（环境工程专业论文）富勒烯的DNA损伤机制及毒性效应研究.pdf

华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 摘要 纳米材料的生物毒性效应日益受到广泛的关注 通过研究c 6 0 的d n a 损伤机理 及相关生物效应 探讨c 6 0 与生物体的相互作用方式及潜在致毒机制 以期建立评 估纳米材料生物安全性的研究方法和体系 实验结果表明 c 6 0 可在常温避光条件下降解质粒p b r 3 2 2 d n a 降解效应与反 应温度 反应时间和c 6 0 浓度相关 化学发光法检测反应体系产生中的超氧阴离子 同样与反应温度 反应时间和c 6 0 浓度相关 s o d 酶作为氧自由基淬灭剂可以抑制 c 6 0 诱导的d n a 剪切效应并且淬灭c 6 0 产生的超氧阴离子 上述结果表明 c 6 0 在常 温非光照条件下产生超氧阴离子是导致d n a 剪切效应的主要原因 当甲酰胺或其 它含有酰胺基团的有机物与c 6 0 共同反应时或增加反应体系中离子强度 c 6 0 的d n a 降解效应被显著的抑制 由此推测d n a 构象的稳定性以及c 6 0 的表面性质是d n a 降解效应的另一重要因素 s y b rg r e e ni 染料竞争结合实验表明c 6 0 可结合到 d n a 上 并影响d n a 的构象 综上所述 c 6 0 可通过结合到d n a 上 降低d n a 构象稳定性 诱导活性氧的产生 造成d n a 损伤 以p c r 反应作为体外研究模型 模拟d n a 复制过程 合成单链d n a 模板 研究c 6 0 对p c r 的影响 探讨c 6 0 潜在的基因毒性 实验结果表明 随着c 6 0 浓度的 增加 p c r 反应被显著抑制 将t a qd n a 聚合酶 单链d n a 模板与c 6 0 孵育后 其p c r 扩增产物均显著减少 增加p c r 反应体系中的t a qd n a 聚合酶量 可消除 c 6 0 的抑制作用 但增加起始模板单链d n a 的量 p c r 产物的量变化不明显 上述 研究结果说明c 6 0 不仅可抑制t a qd n a 聚合酶活性 同时对单链d n a 模板也具有 一定的损伤作用 细胞毒性实验结果表明 c 6 0 对人胃癌细胞s g c 7 9 0 1 和人胚肾细胞h e k 2 9 3 的细胞活力无明显影响 对c y p l a l 基因的表达亦无明显效应 c 6 0 的抑菌实验结果表明 c 6 0 可显著抑制大肠杆菌 枯草芽孢杆菌和根癌农杆 菌的生长 具有明显的时间 剂量 效应关系 但相对根癌农杆菌 大肠杆菌和枯草 芽孢杆菌可从c 6 0 所造成的抑制状态恢复到正常状态 这可能与c 6 0 的抑菌机制以及 菌株耐受能力相关 关键词 c 6 0 d n a 构象 d n a 剪切 质粒p b r 3 2 2 细胞毒性 抑菌 害劫烯的d n a 援揍机制及毒性效应磷究 a bs t r a c t n e t o x i c i t yo fn a n o p a r t i c l eh a sb e e nc o n c e r n e dw i d e l ya n di n e r e a s e l y i nt h i sw o r k 翻始d n ad a m a g ea n dt h ei nv i t r ot o x i ce f f e c t sc a u s e db yc 6 0w z k qs t u d i e d w ed i s c l l s st h e i n t e r a c t i o nb e t w e e nc 6 0a n do r g a n i s m f t t r t h e rt h em e t h o do nr e s e a r c h i n gn a u o p a r t i c l e t o x i c i t ya n dt h et o x i c i t yo fs o m en a n o p a r t i c l ew e r es t u d i e d i nt h i ss t u d y w ef o u n dt h a tc 6 0c a l ld e g r a d ep b r 3 2 2p l a s m i dd n au n d e rn o r m a l t e m p e r a t u r ew i t h o mp h o t oa c t i v a t i o n w h i c hw a s c o r r e l a t e dt ot h ei n c u b a t i o nt e m p e r a t u r e r e a c t i o nt i m ea n dc o n c e n t r a t i o no fc 6 0 t h eg e n e r a t i o no fs u p e r o x i d er a d i c a la n i o ni nt h e s o l u t i o nd e t e c t e db yc h e m i c a lm e t l l o dw a sa l s or e l a t e dt ot h ei n c u b a t i o nt e m p e r a t u r e r e a c t i o nt i m ea n d 也ec o n c e n t r a t i o no fc 6 0 s u p e r o x i d ed i s m u t a s ea c t sa sak i n do fr o s s c a v e n g e ra n di n h i b i t e dd n ac l e a v a g ea n d0 2 g e n e r a t i o ni n d u c e db yc 6 0 t h e s er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h er o si n d u c e db yn o n p h o t ot r e a t e dc 6 0u n d e rn o r m a lt e m p e r a t u r e s s h o u l db et h em a j o rc a b s eo fd n ac l e a v a g e a l s o w h e nf o r m a m i d eo ro t h e r a c y l a m i d o c y a n o g e ng r o u p c o n t a i n i n go r g a n i cc o m p o u n dw a sc o i n c u b a t e d 谢t l lc 6 0 t h e d n a d e g r a d a t i o ni n d u c e db yc 6 0w a ss i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e d m o r e o v e r w h i l ei n c r e a s i n g t h ei o n i cs t r e n g t ho ft h er e a c t i o ns o l u t i o n t h ed e g r a d a t i o nw a se l i m i n a t e da sw e l l s u g g e s t i n gt h a td n ac o n f o r m a t i o ns t a b i l i t ya n dc 6 0s u r f a c ec h a r a c t e r s a r et h eo t h e r s i m p o r t a n t f a c t o f si nd n ad e g r a d a t i o n s y b rg r e e nic o m b i n a t i o na s s a y d e m o n s t r a t e dt h a tc 6 0m l g h tb i n dt od n aa n da f f e c ti t sc o n f o r m a t i o n b a s e do nt h ea b o v e r e s u l t s w ec o n c l u d et h a tc 6 0m a yb i n dt od n a d e c r e a s ed n a c o n f o r m a t i o ns t a b i l i t y i n d u c er o s g e n e r a t i o na n dd e g r a d ed n a s t r a n da tn o r m a lt e m p e r a t u r e s i no r d e rt os i m u l a t et h ec o u r s eo fd n a r e p l i c a t i o n p c rr e a c t i o na st h er e s e a r c h m o d e lw h i c hw a sb a s e do nad e s i g n e ds i n g l es t r a n dd n a t e m p l a t e j l 阻se s t a b l i s h e dt o e v a l u a t et h ee f f e c to fc 6 0o r ld n a nv i t r or e p l i c a t i o na n dt h ep o t e n t i a lg e n o t o x i c i t y 弛e a g a r o s eg e ls t a i n i n gr e s u l t ss h o w e dt h a tc 6 0c o u l dd o s e d e p e n d e n t l yi n h i b i tt h eg e n e r a t i o n o fp c r p r o d u c t s a f t e rc o i n c u b a t e dw i t hc 6 0 t h ea c t i v i t yo ft a qd n ap o l y m e r a s ew a s s i g n i f i c a n t l yi n h i b i t e d t h ea m p l i f i c a t i o np r o d u c to ft r e a t e dd n at e m p l a t ew a sd e c r e a s e d a l s o t h ei n h i b i t i o ne f f e c ti n d u c e db yc 6 0c o u l db ee l i m i n a t e db yi n c r e a s i n gt h ea m o u n to f t a qd n ap o l y m e r a s ei nt h ep c rr e a c t i o ns o l u t i o n b u tc o u l dn o tb ee l i m i n a t e db y i n c r e a s i n gt h eq u a n t i t yo fd n at e m p l a t e 翻拍r e s u l t sr e v e a l e dt h a tc 6 0c o u l di n h i b i tt h e a c t i v i t yo ft a qd n ap o l y m e r a s e a n ds h o u l dh a v ep o t e n t i a la d v e r s ee f f e c to nd n a t e m p l a t e t h ec y t o t o x i c i t yr e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ew a t e r s o l u b l ec 6 0h a dn oo b v i o u se f f e c t s o nt h ev i a b i l i t yo fh u m a ng a s t r i cc a n c e rc e l ll i n es g c 一7 9 0 1a n dh u m a ne m b 翠o n i ck i d n e y 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学饿论文 c e l ll i n eh e k 2 9 3 a sw e l l 熊t h ee x p r e s s i o no f t h ec 垤l a 量 e s c h e r i c h i ac o i l b a c i l l u ss u b t i l i sa n dp s e u d o m o n a sa e r u g i n o s aw e r ee x p o s e dt oc 6 0 r e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h eg r o w t ho ft h e s et h r e eb a c t e r i aw e r ei n h i b i t e db yc 6 0w i t h o b v i o u st i m ea n dd o s e r e s p o n s ee f f e c t d i f f c r e n t f r o mp s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a e s c h e r i c h i ac o l ia n db a c i l l u ss u b t i l ic o u l dr e c o v e ri n t on o r m a ls t a t ea f t e re x p o s i n gt oc 鳓 t h a tw a sq u i t er e l a t e dt ot h ee n d u r a n c ea b i l i t ya n dt h em e c h a n i s mo fa n t i b a c t e r i a k e y w o r d s c 6 0 d n ac o n f o r m a t i o n d n ac l e a v a g e p l a s m i dp b r 3 2 2 c y t o m x i c i r y a n t i b a c t e r i a i i i 富勒烯的d n a 损伤机制及毒 生效应研究 英文缩略词表 i v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是否保密 弱 如需保密 解密时间年 月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果 也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料 指导教师对此进行了审定 与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明 并表示了谢意 研究生签名 多乏 时间 夕吕年歹月 0p 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存 使用学位论文的规定 即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本 学校有权保存提交论文的印刷版和电子版 并提供目录检索和阅览服务 可以采用影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位 论文 本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表 传播学位论文的全 部或部分内容 并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数据股份有限公司将本人 学位论文收录到 中国学位论文全文数据库 并进行信息服务 包括但不限于汇编 复制 发行 信息网络传播等 同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注 保密学位论文 即涉及技术秘密 商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文 在解密后适用于本授权书 学位论文作者娩 己 掺导师鲐球拉 签名日期 巧年 月 夕日 签名日期 9 5 年 月p 日 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 1 前言 1 1 课题研究的背景和意义 纳米材料因其尺寸效应 量子效应及表面和界面效应等具有特殊的物理化学性 质 近年来 随着纳米技术的不断产业化 各种人工纳米材料在半导体 催化剂 织物 抗菌材料 表面涂料 化妆品乃至药物载体等得到广泛应用 并不断融入人 类生活的各个方面 d r e h e re ta 1 2 0 0 4 o b e r d o r s t e re ta 1 2 0 0 5 g u z m a ne ta 1 2 0 0 6 富勒烯是目前应用非常广泛的一种人工碳纳米材料 由于其具有较好的生物相容性 在基因转染 药物载体 抗病毒 抗氧化等方面开展了深入研究 j e n s e ne ta 1 1 9 9 6 n a k a m u r ae ta 1 2 0 0 3 k o y a m ae ta 1 2 0 0 6 但伴随着人工纳米材料的普遍使用 这些人工纳米材料因其特殊的结构和特性 可通过各种途径进入环境或人体 2 0 0 3 年 s c i e n c e 和 n a t u r eb i o t e c h n 0 1 杂志 相继发表评论和文章 阐述了纳米材料对环境和人类健康的潜在危害性 c o l v i n 2 0 0 3 s e r v i c e 2 0 0 3 2 0 0 4 年o b e r d o r s t e r 率先发表文章 表明c 6 0 可造成大口鲈鱼脑部的 脂质过氧化 具有一定的毒性 引起各国政府和科学界对c 6 0 以及其它纳米材料的 生物效应与环境健康效应的高度重视 o b e r d o r s t e r 2 0 0 4 2 0 0 6 年的 s c i e n c e 和 n a t u r e 杂志先后发表文章 明确表示迫切需要建立合适的方法和手段来保障纳 米材料得以安全的生产和使用 m a y n a r de ta 1 2 0 0 6 n e le ta 1 2 0 0 6 研究结果表明 c 6 0 可造成细胞膜的脂质过氧化 具有一定的细胞毒性和基因毒 性 并对多种水生无脊椎动物 脊椎动物具有不可逆的毒性效应 s a y e se ta 1 2 0 0 4 o b e r d o r s t e re ta 1 2 0 0 6 m a g r e ze ta 1 2 0 0 7 s a y e se ta 1 2 0 0 7 目前认为c 6 0 所造成的 脂质过氧化 d n a 损伤等多种生物学效应 均与c 6 0 催化产生的活性氧和自由基相关 y a m a k o s h ie ta 1 2 0 0 3 s a y e se ta 1 2 0 0 4 l y o ne ta 1 2 0 0 6 通过直接或间接干扰蛋 白质 酶 d n a 等生物大分子构象的稳定 产生不同的毒性效应 z h a o 等通过计算机模拟 证明c 6 0 可以与d n a 双链或单链非选择性结合 干 扰d n a 构象的稳定 推测其可能造成d n a 损伤 z h a oe ta 1 2 0 0 5 d h a w a n 等利用 单细胞凝胶电泳实验 进一步证实c 6 0 可造成人淋巴细胞d n a 的断裂 具有明显的 基因毒性 d h a w a ne ta 1 2 0 0 6 基于上述研究结果 我们推测 c 6 0 可与d n a 发生 相互作用 改变d n a 的特定构象 并可造成碱基错误配对 生成d n a 加合物 嵌 入d n a 螺旋结构 改变d n a 局部构象 干扰d n a 复制与修复相关的酶系统 最 终影响生物体内d n a 的复制效率和复制精度 产生基因突变 染色体畸变等多种 严重的遗传毒性 并可能通过世代传递 对后代造成危害 d n a 结构稳定的主要作 用因素是氢键 碱基堆积力等非共价作用力 c 6 0 与d n a 之间的相互作用也主要通 富勒烯的d n a 损伤机制及毒性效应研究 过菲共价作用力实现 c 6 0 及其衍生物在光催化下 可通过能量传递 电子传递等途 径生成多种活性氧或自由基 造成d n a 的裂解 而这与c 6 0 的表面性质有着紧密的 联系 y a m a k o s h ie ta 1 2 0 0 3 本研究选择c 6 0 作为人工纳米的模式化合物 比较研究c 6 0 不同光照 温度 离 子强度等条件下诱导活性氧或自由基的生成 对d n a 的裂解 对d n a 构象以及 d n a 体外复制效率和精度的影响 并研究它们对具有超螺旋结构的质粒d n a 构象 的影响 结合常规p c r 方法 借以探讨碳纳米材料对d n a 复制过程中d n a 模板 或d n a 聚合酶的相互作用 并综合细胞毒性检测方法和抑菌实验 院较分誊厅上述 体内 体外实验结果的异同 研究c 6 0 与d n a 之间的相互作用模式 损伤机制 借 以探讨纳米材料的结构 尺寸 形态 表面电荷 剂量等与生物效应之间的相关性 评估c 6 0 在基因治疗 药物载体乃至药物合成中的应用 以尽量减少或控制其可能 造成的负效应 l 2 纳米材料的性质和毒性效应 2 1 世纪科学技术的象征是纳米技术 由于纳米材料具有独特物理化学性质 如 尺寸效应 量子效应及表面和界面效应等物理化学性质 已经广泛应用予工业 医 药诊断 环境部门等传统产业中 g u z m a ne ta 1 2 0 0 6 纳米技术与传统学科相结合 形成了各种新型交叉性学科 备学科的迅速发展 表明纳米材料几乎在各个领域都 具有广阔的应用前景 随着纳米技术的产业化 各种纳米材料已通过各种途径进入环境和人体 正因 如此 2 0 0 3 年4 月s c i e n c e 杂志 2 0 0 3 年7 月n a t u r e 杂志 相继发表文章 开始探 讨纳米尺度物质的安全性问题 b m m f i e l 2 0 0 3 s e r v i c e 2 0 0 3 2 0 0 4 年美困化学会 e s t 杂志发表文章 讨论纳米尺度物质对生物 环境 健康等可能带来的潜在影响 z h a n g 2 0 0 3 1 2 1 纳米材料的性质 纳米是长度单位 1 姗等于1 0 一m 1 1 0 0n m 范围内的几何尺度称为纳米尺 度 处于纳米尺度的物质颗粒称为纳米颗粒 按照国家纳米材料术语标准的规定 纳米材料是指物质维构在三维空闻中至少有一维处于纳米尺度 或由纳米结构单元 构成的材料 纳米颗粒是一种处于宏观和微观 原子 电子 水平之间的介观结构 这种结构使其表现出4 种基本的特殊效应 张立德等 2 0 0 1 1 小尺度效应 s m a l ls i z ee f f e c t 纳米结构单元的尺寸与某些物理特征尺寸 如光波 波长 相当或更小时 使材料产生出新的特殊性质的现象 2 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 2 表面效应 s u r f a c ee f f e c 0 纳米颗粒表面原子数与总原子数之比随粒度变小而急 剧增大 引起材料性质发生显著变化的现象 3 量子尺度效应 q u a n t u ms i z ee f f e c 0 纳米颗粒尺寸下降到一定值时 费米能级附 近的电子能级由准连续能级变为离散能级 并使能隙变宽的现象 如光吸收峰蓝移 4 宏观量子隧道效应 m a c r o s c o p i cq u a n t u mt u n n e l i n ge f f e c t 纳米颗粒的一些宏观 量 如颗粒的磁化强度 量子相关器件中的磁通量等 具有穿越宏观系统的势垒的能 力 1 2 2 纳米材料的毒性效应 纳米材料的特殊生物学效应归根结底是由其本身的物理化学性质所决定的 这 些特殊的性质使纳米材料在生物体内 体外产生了一系列不同的生物学效应 它独 特生物学效应可主要归纳如下 拥有较大的表面积是它与细胞乃至生物组织产生相 互作用的关键 d o n a l d s o ne ta l 2 0 0 2 特定的表面性质使其能与生物大分子 如蛋白 质 核酸等 形成复合物 b o r ma n dk r e y l i n g 2 0 0 4 特殊的结构提高了生物体内 诱导生成氧化应激反应的概率 s t o n ee l a l 1 9 9 8 氧化应激反应中生成的自由基可 造成d n a 断裂 y a m a k o s h ie ta 1 2 0 0 3 通过氧化应激反应造成脂质过氧 o b e r d o r s t e r 甜a 1 19 9 4 d u f f i ne ta 1 2 0 0 2 最近研究的纳米材料 碳纳米管 s i 0 2 t i 0 2 以及纳米铁 进入生物体内引起 的一系列生物效应以及它的毒理学检测 纳米粒子一旦进入生物体内 就会在体内 运输并且分布在某些组织或器官内 包括中枢神经系统 银 铝以及碳纳米材料在 暴露后都表现出能在整个生物体内分布 o b e r d o r s t e r 等研究了1 3 c 标记的碳颗粒物 直径2 2 3 0 n m 之间 当以浓度为8 0 和1 8 0 l a g m 3 暴露大鼠6 h 后 颗粒物大部分 分布在肝脏 相反 只有少量的1 2 9 i 颗粒在全身分布 o b e r d o r s t e re ta 1 2 0 0 2 w a n g 等以同样的方法 将水溶性羟基化单层碳纳米管的外表面平均标记约1 个1 2 5 i 原子 通过静脉注射 腹腔注射 灌胃和皮下注射的方式将纳米颗粒物注入小鼠体内 实 验结果表明尽管暴露途径不同 但碳纳米管的分布情况没有太大的差异 主要分布 在胃 肾脏和骨骼中 在其它的脏器中也有分布 w a n ge t a l 2 0 0 4 其他学者则发 现 沉积在肺组织的纳米颗粒会有极小部分转移到血液或其他器官中 d o n a l d s o ne t a 1 2 0 0 4 n e m m a re ta 1 2 0 0 2 这些结果表明 纳米材料由于尺寸效应 可造成其在 生物体内大面积分布 细胞学水平检测表明纳米颗粒物在细胞内富集而且可能会与 某些蛋白或其它分子结合形成复合物 c o s t a 等研究发现一种低溶性的镍纳米粒子能 够通过吞噬作用进入细胞 并且镍离子在液泡中被释放后能进入细胞核并与染色体 蛋白相互作用 c o s t a 1 9 9 4 g o o d m a n 等研究发现金纳米晶能够用来做转染试剂 d n a 整合试剂 蛋白质抑 制剂以及其它医药领域中应用的功能载体 进一步研究发现当金纳米晶的侧链被带 3 富勒烯的d n a 损伤机制及毒性效应研究 正电的氨基基蘧取代嚣 薪合成的纳米材料在1 3 1 a m 浓度暴露两种哺乳类动物缨胞 血红细胞和c o s 1 细胞 以及大肠杆菌 就引起了5 0 的细胞死亡 而当金纳米 晶的侧链被带负电的羧基基团取代后 加大浓度进行暴露实验时 并没有孽 起细胞 的活力下降 g o o d m a n e ta l 2 0 0 4 纳米颗粒物是否对细胞凋亡过程产生特殊的影响也是人们所关注的重要问题之 一 r a l l m a n 等在比较2 0 n m 的超细t i 0 2 颗粒和2 0 0 n m 的细麓0 2 颗粒对原代大鬣胚胎成 纤维细胞的影响时发现 经2 0 r i m 的超细t i 0 2 颗粒处理后的细胞 其微核数目显著升 高 引起了细胞凋亡 r a h m a ne ta l 2 c 0 2 j i 簌等用m t f 的方法研究单层碳纳米管 对肺泡巨噬细胞的影响时也出现了细胞凋亡的现象 j i ae ta 1 2 0 0 5 纳米材料以各种方式进入生物体内 引起的一系列的生物效应和毒性效应 导 致这些现象发生的主要因素包括纳米材料的尺寸大小 化学组成 表面积 溶解度 和形状 以下将展开讨论纳米材料的毒性效应与其特殊性状的关系 薹 2 2 1 纳米材料的尺寸大小与毒性效应的关系 研究表明纳米材料的尺寸大小既决定它在生物细胞体内的分布情况又决定它引 起的毒性效应 f e r i na n do b e r d o r s t e r 1 9 9 2 o b e r d o r s t e re ta 1 1 9 9 2 与微米颗粒物 相比 纳米能趸容易诱导产生氧化应激效应 s t o n ee ta t 1 9 9 8 纳米粒子不易被吞 噬细胞所吞噬 反而还抑制肺泡巨噬细胞细胞的吞噬能力 l u n d b o r ge t 讲 2 0 0 1 r e n w i c k 在研究2 9 n m 的超细髓 2 巨噬细胞和2 5 0 n mt i 0 2 的颗粒对臣噬细胞株 j 7 7 4 2 m f 的吞噬能力的影响表明 巨噬细胞对2 9 n mt i 0 2 的吞噬作用明显下降 r e n w i c ke ta 2 0 0 1 纳米粒子更容易诱导炎性效应 d o n a l d s o ne ta 1 2 0 0 1 将 2 0 n m 和2 5 0 n m 的纳米材料以支气关管注入法注入小鼠体内 前者引起的支气管肺 泡灌洗液内炎性细胞数基 蛋自质总量 乳酸脱氢酶活性及葡萄糖苷酸酶的活性增 加 纳米粒子更容易进入间质空间 o b e r d o r s t e re t a l 2 0 0 0 纳米粒子能够更稳定的 进入细胞和细胞器 纳米颗粒物 直径 1 0 0 n m 在人上皮细胞和大鼠肺泡臣噬细胞 的体外暴露研究中 发现纳米材料颗粒物能够进入细胞并且富集于线粒体 引起的 氧化应激破坏线粒体膜 l ie la 1 2 0 0 3 1 2 2 2 纳米材料的组成成分对毒性效应的影晌 除了纳米材料的大小外 化合物本身的化学成分也是诱导产生肺炎的关键因素 l a m 等将三种类型的纳米材料 单层碳纳米管 硅颗粒物 碳黑颗粒物 用滴注的 方式注入大鼠体内 碳纳米管和硅颗粒物都诱导大鼠肺部产生肉芽肿 而碳黑颗粒 物却没有出现类似的现象 这 结果同样表明碳黑和纳米管在毒性上具有本质的不 同 这种新的肺部毒性和损害机制可能帮纳米管独特的物理化学性质和表谣化学有 关 c h i ue l a l 2 0 0 4 量子点 也曩唾纳米晶 它是纳米尺度原子和分子的集合体 一般颗粒直径范围 在2 2 0 n m 间 早期发现的c d s e 纳米晶对无限增殖的细胞系是没有毒性的 d e r f u s 等 也发现了如果在空气或是紫外线下用c d s e 纳米晶暴露肝细胞 就会对肝细胞产生毒 4 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 性效应 d e r f u se la 1 2 0 0 4 因为在空气暴露时 氧能与s e 结合 并且c d 2 能从晶 体上释放出来 最近s h i o h a r a 等研究三种类型的巯基十一烯酸修饰c d s e 纳米晶在体 外暴露三种类型的细胞 猴肾细胞 人宫颈癌细胞 和人肝细胞 发现纳米晶导致 细胞活性下降 暴露4 6 小时后细胞死亡 s h i o h a r a e ta 1 2 0 0 4 另外 纳米材料的化学组成成分决定了生物材料颗粒物在体内的分布情况 对 于两种多聚物 多聚甲基异丁烯和多聚酸苯乙烯 前者在脾脏富集 而大多数多聚 酸苯乙烯在腹膜腔的脂肪组织聚集 只有少量颗粒物分布在脾脏 t o m a z i ce ta 1 2 0 0 1 1 2 2 3 纳米材料的表面修饰物对毒性效应的影响 纳米材料在空气中暴露时 能够与一些组分 如有机物和金属 整合在一起 形成一些非常复杂的物质 w i l s o n 发现金属铁能够增强碳黑颗粒物的表面活性 从 而诱导产生氧化应激效应 w i l s o ne ta 1 2 0 0 2 相反 有些纳米颗粒物的表面被 修饰后能减小它对体外培养细胞的毒性作用 g u p t ae ta 1 2 0 0 5 d u f f i n 研究发现 当纳米材料t i 0 2 碳黑和乳胶被乳酸铝修饰后 细胞的炎症反应及毒性效应明显下 降 d u f f i ne ta 1 2 0 0 2 最近的研究也表明富勒烯表面被修饰后 在细胞活力的检测 中细胞毒性明显下降 然而没有修饰的富勒烯暴露人类细胞时却表现了很强的毒性 效应 s a y e se ta 1 2 0 0 4 1 2 2 4 纳米材料的表面积与毒性效应的关系 纳米材料具有很小的粒径和巨大的表面积 因此一旦与蛋白质结合 将引起一 系列的后果 d o n a l d s o nk e ta 1 2 0 0 4 包括 1 纳米颗粒和蛋白质的复合物具有更 大的流动性 随着蛋白质的代谢过程 纳米颗粒将能在体内迁移到大颗粒物质无法 到达的地方 2 纳米颗粒巨大的表面积能促进蛋白质降解 进而导致蛋白结构和功 能的改变等 1 2 2 5 纳米材料的溶解度对毒性效应的影响 大量研究证明纳米材料以及纳米纤维的溶解度影响它们对生物体及细胞的毒 性 溶解度低的物质能长期停留在肺部 这样将会引起氧化应激效应 直接在物质 表面产生自由基 或者间接的触发防御性细胞流入肺部 导致炎症的发生 纤维质 的生成或癌变 d r e h e r e ta 1 2 0 0 0 d o n a l d s o ne ta 1 2 0 0 4 s t o n ee ta 1 2 0 0 0 1 2 2 6 纳米材料的形状对毒性效应的影响 由于纳米材料的三维空间形态不同 导致了纳米材料的形状有所差异 而纳米 材料的形状也是它导致生物体产生毒性的重要因素之一 纤维状纳米材料是证明形 状对细胞毒性有影响的一个例证 碳纳米管是一类特殊的纤维 单层碳纳米管在体 内通过滴注处理的方式暴露 诱导肺部产生肉芽肿 l a me ta 1 2 0 0 4 w a r h e i te ta 1 2 0 0 4 s h e v d o v a d e 等观察到在体外暴露人角质形成细胞时 没有纯化的单层碳纳米 管产生了氧化应激 细胞毒性以及细胞活力的下降 s h e v d o v ae ta 1 2 0 0 3 1 2 2 7 小结 富勒烯的d n a 损伤机制及毒憔效麻研究 就纳米颗粒的角度看 它孳 起毒性与颥粒直径熊大小有着密切的关系 纳米颗粒 物较大的比表面积和小的粒子直径 极易进入细胞与生物分子作用 它的这种行为 大大增加了它引发毒性的可能性 因此 需要对不同颗粒直径的网种纳米材料的毒 性效应及作用机制深入研究 从纳米材料的包被物和外界环境角度看 可以发现纳米 颗粒物 被不同的物质修饰后 具有不同性质 如细胞膜的亲和力 化合物表面独特的 物理化学性质 相丽的纳米材料可能会引发不同的毒性效应 在改交暴露的外界 条件时 空气 紫外线 光照等 毒性效应也会有相应的改变 从细胞 基因等 不同楚度看 纳米材料体外暴露的研究中 导致细胞产生一系列生物效应 如细胞 凋亡 细胞毒性等反应 而导致这些结果的机理还不是很清楚 纳米材料进入细胞 后 在细胞内从细胞膜到细胞核是怎样与细胞因子作用 而导致基因表达的改变 酶活力改变等 这些都是有待解决的问题 重 3 富勒烯的性质及生物学效应 1 9 8 5 年 k r o t o 等首先发现了碳元素的第三种同素异形体c 6 0 的存在 k r o t oe t a l 1 9 8 5 这一发现立即引起了科学家们浓厚的兴趣 随后人们发现 除c 6 0 外 碳原 子还可构成其它封闭笼状多面体结构 如c 2 8 c 3 2 c 5 0 c 7 0 等 人们将这一类具 有封闭笼状结构 由偶数个碳原子构成的原子簇统称麦富勒烯 其中 c 6 0 的丰度最 高 其次是c 7 0 1 9 9 0 年k r o t o 等用电弧法制备克量级c 6 0 获得成功 从而宙勒烯的 研究获得了广泛飞速的发展 美国 s e i e n e e 杂志评选c 6 0 为 1 9 9 1 年年度分子 并说 还没有哪一种分子如此迅速地打开通向科学新领域的大门 它对现在 将来 对物理 化学 材料及生命科学等领域都将产生重大深远的影响 正由于富勒烯的应用将会深入到社会发展的各个角落 有必要对其各方面的生 物学效应加以研究 尤其是其毒性效应 以对富勒烯的广泛应用及时做出环境和健 康风险评价 l 3 量富勒烯的理化性质 c 6 0 固体为黑色粉末 密度1 6 5 9 c m 3 汰0 0 5 9 c m 3 熔点大于7 0 0 易溶于c s 2 甲苯等中 在脂肪烃中溶解度隧溶剂碳原予数的增加而增大 经色谱分离得到的纯 c 6 0 为深黄色固体 在有机溶剂中则成洋红色 c 6 0 能在不被裂解情况下升华 刘祖 武 1 9 9 9 富勒烯中以c 6 0 最稳定 其簇状结构酷似足球 相当予一个壶2 0 面体 截顶面而得到的3 2 面体 3 2 个面中包括1 2 个五边形面和2 0 个六边形面 每个五 边形均与5 个六边形共边 丽六边形则将1 2 个五边形彼此隔开 c 6 0 分子中每一个 碳原子与周围三个碳原予形成3 个 键 剩余的轨道和电予共同组成离域矩键 可 简单地将其表示为每个碳原子与周围3 个碳原子形成2 个单键和1 个双键 史启祯 6 华中农业大学2 0 0 8 届硕士学位论文 1 9 9 8 c 6 0 由6 0 个碳原子组成 共有6 0 个冗电子 分布在碳球上形成一个大冗键 它具有典型的缺电子烯烃特征 可作为电子受体 接受1 6 个电子形成c 1 c 矿的 阴离子自由基 它可以与自由基反应 是理想的囱由基清除剂和抗氧化剂 d u b o i se t a 1 1 9 9 1 c 6 0 的结构参数为c c c 键角平价为1 1 6 0 杂化轨道类型为s p 2 2 3 六边 形键长为0 1 3 8 8 n m 五边形键长为0 1 4 3 2 n m 晶体型式为面心立方的分子晶体 玉 福民等 2 0 0 2 1 3 2 富勒烯与生物体的氧化应激效应 c 6 0 在光催化条件下会产生超氧阴离子和单线态氧 其主要原因是c 6 0 通过光的 催化作用转变为单线激发态1 c 6 0 由系统间过渡效应转变为三重激发态3 c 6 0 通 过电子转移作用形成c 6 0 自由基 f o o t e 1 9 9 4 水相中c 6 0 自由基可以传递给氧气分 子形成超氧阴离子单线态氧 g u l d ie ta l 2 0 0 0 y a n g 等研究光催化条件下三丙二 酸富勒烯会对h e l a 细胞造成明显的细胞毒性 y a n ge ta 1 2 0 0 2 v i l e n o 继续研究羟 基修饰富勒烯衍生物对正常和癌变的人膀胱细胞以及鼠神经细胞的毒性 光催化条 件的富勒烯衍生物会对各种细胞产生明显的氧化损伤效应 细胞形态发生改变 神 经细胞伪足增生 电子自旋共振检测氧自由基的形态发现 单线态氧对细胞膜的破 坏是引起的一系列毒性效应的重要原因 v i l e n oe ta 1 2 0 0 4 然而 众多关于富勒烯对生物体造成氧化损伤的研究中 富勒烯在生物体内无 光催化的条件下就可能造成毒性效应 尤其是脂质过氧化 o b e r d o r s t e r 等将黑鲈暴 露于含0 5 m g k g 可溶性c 6 0 的水中 4 8 h 后取黑鲈脑部组织分析发现黑鲈出现了明 显的脑部 肝部脂质过氧化损伤 鳃部总谷胱甘肽显著下降并且相关基因的表达发 生改变 o b e r d o r s t e r 2 0 0 4 z h u 等对成年雄性钝头鳟的暴露实验发现0 5 m g k g 四 氢呋喃处理的c 6 0 在6 1 8 h 内可引起死亡 而经水搅拌处理的c 6 0 组4 8 h 后仍未发现 死亡 深入研究发现 经水搅拌处理的c 6 0 组钝头鳟大脑脂质过氧化物升高 而鳃 部升高更加明显 c y p 2 家族同工酶c y p 2 k 1 c y p 2 m 1 表达明显增强 z h ue ta 1 2 0 0 6 o b e r d o r s t e r 等采用水搅拌处理法溶解c 6 0 并研究其毒性效应 无脊椎动物永 蚤 桡足虫经2 1 天暴褥后 发现c 6 0 在浓度为2 5 m g k g 5 m g k g 时出现了明显的蜕 皮延迟和子代数量减少 对脊椎动物钝头鳟 日本青鲻的研究并未发现2 种鱼肝脏 细胞色素p 4 5 0 酶系c y p l a c y p 2 k 1 和c y p 2 m 1 的蛋白及m r n a 水平改变 可能 原因是各次实验的喂养方法 动物种属和材料准备方法的不同 虽然细胞色素p 4 5 0 酶水平没有改变 但因为c 6 0 暴露而产生的氧化损伤是存在的 研究发现钝头鳟的 过氧化物酶体脂质转运蛋白p m p 7 0 表达水平明显降低 其后果是脂肪酸代谢和脂质 修复受抑制 氧化应激增强 o b e r d o r s t e re ta 1 2 0 0 6 同样 离体细胞实验结果表 明 在无光催化条件下 c 6 0 可以造成明显的细胞毒性效应 造成脂质过氧化 细胞 活力下降 并且这种毒性效应可由在暴露过程中添加抗氧化剂丽被抑s t j s a y e se t a l 7 富勒烯的d n a 损伤机制及毒性效应研究 2 0 0 4 s a y e se t 斑 2 0 0 5 o c 6 0 分子属于缺电子烯烃结构 具有芳香烃化合物的物理化学性质 不溶于水 易于溶解在有机溶剂中 通过溶剂交换法将c 6 0 溶解到水溶液中 c 6 0 分子表面的大 霄键会吸附多个电子 其电负性明显增强 b r a n te ta l 2 0 0 6 由于c 6 0 在水溶液中 的高电负性 c 6 0 分子会与生物大分子或细胞膜有较强的相互作用 这是造成细胞毒 性和氧化损伤的主要原因 于此同时 许多研究报道c 6 0 并无明显的细胞毒性 l e v ie ta 1 2 0 0 6 他们采 用一种新的方法处理c 6 0 使其在水中的溶解度增大 并且在制备过程中不使用毒性 大的有机溶剂 避免干扰 实验发现 c 6 0 即使在2 0 0 p g m l 的浓度下也不会对多种 细胞产生毒性效应 细胞活力无变化 并且细胞形态和骨架保持正常 使用田鼠进 彳亍大剂量的急性暴露实验 c 6 0 的毒性效应并不显著 使用鼠沙门氏菌t a l 0 0 t a l 5 3 5 t a 9 8 和t a l 5 3 7 进行a m e s 实验 结果显示c 6 0 也无明显诱变活性 m o r i p a 1 2 0 0 6 实验结果表明c 6 0 不仅无明显毒性 甚至c 6 0 是强的自由基清除剂 可以保护生 物体和细胞不受辐射和氧自由基的影响 d u g