（发酵工程专业论文）丙酮酸高产菌的选育及其发酵条件的研究.pdf

天津科技大学硕士学位论文 摘要 本文在对丙酮酸发酵机制进行分析的基础上 以代谢控制发酵理论为指 导 重点研究了丙酮酸高产菌的选育及其发酵条件 1 建立了发酵液中丙酮酸定性定量测定的高效液相色谱分析方法 确定 了高效液相色谱法分析条件 s h i m a d z ul c 一3 a 高效液相色谱仪 s c r 1 0 1 h 色谱柱 3 0 0 m m 7 9 m m 流动相为高氯酸水溶液 p h 3 8 流速0 8 m l m i n 柱温为室温 在此条件下对发酵液中丙酮酸进行回收率 重现性等实验 结果该法具 有回收率高 重现性好 准确 快速等特点 而且能同时测定出发酵液中其 它有机酸 为丙酮酸菌种选育和发酵条件的研究工作提供了可靠的分析方法 2 诱变选育得到一株丙酮酸高产菌t o r u l o p s i sg l a b r a t at g p l 9 从7 株供 试菌中选出一株摇瓶发酵丙酮酸产量最高的t g l a b r a t at g 0 6 菌株 然后 以 甲基磺酸乙酯为诱变剂对t g l a b r a t at g 一0 6 进行诱变 选育出一株在丙酮酸唯 一碳源培养基上不长或生长微弱的丙酮酸高产菌t g l a b r a t at g p l 9 发酵产酸 水平3 0 s g l 较出发菌提高2 8 7 营养缺陷型鉴定表明t g l a b r a t at g p l 9 为烟酸 盐酸硫胺素 生物素和盐酸毗哆醇四种维生素缺陷型 3 研究确定了t g l a b r a t at g p l 9 摇瓶分批发酵培养基和发酵条件 如种 子培养基 发酵培养基和影响丙酮酸发酵的条件 在优化条件下经6 0 h 摇瓶 分批发酵 丙酮酸产量3 9 6 9 l 转化率4 9 5 4 对t g l a b r a t at g p l 9 5 l 发酵罐发酵进行了初步研究 在摇瓶单因素实 验和5 l 发酵罐分批发酵实验的基础上 采用以下方法进行发酵 将初始葡萄 糖浓度降低为6 0 9 l 发酵过程中两次补加 同时保持整个发酵过程中总c n 比 质量比 为2 5 1 不变 经4 8 h5 l 罐发酵 丙酮酸产量达6 1 9 9 l 转化 率5 3 8 总糖浓度1 1 5 9 l 生产率1 2 9 9 l h 国外最高水平为 发酵时 间6 3 h 产量6 7 8 9 l 转化率4 9 4 发酵方式3 l 罐分批补料 生产率 1 0 8 9 l h 1 可见 除产量略低外 转化率和生产率均高于国外最好水平 对 5 l 发酵罐发酵产物进行h p l c 分析表明 5 l 罐发酵产物为丙酮酸 不含杂 酸 产物纯 对下游提取极为有利 关键词 丙酮酸 光滑球拟酵母 诱变育种 发酵 条件 分批补料 高效 液相色谱 a b s t r a c t a b s t r a c t a c c o r d i n gt ot h et h e o r yo fm e t a b o l i cc o n t r o lf e r m e n t a t i o n t h ed i s s e r t a t i o n m a i n l y f o c u s e so nt h e b r e e d i n g o fh i 曲 p y r u v a t e p r o d u c i n gm u t a n ta n di t s f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s 1 t h em e t h o do fh p l cw a sd e f i n e dt od e t e r m i n ep y r u v a t ec o n c e n t r a t i o n q u a l i t a t i v e l y a n d q u a n t i t a t i v e l y i nt h ef e r m e n t a t i o nb r o t h t h e o p t i m a l c h r o m a t o g r a p h i c c o n d i t i o n sw a ss c r 1 0 1 h c h r o m a t o g r a p h i cc o l u m n r o o m t e m p e r a t u r e f l o wp h a g e f l o w r a t eo 8 m l m i n p h 3 8 i tp r o v e dt h a th p l cw a s f i tf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp y r u v a t ei nb r o t hb e c a u s eo fi t s a c c u r a c y a n d s p e e d i n e s sb yt h et e s t s o fr e p r o d u c t i v i t ya n dr e c o v e r yr a t eo nt h i sc o n d i t i o n f u r t h e r m o r e i tc a nd e t e r m i n eo t h e ro r g a n i ca c i d ss i m u l t a n e o u s l y c o n s e q u e n t l y i t i sar e l i a b l ea n a l y t i cm e t h o df o r t h es t u d y0 1 3b r e e d i n ga n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s 2 o n e h i g h p y r u v a t e p r o d u c i n g s t r a i n t o r u l o p s i sg l a b r a t a t g p l 9w a s d e r i v e db ym u t a g e n i ct r e a t m e n tw i t he m s as t r a i n t g l a b r a t a t g 一0 6w h i c h p r o d u c em o s tp y r u v a t ew a ss e l e c t e d f r o ms e v e no r i g i n a ls t r a i n s b ym e a n so f f e r m e n t a t i o n t h e n t g l a b r a t at g 0 6w a st r e a t e db ym u t a g e n i ce m s a n do n e h i g h p y r u v a t e p r o d u c i n gs t r a i nt g l a b r a t a t g p l 9w a ss e l e c t e d w h i c hd o e s n t g r o w o nt h em e d i u mc o n s i s t e do f p y r u v a t ea ss o l ec a r b o ns o u r c e t h ep r o d u c t i o n o fp y r u v a t ew a s3 0 5 9 l w h i c he n h a n c e d2 8 7 i t s g e n e t i c l a b e l sa r et h e a u x o t r o p h o f n i c o t i n i ca c i d t h i a m i n h c l b i o t i n a n dp y r i d o x i n e h c l 3 t h eb a t c hf e r m e n t a t i o nm e d i u m sa n dc o n d i t i o n so ft g l a b r a t at g p l 9i n s h a k ef l a s kw e r es t u d i e d t h ef a c t o r s s u c ha ss e e dm e d i u m f e r m e n t a t i o nm e d i u m a n df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r ed e t e r m i n e d p y r u v a t ep r o d u c t i o n3 9 6 9 la n d c o n v e r s i o nr a t e4 9 5 w e r ea c h i e v e da f t e r4 8 hb a t c hf e r m e n t a t i o ni ns h a k ef l a s k o nt h es u p e rc o n d i t i o n s 4 t h ef e r m e n t a t i o no ft g l a b r a t at g p l9i n5 lb i o r e a c t o rw a ss t u d i e d p r e l i m i n a r y o nt h eb a s i so fs i n g l e f a c t o re x p e r i m e n ti ns h a k ef l a s ka n db a t c h f e r m e n t a t i o n5 lb i o r e a c t o r t h ef o l l o w i n ge x p e r i m e n tw a sc a r r i e do u t t h ei n i t i a l g l u c o s ec o n c e n t r a t i o nw a sd e c r e a s e dt o6 0 e g l a n df e e dg l u c o s e t w i c ei nt h e c o u r s eo ff e r m e n t a t i o n m e a n w h i l e t h ec a r b o na n dn i t r o g e nr a t i ow a sm a i n t a i n e d c o n s t a n t l y n a m e l y2 5 1 c o n s e q u e n t l y p y r u v a t eo f 6 1 9 9 l c o n v e r s i o nr a t eo f 5 3 8 a n dp r o d u c t i v i t yo f1 2 9 9 l h 1w e r ea c h i e v e da f t e r4 8 hf e r m e n t a t i o ni n5 l b i o r e a c t o r t h em a x i m u ml e v e l sw e r ey i e l d6 7 8 e d l c o n v e r s i o n r a t e4 9 4 p r o d u c t i v i t y1 0 8 9 l ma f t e r6 3 h f e e d b a t c hf e r m e n t a t i o no nc o n d i t i o n st h a tt o t a l g l u c o s ec o n c e n t r a t i o nw a s1 4 0 9 l o n ec a n s e et h a tb o t hc o n v e r s i o nr a t ea n d p r o d u c t i v i t ye x c e e d o v e r s e a s e x c e l l e n ty i e l d d e t e l m i n a t i o nb yh p l co f p r o d u c t s i l 天津科技大学硕士学位论文 i nb i o r e a c t o rs h o w st h a tt h e p r o d u c to n l yc o n s i s t s o fp y r u v a t e w h i c hi s v e r y b e n e f i c i a lt oe x t r a c t i o nd o w n s t r e a m a n dn oo t h e ra c i d s k e y w o r d s p y r u v a t e t o r u l o p s i sg l a b r a t a m u t a g e n i cb r e e d i n g f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n f e e d b a t c h h p l c 1 1 i 人潍科技人学坝 i 学位论义 1 1 丙酮酸的理化性质l l l 第一章绪论 丙酮酸 p y r u v a t e 或p y r u v i ca c i d 又名乙酰甲酸 a c e t y l f o r m i ca c i d 2 一 酮基丙酸 2 一k e t o p r o p i o n i ca c i d 2 氧代丙酸 2 一o x o p r o p a n o i ca c i d 是诤i t 尤色 至浅色的液体 有类似乙酸气味 见光色变深 易吸潮 聚合 分解 能与 水 乙醇 乙醚混溶 其相对密度 斛5 1 2 6 7 熔点1 1 8 沸点1 6 54 c 分 解 折射率 d 2 0 1 4 1 3 8 分子式c 3 h 4 0 3 分子量为8 8 0 6 其结构式如 图1 所示 图1 1 丙酮酸的结构式 f i g 1 1t h e s t r u c t u r eo f p y r u v a t e 1 2 丙酮酸的用途 1 2 1 在生化研究上的应用 i j 丙酮酸是测定伯醇 仲醇和脂肪胺含量的通用试剂 也是测定转氨酶及 乳酸脱氢酶活力的生化试剂 同时它也是动物细胞的培养基成分 在细胞培 养上与乳酸共同组成抗氧化剂 降低对细胞的危害 1 2 2 在日化工业上的应用 丙酮酸乙酯是生产化妆品的重要原料 丙酮酸乙酯对抑制表皮中酪氨酶 的形成具有良好的功效 因此可以阻止表皮黑色素的形成 美白皮肤 在沐 浴品 雪花霜和膏类护肤品等产品中加入量仅1 2 0 丙酮酸乙酯可预防和治 疗以开裂 剥落和鳞化为特征的皮肤疾病 营养和改善干性皮肤 促进伤口 愈合 将丙酮酸乙酯添加到化妆品中还起到很好的防腐剂和抗氧剂的作用 作为空气清新剂 能有效清除空气中的氨及甲硫醇 而且气味清新自然 1 2 3 在食品工业上的应用 g b 2 7 6 0 1 9 9 6 将丙酮酸规定为酸味添加剂 丙酮酸具有醋酸香气和愉快 酸味 是很有发展潜力的食品酸味剂 而且 丙酮酸作为饲料和食品添加剂 具有很好的防腐保鲜功能 目前国内少量用于饲料和果酒的保存中 生理上 叫 一 文涉 嘶 第一章绪论 丙酮酸钙具有特殊的减肥作用 添加丙酮酸钙的食品赋予功能食品的含义 必然会受到消费者特别是肥胖者的青睐 1 2 4 在医药方面的应用 丙酮酸是酶法合成色氨酸 l t r y 2 和酪氨酸f l t y r 3 1 l 多巴 医学 上用来治疗帕金森氏病 4 1 是氢化阿托酸 h y d r a t r o p i ca c i d 的原料 乙烯 系聚合物的起始剂 人工器官的合成原料 是合成l 半胱氨酸 l 亮氨酸 v b 6 和v b l 2 的原料 科学家们从丙酮酸出发 合成了一种称之为 血管紧张肽i i 抗药 的化合 物 该化合物能有效地抑制 血管紧张素 2 人体内一种能使血压升高的物质 的形成从而降低血压 5 同时丙酮酸还可以用来合成系列蛋白酶抑制剂 抗 病毒剂 镇静剂 消炎镇痛药辛可芬 抗结核药异烟肼丙酮酸钙 解热药2 一 苯基喹啉 4 羧酸 驱虫药恩波吡维胺 药物磷酸烯醇丙酮酸 4 一甲唑甲酸 抗病毒剂氮杂喹喔啉以及噻咪药物等 丙酮酸的另一个重要应用领域就是用作减肥剂 研究人员发现 外界补充 丙酮酸 通过刺激线粒体加速t c a 循环 从而加速脂肪消耗达到减肥的目的 v i r t u a lm u s c l e 杂志中提到 p i r s b u r g h 医学中心附属大学的科学家们说明 饮食中添加含有丙酮酸盐 通常为钠 钾 钙 镁盐 的补充剂 不仅可以 增加脂肪的代谢高达4 8 而且可以减少因低脂饮食造成的蛋白质流失 v i r t u a lm u s c l e 杂志指出 最新的研究报告发现 丙酮酸盐的有效剂量是每天 约5 克 而且此剂量似乎是最具效果的 摄取过量的丙酮酸盐并不会造成危 险 年来国外发达国家利用丙酮酸这一特性 以其钙盐作为减肥保健药品 国外有关媒体已经报道 含有丙酮酸钙的减肥药已经风靡全球 成为减肥药 市场上的新宠 1 2 5 在农用化学品方面的应用 丙酮酸乙酯是农药合成中难以替代的原料和中间体 它被广泛应用于杀菌 剂和除草剂的合成 溴代丙酮酸乙酯是高效杀菌剂噻菌灵的主要中间体 噻 菌灵是一种高效广谱的内吸式杀菌剂 对植物有保护和治疗作用 还可以控 制仓储水果 蔬菜的病害 广泛用于柑橘 香蕉等多种水果蔬菜的防腐保鲜 我国卫生部也准许其作为食品添加剂使用 6 1 9 9 6 年h i m i 用丙酮酸合成了一 种高效除草剂 该除草剂选择性优良 对莎草 狗尾草等杂草除去效果良好 而对农作物则很安全 1 2 6 其他应用 壳聚糖对金属离子具有良好的吸附性能 且可生物降解 价格低廉 资 源丰富 因而被广泛的用于工业污水的处理等诸多方面 研究发现 与水杨 醛改性壳聚糖相比 用丙酮酸对其进行化学改性 除引进碳基与 n h 2 反应外 同时引进羧基 能与金属离子形成稳定的五元环整合物 因此极大地提高壳 2 天津科技大学硕士学位论文 聚糖衍生物吸附金属离子的能力f 7 1 3 生产方法 目前生产丙酮酸的方法主要有酒石酸脱水脱羧法 8 1 乳酸乙酯空气氧化 法 9 1 羟基丙酮法 1 0 电化学合成法 1 乳酸催化氧化法 1 2 j 生物发酵法 以及酶转化法 4 1 5 1 6 国内生产丙酮酸的厂家主要有浙江台州兴业化工厂 上海复旦大学太阳神新技术发展公司 杭州金田化工公司 湖州菱湖振兴助 剂厂 湖州大中化工厂 石家庄制药厂 襄西化学工业公司等近1 0 家企业 年生产能力约1 0 0 0 吨 而且大部分使用的是落后的酒石酸法 1 3 1 化学法 作为一种化工产品 虽然丙酮酸早已实现了工业化生产 但是直到2 0 世 纪9 0 年代 工业上还一直沿用酒石酸脱水脱羧法生产丙酮酸 该法工艺简便 易行 是国内生产丙酮酸的主要方法 但是对环境污染比较严重 生产成本 高 缺乏竞争力 乳酸乙酯空气氧化法是复旦大学自行开发的 据报道其成 本约为5 万元 吨 目前己实现工业化生产 羟基丙酮法国外有工业化报道 但是由于原料羟基丙酮原料紧俏 没有工业化生产的意义 1 3 2 生物发酵法 发酵法生产丙酮酸的研究起始于2 0 世纪5 0 年代 1 7 1 8 1 9 1 主要是采用代 谢控制育种技术切断丙酮酸的进一步代谢途径 解除丙酮酸末端产物对限速 酶的反馈调节来选育丙酮酸的高产菌株 发酵法生产丙酮酸研究真正取得进展是在1 9 8 8 年 当时日本东丽工业株 式会社 t o r a y i n d u s t r i e s i n e 的研究人员宫田令子 m i y a t ar e i k o 和米原辙 y o n e h a r a t e t s u 选育出一系列的丙酮酸产量超过5 0 9 l 的球拟酵母 t o r u l o p s i s 菌株 使得发酵法生产丙酮酸的工业化成为可能 1 9 9 2 年 日本率先实现了 发酵法生产丙酮酸的工业化 生物发酵法具有污染小 以葡萄糖为底物 成本低等优点 是一条极有 发展前景的方法 因此近年来人们把目光聚焦到发酵法生产丙酮酸的研究上 我国虽然也有这方面的研究报道 但是仍未实现工业化生产 1 3 3 酶转化法 此法主要是利用某些菌株产生的特殊酶将底物直接转化为丙酮酸 如 c o o p e d 1 利用a c e t o b a c t e r 将d 一 一乳酸氧化为丙酮酸 转化率虽然较高 但 由于d 一 乳酸价格比l 一乳酸高得多 所以工业化方面仍有困难 由 h a n s e n u l ap o l y m o r p h a 中的乙醇酸氧化酶催化的l 乳酸氧化反应具有高转化 率的优点 但是由于l 哥l 酸氧化为丙酮酸的过程中会产生h 2 0 2 如果不及时 除去 丙酮酸会被进一步氧化为乙酸 l6 许平等从自然界中筛选出一株乳酸 氧化酶活力高的菌株腐生葡萄球菌 s t a p h y l o c o c c u ss a p r o p h y t i c u s s m 1 0 直 第一章绪论 接将底物乳酸转化为丙酮酸 而且在此过程中不产生h 2 0 2 较前述几种酶法 具有很大的优越性 但是 各种酶法的产物丙酮酸和底物乳酸的性质相近 分离提取较为困难 迄今还未见工业化生产成功的报道 1 4 市场前景 丙酮酸的工业化生产只有十几年的历史 国内一直沿用酒石酸法生产丙 酮酸 虽然这种方法简单易行 但是其成本高 污染大 按目前的市场价格 计算 仅原料成本就至少需要8 万元 口屯 1 9 9 5 年 国外一些研究机构发表了 关于丙酮酸钙在减肥保健领域的独特疗效的报道后 美国对丙酮酸钙的需求 量激增 价格曾一度涨至3 2 万元 电 国内一些中小型化工厂得到这一信息 后 纷纷上马生产丙酮酸 酒石酸脱水脱羧法 导致生产量猛增 丙酮酸及 其盐的市场价格也迅速跌至目前的不到9 万元 吨 利润空间的狭小及国家对 环保的重视迫使一些厂家寻求成本低 污染小的新的生产方法 近两年来 国内有三四家工厂引进新技术进行发酵法试生产 1 5 发酵法生产丙酮酸的研究进展 1 9 9 4 年y o n e h a r a 和m i y a t a 0 3 j 从各种产丙酮酸菌株中先用休止细胞法后 用发酵法筛选出一株产丙酮酸的优良菌株 一光滑球拟酵母 t o r u l o p s i s g l a b r a t ai f o0 0 0 5 t g l a b r a t ai f o0 0 0 5 在起始葡萄糖浓度为1 0 0 9 l 下经5 9 小时发酵达5 7 o g m 的丙酮酸积累量 随后进行分批补料实验 2 列发现 t g l a b r a t ai f o0 0 0 5 经6 3 小时流加发酵 丙酮酸产量达到6 7 8 9 l 对葡萄糖 产率为o 4 9 4 9 g 1 9 9 4 年y o k o t a 2 l j 报道用基因工程手段选育的缺乏f 1 a t p 酶活力的e c o l i 突变株经2 4 h 发酵 丙酮酸产量达3 0 9 r e 对葡萄糖产率o 6 9 g 以上两种 报道目前是该领域研究的最高水平 国内 李寅等 2 2 选育得到一株能以氯化铵为底物积累丙酮酸的光滑球拟 酵母 t o r u l o p s i s g l a b r a t a w s h i p 3 0 3 该菌株是烟酸 硫胺素 毗哆醇和生 物素四种维生素的营养缺陷型 在采用优化的维生素组合方式进行2 5 l 罐分 批发酵 初糖浓度为1 2 0 9 l 的条件下发酵5 7 5 小时 丙酮酸产量和产率分别 达到6 9 4 9 l 和o 5 9 3 g 南京大学袁辉等1 2 列用自己筛选的3 7 酵母菌进行3 一 氟代丙酮酸敏感突变株筛选 其最高产酸量达5 8 4 m m o l l 提高7 7 目前 我国发酵法生产丙酮酸正在急起直追国外先进水平 1 6 丙酮酸的代谢途径及发酵机制 1 6 1 丙酮酸的代谢途径 细胞内丙酮酸的代谢途径如图2 2 所示 由2 2 可看出葡萄糖进入细胞后 经糖酵解途径生成磷酸烯醇式丙酮酸 然后生成丙酮酸 在此过程中需要 n a d 十作为质子h 的受体 丙酮酸主要通过六条支路进一步代谢 矧 1 丙 d 天津科技大学硕士学位论文 酮酸在丙酮酸脱氢酶系 p d h 的作用下生成乙酰辅酶a 进入t c a 循环 需要焦磷酸硫胺素 t p p 硫辛酸 f a d n a d 辅酶a 和m g 共六种辅 助因子 2 丙酮酸在丙酮酸脱羧酶 p d c 的作用下脱羧生成乙醛 进而 还原成乙醇 其中p d c 需要t p p v b l 作为辅酶 3 丙酮酸在厌氧状态 下由乳酸脱氢酶 l d h 作用生成乳酸 此过程中需要n a d h h 为其提供 质子h 4 丙酮酸在丙酮酸羧化酶 p c 作用下生成草酰乙酸 o a a 此过程需要生物素 b i o 为辅酶 5 丙酮酸在谷 丙转氨酶 以吡哆醛p d x 为辅酶 作用下生成丙氨酸 a l a 6 丙酮酸经多步反应在转氨酶的作用 下形成缬氨酸 异亮氨酸 葡萄糖 乙醇 卜加速代谢流 畸 切断或减弱 表示所需的辅酶或辅基 圈内为辅酶或辅基 n a 表示烟酸 b 1 7 为硫胺素 b i o 为生物素 p d x 为吡哆醇 图2 2 丙酮酸的代谢途径及发酵机制 f i g 2 2t h e m e t a b o l i cp a t h w a ya n df e r m e n t a t i o nm e c h a n i s mo fp y r u v a t e 第一章绪论 1 6 2 丙酮酸的发酵机制 丙酮酸是机体代谢的中间产物 既处于糖酵解 e m p 途径的末端 又 是连接e m p 途径和t c a 循环的关键产物 它可经多条途径生成乙醇 乳酸 革酰乙酸 丙氨酸 缬氨酸和异亮氨酸等 因此其所处的位置极为特殊 根 据代谢控制育种和发酵原理t 2 5 1 要想在生物体内大量积累丙酮酸 就必须迸 一步切断或更确切地说是减弱丙酮酸的进一步代谢支路 加速丙酮酸的合成 速度 去除代谢产物的反馈阻遏或反馈抑制 图2 2 1 7 代谢控制育种 丙酮酸所处的特殊位置决定了丙酮酸高产菌具有如下生理学特性 1 在 保证细胞正常生命活动的前提下 尽可能减少丙酮酸的迸一步降解或转化 这是获得丙酮酸高产量和高产率的必要条件 2 加速从葡萄糖到丙酮酸的 代谢 缩短发酵时间以提高丙酮酸的生产率 1 7 1 出发菌株的选择 丙酮酸发酵的研究起始于二十世纪五十年代 五十年来人们一直在寻找 产丙酮酸的最佳菌株 资料显示能够直接产生丙酮酸的菌种主要有以下各 属 细菌及放线菌 a c i n e t o b a c t e r 不动杆菌属 2 6 1s c h i z o p h y l l u m 裂褶 菌属 2 7 e n t e r o b a c t e r 肠杆菌属 2 8 e n t e r o c o c c u s 2 9 1 e s c h e r i c h i a 埃希氏 菌属 3 0 1 p s e d o m o n a s 假单胞菌属 酵母菌 d e b a r y o m y c e s 德巴利 酵母属 3 2 c a n d i d a 假丝酵母属 3 3 1 鼻a c c h a r o m y c e s 酵母属 3 4 1 和t o r u l o p s i s 球拟酵母属 l3 j 等 1 9 8 2 年 y o s h i k a z ui z u m i 和y o s h i a k im a t s u m u r a 2 6 等人从土壤中分离出 需硫胺素且能利用1 2 一丙二醇 1 2 p r o p a n e d i o l p d 生产丙酮酸的菌株 a c i n e t o b a c t e rs p 8 0 m 用两种方法即生长细胞法和休止细胞法对该细菌的发 酵条件进行优化 发现对于每一种方法 硫胺素添加量都显著影响丙酮酸的 产量 最适条件下 在2 0 m g m l 的p d 中生长细胞法和静止细胞法分别产生 1 4 6 和1 0 o m m l 的丙酮酸钠 1 9 8 9 年 a t s u s h iy o k o t a 和s h o i c h it a k a o l 2 8 从产 一酮戊二酸 k e t o g l u t a r i c a c i d 分子式h o o c c h 2 c h 2 t c o c o o h 的e n t e r o b a c t e r a e r o g e n e ss m 1 8 中分离得到硫胺素和硫辛酸缺陷型突变株 研究发现其硫辛 酸缺陷型突变株产丙酮酸最好 并把l 一1 2 菌株选为最佳产生菌 当该菌在2 的葡萄糖 硫辛酸限量为o 5 u g h 中摇瓶发酵3 天后 丙酮酸和a 一酮戊二酸 的产量分别为4 7 和1 6 酣 当补充5 0 u g 1 的维生素后仅产生a 一酮戊二酸 产 量达5 5g l 他们认为这是由于硫辛酸缺乏而导致丙酮酸脱氨酶系活力减弱的 缘故 1 9 8 2 年 m i t s u a k im o r i g u c h i t 蚓从经过离子交换树脂i r 1 2 0 b n a 预处理 6 天津科技大学硕士学位论文 的柑橘皮浸出液为碳源进行酵母发酵 c o u d e r t i ii f o1 3 8 1 产丙酮酸量最高 9 7 0 m g l o o m l 的最高积累量 从众多的酵母中发现d e b a r y o m y c e s 在最适条件下 4 8 小时内丙酮酸达 同年 s h o i c h it a k a o 和m a s a t o s h it a n d a l 2 7 1 发现一株担子菌s c h i z o p h y l l u m c o m m u n e 发酵葡萄糖产生大量的丙酮酸 证明以聚胨为氮源发酵丙酮酸产量 最高达1 9 e j l 5 天 1 9 9 4 年 y o n e h a r a 和m i y a t a l 3 j 用一种新的休止细胞法 采用硫胺素结构 类似物 羟基硫胺素 研究发现酵母中酿酒酵母属 球拟酵母属 毕赤氏 酵母属 假丝酵母属和t r i c h o s p o r o n 都具有产丙酮酸的能力 他们首先用休 止细胞法筛选 发现酿酒酵母产丙酮酸能力最高 再次用发酵法筛选发现球 拟酵母属的产丙酮酸能力更强 其中光滑球拟酵母丙酮酸产量最高 最后选 择出t o r u l o p s i sg l a b r a t ai f o0 0 0 5 作为高产丙酮酸的出发菌株 经5 9 小时发 酵丙酮酸积累量达5 7 0 9 l 随后进行分批补料实验经6 3 小时流加发酵丙酮 酸产量达6 7 8 l 转化率0 4 9 4 9 g 1 1 3 同年y o k o t a 3 0 报道了一株f 1 a t p 酶活力缺乏的e c o l i 突变株 经2 4 h 发酵 丙酮酸产量达3 0 9 l 转化率o 6 9 g 以上两种报道是目前该领域研 究的最高水平 李寅等 3 5 也分离筛选到了丙酮酸的高产菌株t o r u l o p s i sg l a b r a t a w s h i p 3 0 3 据研究该菌株与t o r u l o p s i sg l a b r a t ai f o0 0 0 5 相比 其独特之处 在于能够很好地利用无机氮源 如氯化铵和尿素 1 7 2 高产丙酮酸生产菌选育原理研究进展 1 7 2 1 选育t p p n a b i o p d x 突变株 维生素对于丙酮酸发酵来说是一个重要的调节因子 因为许多维生素在 丙酮酸的合成和分解中充当辅酶的角色 它们的含量或活性的微量变化都会 显著影响微生物的新陈代谢 若选择t p p n a b i o 和p d x 营养缺陷型菌株 发酵生产丙酮酸 则可减弱 而不是切断 丙酮酸进一步代谢有关酶的活力 从而使丙酮酸获得大量积累 根据这一思想 m i y a t a 研究发现几乎所有的供 试酵母菌中大量积累丙酮酸的都必须是某种或某些维生素的缺陷型 如 t g l a b r a t ai f o0 0 0 5 n a b 1 b 6 一 b i o 在初始葡萄糖浓度为1 0 0 9 l 的情况下 发酵1 3 5 小时后丙酮酸产量达4 8 0 m m o l l 较原养型提高了6 0 1 7 2 2 选育氟丙酮酸敏感型突变株饵均 氟丙酮酸是丙酮酸的结构类似物 研究发现在丙酮酸的甲基上插入强负 电性的氟元素会产生对酶的高度亲和性 在甲基上用溴或羟基等负电性弱的 基团则戏剧性地降低酶对类似物的亲和力 3 一氟代丙酮酸是p d h 酶系的自杀 性底物 在丙酮酸脱羧反应中它可取代丙酮酸作底物 是p d h 酶系的非竞争 性抑制物 用3 氟代丙酮酸作筛子 当子代突变株p d h 酶系活性较亲株低许 7 一 第 章绪论 多时 则很少量的3 一氟代丙酮酸就可以完全抑制此酶活性 使菌株致死 这 类突变株称为3 一氟代丙酮酸敏感型突变株 由于p d h 酶系控制了丙酮酸在细 胞内的主要出口 因此理论上这类细胞的丙酮酸生产能力应该明显上升 袁 辉等用3 一氟代丙酮酸梯度平板初步确定1 0 0 u g l 和1 0 0 0 u g l 为3 氟代丙酮酸 敏感型敏感浓度 用此浓度筛选出的敏感型突变株进行丙酮酸发酵 结果丙 酮酸的产量分别提高了3 2 和4 4 8 1 3 6 1 7 2 3 选育乙酸渗漏型突变株 渗漏突变株是指催化形成某一代谢中间物的酶的活力大大降低的突变 株 因而在基本培养基上只能形成小菌落 但是在补充有该中问产物的培养 基上能大量生长 该类突变株往往在不影响菌体生长的前提下大量积累目的 产物 m i y a t a 等用e m s 诱变选育出乙酸渗漏突变株 据测定乙醇脱氢酶 a d h 和乙醛脱氢酶 a i d h 活力基本不变 而丙酮酸脱羧酶 p d c 活 力下降一半 丙酮酸产量提高了1 5 p 1 7 2 4 加速前体物的合成速度 选育2 d 脱氧葡萄糖抗性突变株 d g 菌体对葡萄糖的利用与菌体从环境中摄取葡萄糖的能力密切相关 这一 吸收过程受到严格调控 若能解除这一调控 将大大提高菌体摄取及利用葡 萄糖的能力 提高菌体生长速度 加速合成丙酮酸前体物的速度 则可显著 缩短产酸时间 提高葡萄糖的利用率 而且降低残糖对产酸也有一定的提高 2 d 一脱氧葡萄糖 2 d g 是d 一葡萄糖的结构类似物 它通常抑制酵母和丝状 真菌 因为2 d g 更容易被己糖激酶和6 磷酸果糖激酶利用生成6 磷酸 2 脱 氧葡萄糖 从而抑制了葡萄糖的酵解及合成细胞壁聚糖的能力 袁辉等人口6 j 用d g r 平板检出3 9 个d g 一抗性突变株 随后进行发酵实验 结果d g 2 突变株丙酮酸产量从5 1 0 m m o l l 提高到6 8 7 m m o l l 上升了3 4 7 残糖从3 2 1 l 降到0 0 1 1 6 l 降低了9 9 6 但对于其它d g 1 8 等菌株 产酸虽然下降 残糖也大幅度下降 这说明d g 抗性与残糖密切相关 与产 酸的提高无明显关系 1 7 2 5 解除代谢产物的反馈调节 选育氟丙酮酸抗性突变株 f p 当将丙酮酸的去路堵截后 可能得到丙酮酸的大量积累 但是当丙酮酸 的量积累达一定程度后 丙酮酸又会对其前面反应的关键酶 如磷酸果糖激 酶 丙酮酸激酶起起反馈抑制或反馈阻遏作用 不利于菌种的生长和产物的 积累 3 氟代丙酮酸是丙酮酸的结构类似物 理论上选育氟丙酮酸抗性突变 株可能解除反馈调节作用 这需要理论和实验的进一步研究才能证实 1 7 2 6 减弱旁路代谢 选育分泌甘油能力低下突变株 米原f 3 别等研究发现细胞 尤其是酵母菌 在高浓度盐类这一不良环境下 为了维持细胞的渗透压 细胞内产生并蓄积多元醇类物质 如甘油 它透过 细胞膜进入发酵液中 并会使细胞膜表面发生脱落 使代谢向着生成甘油的 8 天津科技大学硕士学位论文 方向转变 从而减弱了向丙酮酸代谢的速度和数量 为了改变这一状况 他 们选育了高浓度盐类如n a c l 耐性株 得到细胞膜强度更大 更耐高盐的突变 株 这样甘油在胞内积累 当浓度达到一定值后会发生反馈调节 使代谢流 转而流向生成丙酮酸 增加供氧量使n a d h 2 含量降低 也能降低甘油的生成 量 1 7 2 7 基因工程手段选育f 1 a t p 酶缺损的突变株 y o k o t a 等采用转导的方法 将经体外诱变的f 1 a t p 酶基因转入一株产丙 酮酸的大肠杆菌k 一1 2 品系的突变株e c o l iw 1 4 8 5 l i p 2 中 从而抑制a t p 的 产生 转导后的突变株t b l a 1 产酸较亲株提高 原因是降低了f a t p 酶的 活力 导致细胞的能量水平降低 提高了糖酵解途径的流量 在对数生长期 突变株糖酵解过程中的磷酸甘油激酶和丙酮酸激酶的酶活均高于亲株 3 0 l 1 7 2 8 其它 如寻找丙酮酸羧化酶 p c 缺损株 蛋氨酸或精氨酸营养缺蹈型等 1 8 发酵条件研究进展 在丙酮酸的发酵生产中 培养基的组成及培养条件对产量的影响很大 m i y a t a 等筛选的优良菌种t g l a b r a t ai f o0 0 0 5 需四种维生素才能完全生长 且丙酮酸处于e m p 途径和t c a 循环的枢纽位置 因此对培养基的组成及发 酵条件控制对于提高丙酮酸的产量来说显得尤其重要 1 8 1 培养基的组成 1 8 1 i 碳源和氮源及c n 比 生长特别是对发酵生产有机酸的微生物来说 充足的碳源是积累大量有 机酸所必需的 常用的有葡萄糖 浓度一般为1 0 氮源含量要少 据文献 报道 常用的有聚胨 蛋白胨 大豆水解物以及 n h 4 2 s 0 4 等 但要特别 注意的是天然氮源维生素的组成及含量对发酵影响很大 c n 比对于微生物地生长和大量积累有机酸来说相当重要 李寅等研究 发现若在提高葡萄糖的浓度的同时提高蛋白胨的浓度 以保持c n 不变 则 丙酮酸生产也会得到促进 然而若提高葡萄糖浓度 蛋白胨浓度却保持不变 即c n 增大 则发酵后期 4 0 h 后 细胞生长速度和耗糖速度明显下降 丙酮酸产率也显著降低 李寅分析这可能是在缺乏氮源条件下e m p 途径中某 些关键酶的合成受阻的缘故 1 8 1 2 生长因子 根据丙酮酸的发酵机制 丙酮酸高产菌应是它的某 种或几种维生素的 缺陷型 事实上从自然界中筛选的高产菌也确实是它的维生素缺陷型 如硫 胺素缺陷型 1 3 硫辛酸缺陷型 2 l t g l a b r a t ai f o0 0 0 5 t g l a b r a t aw s h i p 3 0 3 都是硫胺素 生物素 烟酸和吡哆醇四种维生素缺陷型 发酵液中必须添加 9 第一章绪论 适量的这四种维生素才能使菌体既能正常生长也能不断地大量积累丙酮酸 因此关键是控制好发酵液中维生素的含量 李寅研究结果指出 添加0 i m g l 的核黄素也会促进t g l a b r a t a w s h i p 3 0 3 产酸 据推测可能是核黄素的添加加速了电子传递 从而加快了 糖酵解速度 2 j 1 8 2 溶氧量及供氧方式 h u aq i a n g 3 9 1 等测定了不同供氧状况对t g l a b r a t ai f o0 0 0 5 丙酮酸发酵 的影响 发现供应充足的氧气时产生大量丙酮酸 而乙醇的产量下降 并且 得出3 0 4 0 的溶氧量对于产丙酮酸来说是最有益的 在限氧条件下 由于 t c a 循环和呼吸活力的减弱而导致能量限制使细胞生长抑制 虽然高浓度 t p p 辅因子也许能导致p d h 复合酶活力的提高 但是在低溶氧量下较高含量 的胞内n a d h 2 倾向于抑制此复合酶系的活力 并且由于p d c 活力大以及 n a d h 氧化的需要而使得胞内丙酮酸大量 大于7 0 被脱羧 其它过量的 n a d h 在限氧条件下通过果糖一1 6 一二磷酸形成甘油而氧化 随着培养基中溶 氧量的增加 细胞生长加快 p d c 和p d h 复合酶的活力在丙酮酸产生阶段均 减弱 导致葡萄糖转化率增加 李寅等 j 选择两种不同的供氧方式进行研究 i 搅拌转速恒定在 7 0 0 r m i n i i 搅拌转速按相对溶氧不低于4 0 的要求逐渐升高 结果 相对较 高的溶氧有利于丙酮酸的积累 1 8 3p h 值的控制 发酵过程中菌体不断产生并向发酵液中分泌丙酮酸 使发酵液p h 值不断 下降 p h 值的不断下降对菌体生长来说尤为不利 因此必须控制发酵期间的 p h 值 一般来说发酵液中的p h 值要控制在5 6 左右 常用方法有 1 向 培养液中预加c a c 0 3 2 流加n a o h 3 流加氨水 氨水不仅可以用来降 低控制发酵液的p h 值恒定 而且还可作为氮源 起到双效的作用 1 9 课题立项背景与意义 近年来 丙酮酸被广泛用于制药 化工和保健品行业中 应用领域不断 扩大 世界上需求量不断增长 目前我国有约1 0 家企业生产丙酮酸 他们大 部分采用落后的酒石酸合成法 总产量约1 0 0 0 吨 年 丙酮酸是一种酮酸 性质活泼 化工生产成本高 传统的酒石酸法制取成本约8 万元 由复旦大 学最新开发的乳酸乙酯空气氧化法成本也在约5 万元左右 丙酮酸市场价格 约8 9 万元 吨 而化学法的高成本造成生产企业无利可图 严重限制了有关 行业的发展 因此开展发酵法生产丙酮酸的研究就现得尤其重要 它可促进 有关行业的快速发展 减少对国外产品的依赖 生物发酵法具有原料来源广泛 能耗低 污染少 成本低等特点 近年 1 0 天津科技大学硕士学位论文 来人们开始把目光聚焦到发酵法的研究上来 日本学者经过半个世纪的研究 发现一种酵母菌能大量积累丙酮酸 他们根据代谢调控理论经过进一步诱变 选育出一系列的丙酮酸高产菌株 其丙酮酸产量达6 7 8 l 对葡萄糖转化率 0 4 9 4 9 g 日本已于1 9 8 9 年实现发酵法生产丙酮酸的工业化 近年来我国学 者也开始研究发酵法生产丙酮酸 但是到目前为止仍没有实现工业化 为此 开展发酵法生产丙酮酸的研究立项 加快我国早日实现丙酮酸的发酵法生产 1 1 0 研究内容 1 1 0 1 发酵液中丙酮酸的检测方法研究 针对现有条件研究一种快速 准确且费用相对较低的检测发酵液中丙酮 酸的方法 具体研究硝酸铁比色法 酶法和高效液相色谱法这三种方法 从 而得出供研究所需的可靠方法 1 1 0 2 丙酮酸高产菌的诱变选育 1 1 0 2 1 出发菌株的筛选