原得到纳米铜 再在2 7 暴露在空 气中的条件下将之氧化得到了一种形态均一的c u 2 0n p s 该方法成本低 操作简 单 据我们所知 这是第一篇非常详尽地对c u 2 0 n p s 暗场光学散射成像以及单个 颗粒散射光谱性质进行的研究 实验结果表明 经过氧化过程之后得到的c u 2 0 n p s 具有较强的纯净的蓝色散射光 该纳米颗粒不仅可用来研究蛋白构象同时还可作 为一种很有前景的光散射探针应用在细胞或者生物分子散射成像方面 o o 4 m舶锄埘 sgu 第3 章基于a u n p s 和氢键原理可视化检测三聚氰嚷 第3 章基于a u n p s 和氢键原理可视化检测三聚氰胺 第l 节引言 三聚氰胺 由于其本身含氮量高达6 6 经常被非法商利用掺杂在牛奶或动 物饲料中以达到提高蛋白含量的目的 这种在牛奶或动物饲料中非法添加的三聚 氰胺已经导致了婴儿的肾结石甚至是死亡事件 因而最近人们很关注三聚氰胺的 检测 目前检测三聚氰胺的方法主要有高效液相法 珈p l c 高效液相与质谱联 用 h p l c m s 盼2 6 船 等方法 然而这些方法涉及到大型仪器 不利于快速的实 时分析检测 从另一方面来讲 三聚氰胺特殊的分子对称结构也使得它在通过氢 键实现多分子三维组装 或者超分子构建方面备受关注 因此 针对目前现有的 检测方法的现状发展一种新的操作简单 灵敏 快速检测三聚氰胺的方法是很有 意义的 为此我们开展了三聚氰胺的研究 我们从三聚氰胺分子本身的对称结构着眼 注意到m a 的课题组报道了 硎 在水相缓冲溶液中 通过三聚氰酸和三聚氰胺分子中形成的三个氢键将其磷脂衍 生物进行分子组装 这篇报道是个突破 充分证明了在水相中形成类似的三个氢 键的结构是很可能的 通常这种三个氢键结构是在a g 1 1 1 i 删和定向裂解石墨 h o p g 等固相表面f 9 1 1 气 液相界面 9 2 1 有机相中睇1 例如 氮 氮二甲基甲酰胺 d m f 9 4 1 氯仿嗍 4 一氯代苯 t c b 或者超真空条件惭 9 7 1 才能形成 之后 o n g 等人阴j 也报道了利用胸腺嘧啶 t 碱基 和自己实验室设计合成的小分子分 子7 d c a z a g u a n i n e 7 a e o 实现三个氢键的形成 上述理论进一步证明了我们的设 想 在水溶液条件下 基于三聚氰胺和胸腺嘧啶 t 碱基 分子间三个氢键的原理 建立一种操作简单的检测三聚氰胺的方法是可行的 并且是很有意义的 据我们所知 将这种三个氢键的结构应用在水相中的分析检测体系里的报道 很少 我们还意外地发现 四种d n a 的碱基里 只有t 碱基可以与三聚氰胺形成 这种类似的三个氢键的结构 基于此可以建立一种具有很高特异性的检测三聚氰 胺的方法 另外 单链d n a 可以缠绕在金纳米颗粒 a u n p s 表面 使a u n p s 不聚集 而加入交联剂后 交联剂与d n a 分子结合 从而将缠绕着d n a 分子的 a u n p s 拉近使之发生不同程度的聚集 a u n p s 聚集与分散不仅颜色有明显的变化 等离子体共振吸收 p l a s m o nl e s o n a l i e a b s o r p t i o n p r a 和等离子体共振光散射 p l a s m o nr c s o l l a l l c el i g h t s c a t t e r i n g p r l s 光谱也会发生明显的变化f 9 1 氐3 1 9 9 1 0 b j 为此 我们以a u n p s 为实验材料 基于三聚氰胺和p o l y t nd n a 分子中t 碱基的的三个氢键原理 发展了一种具有很高的特异性 可视化 灵敏地检测奶 制品中三聚氰胺的方法 图1 p o l y t a h n p s t 厂 i m c l a m 1 c 田1 基于t 碱基和三鞭氰胺分子间三个氢键原理可视化植谢三聚氰胜的示意图 刚个样品照h o 别对 的是在p o j y a p o h c p a l y g o o t y x 存在下加入 聚氰胺后金敉的颤也变 化结构式中h b 和m 别对应的是t 碱甚中和 聚氰胺分f 中参 形 氧键的十i d 的h 娘于 第2 节实验部分 2 l 仪器 f 4 5 0 0 型荧光分光光度计 r 立 日本 和u v 3 6 0 9 近红外一紫外一可见分 光光度计 岛津 日本 分别用于测定共振光散射谱和吸收光谱 日立s 4 8 0 0 扫 描电子显微镜 s e m 东京 日本 和贝克曼n 5 p c s 粒度仪 迈阿密 美国 基 于动志光散射原理 d l s 分别用来表征a u n p s 及其聚集体的形态和粒径大小 a v a n c ea v 3 0 0 用于核磁共振1 hn m r 表征 高效液相色谱的表征是在 l c 2 叭0 们仪器上实现的 岛津 日本 其中 色谱柱型号为v p o d s1 5 0x4 6 c o l u m n 控制系统为c b m 2 0 a l i t e 泵为l c 一2 0 a t 柱温箱为c t o 1 0 a s v p 检测 器为s p d 2 0 a v 所有溶液均用m v s 一1 漩涡混合器 北京科技仪器有限公司 混 合均匀的 2 2 材料 三聚氰胺 m e l a m i n e 和脾腺嘧啶 t h y m i n e 均购买于北京百灵威化学技术 有限公司 将固体粉末用少量甲醇溶解后 二次水稀释后配成溶液待用 1 3n m a t t n p s 通过柠檬酸三钠还原氯金酸制得 1 通过吸收测定其初始浓度为 0 n m d n a p o l y a 9 o o l y c 9 p o l y g 6 tp o l y t 9 p o l y l1 2 p o l y t 2 3 p o l y t s 3a n dp o l y t o 趣 第3 章基于a u n p s 和氧键原理可视化柃测三聚氰胺 购买于上海生工生物工程技术服务有限公司 d n a 粉末先用6 0 0 0r p m 离心5m i n 后再用二次水溶解配成溶液待用 在1 hn m r 表征时 三聚氰胺和胸腺嘧啶均用 氘代试剂溶解 先用二甲亚砜 d m s o 将其溶解后 再加入一定的氘代水用来表 征氢键的形成 2 3 实验方法 2 3 1 实验步骤 在1 5m l 的离心管中加入1 0 0 皿a u n p s 1 0n m 和一定量的d n a p o l y t s s 等 涡混合均匀 室温反应5r a i n 然后再依次加入三聚氰胺 5 0 此p h7 6 n a h 2 p 0 4 q a 2 h p 0 4 缓冲 0 2 州 用二次水补充总体积为5 0 0 皿 旋涡混合均 匀后5m i n 后测定p r l s p r a s e m 和d l s 表征 荧光分光光度计的激发和发射 波长相等 在2 2 0 8 0 0n m 范围内扫描获得p r l s 光谱 2 3 2 牛奶样品的处理 2n a g 奶粉或者2m l 液态奶先用二次水溶解至总体为5 0m l 之后再稀释1 0 倍后用1 0k d 的超滤膜超滤 2 0 0 0 0r p m 离心3 0r a i n 后 取上层清夜稀释1 0 0 0 0 倍 然后 取3 0 此1 0 1 0 5m 三聚氰胺溶液 3 7 8r i g 加入到1 0m l 上述超滤 稀释后的牛奶样品中用于p r l s 和h p l c 表征 2 3 3h p l c 检测方法 为了验证本文建立的p r l s 法检测牛奶中三聚氰胺实验结果的可靠性 我们 用h p l c 的检测结果作为对照 参照国标法检测三聚氰胺的实验条件 1 0 6 1 采用双 波长检测法 记录波长2 3 5n i l l 和2 4 0 衄的吸收值测得色谱图 使用p h 为3 的 离子对试剂缓冲液 2 1 0g l 柠檬酸和2 1 6g l 辛烷磺酸钠 来控制体系的酸碱度 柱温为4 0o c 流动相缓冲液和甲醇的比例为8 8 1 2 流速为1 0m l m i n 第3 节结果与讨论 3 1 光谱特征 如示意图l 所示 三聚氰胺能与p o l y t nd n a 分子中的t 碱基特异性地形成 三个氢键的结构 导致a u n p s 发生聚集 伴随着a u n p s 的颜色 光谱特征和形态 会发生明显的变化 首先 p o l y t 5 5 缠绕在a u n p s 表面 使其处于分散状态 溶液 颜色呈红色 在5 2 0n n l 处有其特征的等离子体共振吸收峰 忉 如图l 所示 当 不同浓度的三聚氰胺加入该体系后 a u n p s 溶液从红色过渡到紫色最后变为了蓝 1 9 朋南人学硕士学位论文 色 在6 2 0 r i m 处的吸收也呈现线性增强的趋势 图2 这是余胶聚集后典型的吸 收光谱的变化 可推知 三聚氰胺使a u n p s 互相靠近 在形成的聚集体中邻近纳 米颗粒间发生了偶极一偶极相互作用和表面等离子体体偶合 从而导致了吸收光谱 的特征变化 a u n p s 的散射光谱信号与颗粒大小和聚集形态也有很大的变化眦 倒 从图3 我们也可以看出 a u n p s 在5 5 0n m 处的散射强度逐渐增强 增强值也 与加入的三聚氰胺的量呈现一定的线性关系 围2 三聚氰胺检测的等离子体共振吸收光谱田和样品照片围 实验条件 a u n p s2 0n m 呻m j 5 0 0 4 6 i m p h 7 t m c l 蛐i n c 曲线i 5 m 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 i n 0 0 实 物照h 瓶对应曲线i 5 中的样品 笫3 章基ta u n p s 和氧键原理可视化拎洲 聚氰眩 皇皇量鼍 i i 一一 一 一 一 皇曼鼍曼量曼曼曼蔓皇曼曼 图3 三聚氰胺检测的等离子体共振散射光谱图和样品照片图 实验条件 a u n p s 2 0n m p o l y t s 5 0 0 4 6i l m p h7 6 m e l a m i n e 从下到上 n m o 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 3 2s e m 和d l s 特征 三聚氰胺的加入使a u n p s 发生了聚集 因而我们详细研究了其聚集特征 首 先用d l s 研究了其粒径的变化 实验数据随着三聚氰胺量的增加 金胶粒径逐渐 增大 说明金胶的聚集程度逐渐增大 进一步分析d l s 数据发现 图4 在2 0 0 n m 一1 0 0 0n m 范围内 聚集体的水合直径d l l 与三聚氰胺的浓度c 有以下关系 慨 6 一3 7 1 0 1 0 4 6 1 0 8c 相关系数r 为0 9 5 9 2 这一公式与简化后的瑞利散 射公式 1 0 8 1 相一致 m 嚆叫募卜k 其中 k 是相关系数 表示散射体与颗粒的水合直径d l l 的关系 k 也是相关系 数 表示k 与实验条件的关系 因此 增强的散射信号可很好地说明a u n p s 发生 了聚集 从扫描电镜上我们也可以直观地观察到 空白样品中a u n p s 颗粒比较分 散 加入三聚氰胺后 a u n p s 发生团聚 出现了粒径较大的聚集体 并且加入的 三聚氰胺越多 聚集体粒径越大 总之 两种实验数据都进一步证实了a u n p s 发 生了不同程度的聚集 图4 三聚氟胺检测的动态光散射数据柱状圉和s e m 固 实验条件 动态光散射检测的角度是9 0o 检w a 度是2 8 s e m 斟中m e l a m i n e a c r i m 0 4 0 0 1 0 0 0 3 3 不同d n a 序列的响应 为了论证三聚氰胺诱导a u n p s 聚集的机理 如示意图所示 我们考察了不同 碱基条件下 即p o l y a p o l y c p l o y g n 和p o l y t 圈5 四种d n a 序列对该 体系的相应 实验发现 只有在富含t 碱基的p o l y 条件下 5 6 00n m 处p r l s 信号出现了明显的增强 a u n p s 发生了聚集 这个结论与设想的三聚氰胺一胸腺 嘧啶的三个氢键原理相吻合 此外 我们叉进一步考察了不同长度的p o l y t 对 a u n p s 的影响 参照文献u j 保持t 碱基总浓度一定 其他条件下不变 取0 2 8 i mp o l y t 9 02 1 m p o l y t i 2 0 1 1 州p o l y t 2 o0 7 6 l m p o l y t 3 3 0 0 4 6 州p o l y t 5 5 分别做上述实验 发现随着d n a 长度的增加 5 6 0 0n m 处p r l s 信号出现了明 显的增强 增加的幅度逐渐变小 g z 第3 辛荩丁a u n p s 和氧键原理可视化拎洲王聚氰胺 iii i imm emi i i 1 0 0 8 0 6 0 j 配 j 4 0 2 0 0 i q 嘴n 璐o fp o l y o l i g o m e r s 图5 不同d n a 序列条件下检测三聚氰胺的等离子体共振散射数据柱状图 实验条件 a u n p s 2 0n m m e l a m i n e 8 0 0n m p h7 6 c o l u m n s f r o mt h el e f tt or i g h t 州 p o l y g 6 3 8 p o l y a 1 6 p o l y c g 3 6 p o l y t g 0 2 8 p o l y t i 2 0 21 p o l y t 2 3 0 1l p o l y t 3 3 0 0 7 6 p o l y t s s 0 0 4 6 3 41 hn m r 表征 众所周知 核磁共振可以很好的表征氢键的形成 氢键形成后能够使得h 原来的化学位移朝低场移动 考虑到溶解性 我们考察了胸腺嘧啶和三聚氰胺这 两个小分子在d m s o 和d m s o h 2o9 1 的混合溶剂条件下氢键的形成 分析1 h n m r 数据得出 图6 在这两种溶剂条件下 胸腺嘧啶分子中n h a 和三聚 氰胺分子中n h b 两种基团上h 的化学位移朝低场发生了不同程度的移动 在 d m s o 溶剂中 胸腺嘧啶分子中n h a 化学位移从1 1 0 2 0p p m 最大位移到了 1 1 9 2 9p p m 三聚氰胺分子中n h b 从6 0 9 0p p m 最大位移到了6 2 8 0p p m 在 d m s o h 2 09 1 的混合溶剂条件下 胸腺嘧啶分子中n h a 化学位移从1 1 0 1 8 p p m 最大位移到了l1 7 1 6p p m 三聚氰胺分子中n h b 从6 0 9 2p p m 最大位移 到了6 1 6 7p p m 这种化学位移的低场移动是三聚氰胺分子和胸腺嘧啶分子中形 成的一个 n 氢键和两个o 一州氢键导致的 符合文献报道 9 3 9 8 1 0 9 川2 1 这是t 碱基与三聚氰胺形成氢键的最有力的证据 两南大学硕十学仿沦文 g a e 吣 m o l a rf r a c t i o no fm e l a m i n e 图6 不同溶剂条件和不同的三聚氰胺和t 碱基的比例条件下1 hn m r 数据图 实验条件 实心曲线 和 均表示t 碱基中 n h a 中h 的化学位移 空心曲线口和o 均表示三聚氰胺中 n h b 中h 的化学位移 黑色的曲线n 和口溶剂为d m s o 红色的曲线o 和o 溶剂为9 1d m s o 3 5 干扰物实验 为评估该方法用于实际测定的选择性 针对牛奶中中常见的无机离子及一些 共存物的干扰进行了考察 表1 可以看出 当三聚氰胺浓度为8 0 0n m 时 1 0 0 倍 的n a c i k c i m g c l 2 c u c l 2 n a a p 0 4 5 0 倍的a 1 2 s 0 4 3 c a c l 2 z n s 0 4 f e c l 3 1 2 5 倍抗坏血酸v c v b l 2 浓度为l m g l 时 蔗糖 乳糖 麦芽糖和葡萄糖浓度 为0 1 9 l 时对检测体系无干扰 蛋白对该检测体系有一定的影响 是由于蛋白会 吸附在a u n p s 表面起保护作用使得a u n p s 聚集程度变弱 因而我们在牛奶样品检 测时 先用超滤的方式出去分子量较大的蛋白防止其对a u n p s 的聚集产生影响 第3 幸基于a u n p s 和氧键原理可视化检测三聚氰胺 表l 干扰物测定结果 c o h e n c o h e n c h a n g eo f p r l s s u b s t 瞅雠妇 c h 觚a n g e 时o f p r l ss 眦撇雠 概时 1 旷 1 0 加 呦 iiiiii ii k d c l m g 1 1 c l c u o o c f n a m 的 8 6 2 v b 2 v b l 2 b s a h s a g l u c o s e l a c t o s e m a i t 0 鹇舡i l 实验条件 a i 悄p 摹 2 眦 舯b k 0 0 4 6p m m 豳m h 畸8 0 0n m p h7 6 3 6 线性关系 在最佳实验条件下 按照实验方法测量体系在不同三聚氰胺浓度下的p r l s 强度 并以5 6 0 0 衄处的 对三聚氰胺浓度作图 线性回归方程为 a p r l s 一 1 1 2 1 4 1 0c m e l a m i n e r i m 相关系数为0 9 9 0 5 线性范围为8 0n m 一1 0 0 0n m 该方法的检测限为2 0n m 同样条件下 根据6 2 0n m 处和5 2 0n m 处吸收的比值 和三聚氰胺浓度也能得出一定的线性关系 线性方程为么6 2 嘶出5 2 咖 o 1 7 8 4 1 0 4c m e l a m i n e n m 相关系数为0 9 8 4 8 但是此时检测的线性范围为1 5 0n m 一 8 0 0n m 可见在该实验条件下 p r l s 信号的灵敏度比p r a 信号的灵敏度高 3 7 样品分析 为了证明该方法的实际可行性 我们在已经预处理好的三种牛奶样品 牛奶i 2 石 石 d 5 2 2 3 z 毛 曩 z z 瘦 m 一 r 一 i l l l 2 6 3 j 7