（微生物学专业论文）高产环孢菌素a镰刀菌的育种及遗传特性研究.pdf

福建师范大学学位论文使用授权声明 福建师范大学学位论文使用授权声明 2 0 0 5 9 0 5 专业 邀生物堂 所呈交的论文 论文题目 高产环孢菌 素的镰刀菌的选育及遗传特性的研究 是我个人在导师指导下进行 的研究工作及取得的研究成果 尽我所知 除了文中特别加以标注 和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果 本人了解福建师范大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校有权保留送交的学位论文并允许论文被查阅和借阅 学校可以 公布论文的全部或部分内容 学校可以采用影印 缩印或其他复制 手段保存论文 保密的论文在解密后应遵守此规定 学位论文作者签名兰圣兰童 指导教师 签名日期毒d 咯 6 号 摘要 摘要 本研究的目的在于选育高产环孢菌素的镰刀菌菌株 提高这种产生重要免疫抑制剂工 业菌株的经济效益 研究低产和高产菌株遗传特性的差异 了解镰刀菌环孢菌素生物合成 机制 本文首先通过1 8 sr d n a 分子标记鉴定环孢菌素a 产生菌4 2 1 5 0 2 的分类学位置 确 定该菌株属于镰刀菌 与传统分类学鉴定结果一致 利用蜗牛酶 优化酶解条件 获得高产量的原生质体 原生质体浓度为7 1 0 5 个 m 1 在高渗p d a 培养基上原生质体获得再生 原生质体形成率和再生率分别为6 2 8 和2 9 6 利用原生质体激光诱变获得高产菌株 设计嵌套引物通过两轮p c r 克隆出镰刀菌4 2 1 5 0 2 的丙氨酸消旋酶基因部分片段 证 明与雪白白僵菌的丙氨酸消旋酶基因高度同源 关键词 环孢菌素a 茄病镰刀菌 雪白白僵菌 1 8 sr d n a 分子标记 原生质体 丙氨 酸消旋酶 a b s t r a c t l i l l i l l i l l l 一i l i l i l l l i 一 a b s t r a c t t h er e s e a r c ha i m st oi m p r o v et h ee c o n o m i cb e n e f i to ft h ei m p o r t a n ti n d u s t r i a l s t r a i n f u s a r i u m w h i c hp r o d u c e sc y c l o s p o r i n 八t h r o u g hb r e e d i n gh i g h y i e l d i n g s t r a i n u n d e r s t a n dt h eb i o s y n t h e s i sm e c h a n i s mo ff u s a r i u m a n dt h eh e r e d i t a r y c h a r a c t e r i s t i c sd i f f e r e n c eb e t w e e nt h eh i g hy i e l d i n gs t r a i na n dt h el o wy i e l d i n g s t r a i na sw e l l t h ep a p e rf i r s ti d e n t i f i e dac y c l o s p o r i nap r o d u c i n gs t r a i n4 2 1 5 0 2a sf u s a r i u m g e n u sb y 18 sr d n am o l e c u l a rm a r k e r w h i c hi sc o n c o r dw i t ht r a d i t i o n a l t a x o n o m y h i g hc o n c e n t r a t i o np r o t o p l a s tw i t h7 x 1 0 5 i i l lw a sa c q u i r e db ye n z y m o l y i n gt h ec e l l w a l l w i t hs n a i l e n z y m e a n d o p t i m i z i n ge n z y m a t i ch y d r o l y s i s c o n d i t i o n s p r o t o p l a s t sr e g e n e r a t eo nh y p e r t o n i cp d am e d i u m p r o t o p l a s tp r e p a r a t i o n a n d r e g e n e r a t i o n r a t ew a s6 2 8 a n d2 9 6 r e s p e c t i v e l y p r o t o p l a s tw a su s e d t o m u t a t i o nb yl a s e rt oa c q u i r eh i g h y i e l d i n gs t r a i n a l a n i n er a c e m a s eg e n ef r a g m e n to ff u s a r i u m4 2 1 5 0 2o fw a sc l o n e db yt w or o u n d p c ru s i n gn e s t e dp r i m e r sa n dc o n f i r m e dt h a tt h eg e n ei sh i g h l yh o m o l o g o u sw i t h t h a to ft o l y p o c l a d i u mi n f l a t u m k e y w o r d sc y c l o s p o r i na f u s a r i u ms o l a n i t o l y p o c l a d i u mi n f l a t u m 1 8 s r d n a m o l e c u l a rm a r k e r p r o t o p l a s t a l a n i n er a c e m a s e i i i 中文文摘 环孢菌素为环状十一肽 已发现有2 5 种天然产生的同系物 分别为a i k z 环孢菌素a 是一类重要的器官移植抗排斥药 能产生环孢菌素的真菌 包括有十几种 个别种只能产生环孢菌素c 工业上用于生产环孢菌素a 的 菌种主要有三种 雪白白僵菌 茄病镰刀菌和光泽柱孢菌 对产环孢菌素雪 白白白僵菌研究表明环孢菌素合成主要有两个酶参与 限速酶一真核生物的丙 氨酸消旋酶以及生物合成关键酶大分子量多酶多肽环孢菌素a 合成酶 本研究的目的在于选育高产环孢菌素的镰刀菌菌株 提高这种产生重要 免疫抑制剂工业菌株的经济效益 进一步研究高产菌株的遗传特性 了解镰 刀菌环孢菌素生物合成机制以及低产和高产菌株遗传特性的差异 利用1 8 s r d n a 分子标记进一步明确菌株4 2 1 5 0 2 的分类学位置 确定丝状真菌原生质 体制备率和再生率的计算方法 提高镰刀菌4 2 1 5 0 2 原生质体的制备率和再生 率 初步研究激光诱变对镰刀菌4 2 1 5 0 2 的诱变效果 建立快速筛选高产菌株 的方法 利用h p l c 法测定稳定高产菌株的效价 克隆镰刀菌4 2 1 5 0 2 环孢菌 素生物合成关键酶基因及其高产遗传特性 一 方法 1 提取产环孢菌素镰刀菌4 2 1 5 0 2 的基因组d n a 利用实验室真菌1 8 s r d n a 通用引物 上游引物5 c q 诅c c t g 研盯q 虹c c t g c c a g t a 3 和下游 引物5 c c t t g t f a c g a c t r c a c c t r c c t c t 3 通过p c r 扩增菌株4 2 1 5 0 2 的 1 8 sr d n a 片段 连接到p m d l 8 tv e c t o r 上 转化e c o l id h 5 a 转化菌验证 后以m 1 3 引物测序 测序结果登录g e n b a n k 获得 g e n b a n ka c c e s s i o nn o e f 3 9 7 9 4 4 利用c l u s t a l x l 8 1 软件与其它菌株1 8 sr d n a 进行多重比对 采用 邻位相连 n e i g h b o r j o i n i n g 算法 经c o n s e n s u s 程序计算多数一致树 构建距 离进化树并进行聚类分析 2 新鲜f u a s r i u ms p n o 4 2 1 5 0 2 斜面孢子 2 8 2 2 0r p m 培养1 2 1 6 h 至 孢子萌发 收集幼嫩菌丝体 p b s 离心洗涤两次 取5 m l 纯净的菌丝液 以 0 7 m o l lk c i 作为渗透压稳定剂 用浓度为2 0m g m l 的蜗牛酶5 m l 3 0 8 0 r p m 震荡处理菌丝体 分别于2 h 4 h 6 h 取样观察酶解情况 3 5 0 0 r p m 离心 8 m i n 收集原生质体沉淀 用等量高渗溶液分散原生质体 灭菌脱脂棉过滤菌 丝体碎片 取滤液样品计数原生质体浓度 第一组为未经酶处理的总菌落数 将酶解前的镰刀菌培养液l m l 用无菌 水稀释1 0 0 0 倍 第二组为经酶处理后的菌落数 将制备的原生质体l m l 用无 菌水稀释1 0 0 0 倍 使原生质体破裂 分别取第一组和第二组菌液按1 0 0l a1 皿涂布于普通培养基 第三组为再生培养基上的总菌落数 将制备的原生质 v 中文文摘 体l m l 用0 7 m o l lk c i 稀释1 0 0 0 倍 取菌液按1 0 0l al l m 涂布于再生培养基 然后分别于2 8 恒温培养5 d 统计各组长出的菌落数分别记为a b c 计 算原生质体制备率和再生率 3 将制备的f u a s r i u ms p n o 4 2 1 5 0 2 原生质体利用激光诱变 结合筛选抗 药性 抗自身代谢产物 营养缺陷型菌株 筛选环孢菌素高产菌株 利用黑 曲霉作为指示菌进行生测粗筛和复筛 挑取高产菌株保种 4 高产菌株稳定性 最佳发酵条件实验 l 9 4 3 葡萄糖 干酪素 淀粉 玉米粉四因素选三水平实验 正交设计优化培养基实验 h p l c 测定效 价 色谱柱 十八烷基硅烷键合反向柱 z o r b a xe c l i p s ex d b c 1 8 粒径5 um 规格4 6 2 5 0 舢 分析系统 安捷伦1 1 0 0 化学工作站 色谱条件 柱温3 0 c 流速1 o m l m i n 流动相 甲醇 水8 5 1 5 进样量 2 0 u l 检测波长2 1 4 n m 5 利用已知产环孢菌素雪白白僵菌丙氨酸消旋酶基因序列 设计引物 p c r 克隆产环孢菌素茄病镰刀菌4 2 1 5 0 2 丙氨酸消旋酶基因部分序列 进一步 提取m r n a 反转录成c d n a 再通过5 7r a c e 和37 r a c e 测定两端未知 序列 获得产环孢菌素茄病镰刀菌丙氨酸消旋酶基因全长序列 通过荧光定 量p c r 测定高产和低产菌株丙氨酸消旋酶基因拷贝数量的差异 二 结果 1 菌株4 2 1 5 0 2 的进化树与镰刀菌属 f u s a r i u ms p 的菌株在进化树上形 成一个大的聚类 且单独成枝 2 3 批次制备原生质体平均浓度为7 x 1 0 5 仙 原生质体形成率平均为 6 2 8 再生率平均为2 9 6 3 利用激光诱变筛选出一株高产菌株f u a s r i u ms p n o 4 2 1 5 0 2 1 4 经稳定性和发酵条件实验以及优化培养基实验 确定高产菌株 f u a s r i u ms p n o 4 2 1 5 0 2 1 的效价 5 测定出茄病镰刀菌4 2 1 5 0 2 丙氨酸消旋酶基因部分序列 三 结论 1 利用18 sr d n a 进化树聚类分析结合形态学鉴定 确定菌株4 2 1 5 0 2 为 镰刀菌属 2 中等浓度的蜗牛酶溶液适合于镰刀菌的原生质体制备 0 7 m o l lk c l 高渗p d a 再生培养基适合原生质体再生 3 梯度平板筛选抗药性菌株方法可行 可用于高产菌株筛选或遗传标记 但用于筛选抗自身代谢产物方法不可行 筛选营养缺陷型难度大 操作复杂 v i 难于短期内筛选到高产菌株 高产菌株有耐自身代谢产物的遗传特性 可利 用此特点进行高产菌株的保种工作 激光诱变比紫外诱变操作更简便 诱变 效果明显 适用于原生质体诱变 4 正交实验设计有利于减少实验量 适合优化高产菌株发酵培养基的配 方 5 茄病镰刀菌4 2 1 5 0 2 丙氨酸消旋酶基因与产环孢菌素雪白白白僵菌丙 氨酸消旋酶基因具有明显的同源性 关键词 1 8 sr d n a 分子标记 原生质体制备和再生 丙氨酸消旋酶 环 孢菌素a 茄病镰刀菌 雪白白僵菌 l 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 课题背景 茄病镰刀菌4 2 1 5 0 2 作为环孢菌素a 产生菌之一 是一种重要的工业微生物 目前工 业上茄病镰刀菌菌株效价经过多代诱变选育和培养基优化 若要继续提高效价 难度极大 西方国家对产生环孢菌素a 雪白白僵菌育种 生物合成机制和遗传特性研究较多 1 3 依 据传统分类学方法 根据形态和生理生化特征进行分类 常出现同种异名现象 对于其生 物合成的机制相关酶 环孢菌素合成酶和丙氨酸消旋酶有深入的研究 并有较多的报导 h z 3 而对本国筛选到的另一株产生菌茄病镰刀菌 对于育种方面研究较多 上海医药工 业研究院与杭州中美华东制药有限公司联合组成技术攻关小组 进行环孢菌素a 发酵工艺 的技术创新攻关 首先根据工厂目前生产中存在的技术问题在实验室进行研究 然后工厂 以实验室研究结果为基础和指导 结合工厂的生产经验进行中试放大 充分发挥上海医工 院的实验室研究优势和华东药厂的中试放大优势 经过近3 年的共同努力获得了环孢菌素 a 发酵新工艺 使环孢菌素a 发酵单位和发酵指数分别在20 吨发酵罐的生产规模平均提 高9 6 6 最高提高1 1 5 以上 和1 5 9 技术水平居国内领先 接近国际水平 驯 但 其遗传特性 合成环孢菌素a 的机理研究均未见报导 其分类也仅为初步鉴定 2 5 1 希望通 过我们的研究 进一步明确高产菌株镰刀菌4 2 1 5 0 2 的分类学位置和遗传特性 进一步阐 明环孢菌素合成机理 指导高产菌株的选育工作或通过基因工程手段改造菌株 1 1 1 环孢菌素a 简介 环孢素是疏水环状十一肽家族 具有显著多种生物学活性谱 此类发现的第一个成员 是环孢菌素a c s a 结构见图1 迄今为止 已从天然来源分离出3 0 个该家族成员 此外 紧密相关的类似物 命名为s d z2 1 4 2 0 3 也从天然来源中分离出来 取代肽键结 合内酯功能团 具有相似的生物学特性 环孢菌素a 的化学结构为环寡肽 是一种亲脂性 的1 1 环肽 白色粉末状 理化性质稳定 是由一种真菌产生的具有生理活性的代谢产物 环孢菌素是一种强效临床重要免疫抑制药物 商品名 s a n d i m m 吖 由真菌雪白白僵菌 t o l y p o c l a d i u mn i v e u m 产生 二十世纪七十年代后期引入临床使用 以降低器官移植后移植 物排斥作用 作为一种来源于zn e u m 代谢产物的环状十一肽 该药物干扰淋巴因子的生 物合成因而具有免疫抑制活性 其特点是选择性作用于免疫活性细胞的亚群 最近 很清 楚环孢菌素同时是h i v 1 复制的抑制剂 免疫抑制和抗病毒活性是环孢菌素两种不同的功 能 但两种功能都需要药物与亲环孢素蛋白的相互作用 环孢菌素a 是一种理想的抗排斥 药物 用于肾脏 肝脏和心脏等移植手术的免疫抑制治疗 在器官移植过程中 由于它抑 制了人体免疫系统的排外性 使器官移植手术成功率成倍地提高 它还可以用来治疗一些 自身免疫疾病 如红斑狼疮 类风湿性关节炎 特发性血小板减少性紫癜 溃疡性结肠炎 重症肌无力 慢性肾炎 慢性活动性肝炎和肾病综合症等多种自身免疫性疾病i 2 1 福建师范大学邓立新硕上学位论文 1 1 2 环孢菌素a 研究的发展史 1 9 5 9 年 英国阜家学院院士c a l n e 和e n k o k i 分别报道6 巯鸟嘌呤 6 m e r c a p t og u a n i n e 可以使狗移植肾存活时间延长 免疫抑制剂的发展由此开始 但是直到1 9 8 3 年 人们才 发现了在器官移植中第一个真正有选择性的免疫抑制剂一环孢菌素a c y c l o s p o r i n a c y a c y a 最早发现于1 9 6 9 1 9 7 0 年 瑞士山道士公司在巴塞尔微生物研究所进行抗真菌药 物筛选时 从土壤中分离得到两种真菌一光泽柱孢菌 砌加c 口印伽妣i d u m 和多孔木霉 t r i c o d e r m ap d 脚d 比m 后正名为雪白白僵菌 b e a u v e r ab a s s a 该菌经发酵后产生一种 具有抗丝孢菌属和酵母的窄谱抗真菌药物 即环孢菌素a 1 9 7 4 年进行了动物体内免疫活 性研究 1 9 7 5 年借助化学降解及x 射线分析 阐述了它的化学结构 1 9 7 7 年初步建立了 一个测定血清浓度的简便生物测定方法 改变了剂型 使血药浓度达到了满意的程度 1 9 7 8 年首次用于临床肾移植试验 p o w e l e s 等将它应用于人体器官移植实验中并获得成功 1 9 8 0 年实现全合成 1 9 8 3 年美国f d a 批准用于临床肾移植 1 1 3 产品剂型 自1 9 8 3 年f d a 批准山道士公司山地明应用于肾移植临床以来 环孢菌素a 成为免疫 抑制领域一个 重磅炸弹 式的药物 在过去的二十年间 其应用飞速发展 并一度达到 2 0 亿美元 年的销售额 2 0 0 3 年虽因受到r p m m p a 等药物冲击 销量有所下降 但仍达 到1 0 5 亿美元的惊人数字 而我国的免疫临床方兴未艾 环孢菌素a 的临床运用发展很快 去年 环孢菌素a 的国内销售达到5 亿人民币 而且仍以平均每年2 0 的速度增长 因此 提高环孢菌素a 的技术水平作为一种关键的竞争手段显得至关重要 国内环孢菌素a 生产 厂家的环孢菌素发酵单位和有效组分 c y a 含量普遍较低 约在1 5 0 0u m l 左右 有效组分 含量归一化在7 0 左右 而根据国外有关文献报道 用t o y p o c a d u m n 归a t u m 发酵生产环 孢菌素a 的发酵单位在1 9 9 4 年就达到了1 5 0 0l g m l 近年来 韩国 意大利等国家利用 各种手段优化发酵工艺 生产水平也有达到和超过3 0 0 0u 咖l 有效成分在8 5 以上的例子 更有报道称 韩国科技研究所利用t o y p o c a d u m n f a t u m 野生株进行原生质体融合 获得 依赖l 缬氨酸和i 厂亮氨酸的融合株 实验室水平达到8 9 2 0u m l 但所涉及的原材料 果 糖 l 广缬氨酸 l 亮氨酸等 均十分昂贵 在实际生产运用中极少采用 目前市场上常见的 环孢菌素a 产品及保健品的剂型是口服液和针剂 国内市场几乎全部由进口产品占领 国 内企业生产的药品只占据很小的市场分额 仅限于处方药在药房销售 l 1 4i 临床应用 真菌来源的环状十一肽环孢菌素a 最近被准予在临床移植上使用 肾 心 肝和骨 髓接受者试验令人鼓舞 肾脏和心脏接受者一年移植存活率为7 0 8 0 肝脏同种移植接受 者为6 0 6 5 在敏感移植物抗宿主反应疾病中 环孢菌素a 对治疗骨髓移植病人同样有 效 药物选择性抑制生长因子t 辅助细胞产生对b 细胞和细胞毒t 细胞分化和增殖必要的 生长因子 而允许扩充辅助t 细胞类群 药物吸收变化巨大 迫使控制药物水平和个体化 2 第1 章绪论 治疗 肾毒性是环孢菌素a 最经常的副反应 当伴随的免疫抑制作用被限制于低剂量的皮 质激素时 环孢菌素a 和细胞毒因子或抗淋巴细胞球蛋白结合使用 b 细胞淋巴瘤增加发 病率十分罕见 低起始剂量的环孢菌素a 接着以更快尖端变细的注射可能降低肾毒性的 发生率 而不影响改善移植成果 2 6 环孢菌素a 的使用给器官移植领域带来了巨大的变化 尤其从上世纪9 0 年代 无论 从数量上或质量上器官移植的发展都有了空前的变化 至目前为止我国已开展了2 5 种临 床用异体器官移植 成人器官移植1 6 种 胚胎器官移植9 种 在这些移植中肾移植处于 首位 1 9 6 0 1 9 9 3 年实施1 1 9 7 1 例 目前每年2 0 0 0 例以上 存活5 年以上1 1 5 0 例 1 0 年 以上2 0 2 例 最长达1 6 年 世界上最长达2 5 年 环孢菌素a 对自身免疫性疾病如类风湿关节炎 系统性红斑狼疮 牛皮癣 哮喘 再 生性贫血 皮肤肌炎 内源性葡萄膜炎及肾病综合症有效 对血吸虫病 疟疾有一定效果 还可以防止爱滋病的扩散 此外 对某些植物性疾病如苹果腐烂病等有效 1 9 7 0 年 发现雪白白僵菌产生的天然代谢产物环孢菌素a 具有极好的免疫抑制活性 能够控制器官移植但不敲除对所有感染的耐受性 美国外科医生n o r m a ns h u n w a y 利用环 孢菌素a 改变了心脏移植受体的 配型 由此 世界各地的医院利用环孢菌素a 重新 开始心脏移植手术 并提高了存活率瞄丌 环孢菌素a 是一种天然的亲脂性状环肽 由1 1 个氨基酸组成 是目前国外器官移植 普遍采用的最有效的第三代新型免疫抑制剂 其最大的优点在于它不仅能够抑制免疫系统 的排斥反应 有效地防治移植器官抗宿主病的发生 而且还能完好的保存整个免疫系统 防止感染 感染是移植手术的大敌 以前的免疫抑制剂往往使整个免疫系统都丧失作用 因此患者在接受手术后无法抵抗细菌的感染 从而导致移植手术的失败 甚至患者死亡 而环孢菌素a 的问世大大提高了移植手术的成功率 环孢菌素a 除用于器官移植外 还可以用于治疗自身免疫疾病 如重症肌无力 类风 湿性关节炎 全身性红斑狼疮 特发性血小板减少性紫癜 溃疡性结肠炎 慢性肾炎和肾 病综合症等多种自身免疫性疾病 环孢菌素a 在皮肤病领域中的临床使用已显示了广阔的应用前景 皮肤病很多都是由 真菌引起的 真菌细胞壁是由几丁质组成的 环孢菌素a 具有很强的抑制几丁质形成的生 物活性 所以环孢菌素a 可以治疗真菌性皮肤癣病 在皮肤病治疗领域中环孢菌素还可以 治疗牛皮癣 鱼鳞癣 持续性皮炎 接触性皮炎 斑秃和男性秃发等 在牛皮癣的治疗中 每同使用环孢菌素a 对牛皮癣有较好的治疗效果 斑秃形成的病理机制目前正在研究中 可能是由于自身免疫系统有问题造成的 每日口服少量的环孢菌素a 可获得毛发再生的 良好治疗效果 3 福建师范大学邓立新硕十学位论文 1 2 环孢菌素a 的化学 化学上 环孢菌素是由很大部分甲基化氨基酸组成的环状分子 环孢菌素的化学结构 见图1 h c c h h c h 拿h 2 h o 占i c h c h 3 l m e v a l n c h c a b u m e g l y l i l i m e l e u c h 0 m e l e u l i m e l e u d a l a a l a m e l e u v a l c 6 2 h 1 1 1 n 1 1 0 1 z m 0 1 w t 1 2 0 2 6 3 图1 环孢菌素a 的化学结构 引自1 2 田 f i g1t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo fc y c l o s p o r i n e a l s ok n o w na sc y c l o s p o r i na 1 2 1 环孢菌素a 的化学结构及理化性质 环孢菌素代表着一族具有生理活性的物质 它们是一组由1 1 个氨基酸残基组成的环 肽 除环孢菌素a 外还有b 1 除g 外所有的氨基酸都是自然界l 氨基酸的s 构型 有7 个是n 甲基化的 e i 除外 各组分间的主要区别在于分子中1 2 或1 1 位上的氨基酸的 差别 a b c 和d 第二位的氨基酸不同 e 和l 是a 和d 的单去甲基衍生物 f 是去氧 的a h 是a 的差向异构体 其第1 1 位上是n 甲基 d 缬氨酸 环孢菌素类的氨基酸组成 及化学结构见表1 环孢菌素a 的化学结构特征是 有3 个不常见的氨基酸 即1 位的氨基酸残基b r a t s 4 r 4 f e 2 丁烯基 4 一甲基一l 苏氨酸 在以前的多肽类抗生素分子中尚未发现过 其余的1 0 种氨基酸均为较常见的氨基酸 2 位的l 2 氨基丁酸和8 位的d 丙氨酸 除了8 位的氨基酸构型为r 外其余的均为s 构型 有7 个n 甲基的肽键和分子呈环状结构 其 分子量为1 2 0 2 由n m r 及m s 测定结果推断其分子式为c 6 2 h 1 1 1 n 1 l o l 2 应用电喷雾离子化质谱对9 个环孢菌素类化合物强酸水解后的产物进行分析 获得环 孢菌素类化合物一些组成氨基酸的特征分子离子峰 特别是1 位上特殊的氨基酸m e b m t 实验结果表明该方法在测定环孢菌素中的m c b m t 和其它组成氨基酸方面具有进样量少 快速 准确 无需对照品等优点 可用于环孢菌素类化合物的初步快速鉴别1 1j 4 第1 章绪论 表1 环孢菌素类的氨基酸组成 引宦l 2 9 1 1 璺垒 金 垒巴1 2 2 璺璺 垡呈2 盟仑2 呈型2 22 1g 里i 旦兰巳2 1 j q 兰 c s 1 23 45 6 78 91 1 c y a c y b c y c c y d c y e c y f c y g c y h c y l c y k c y l c y m c y n c y o c y p c y q c y r c y s c y t c y u c 9 c 9 c 9 c 9 c 9 固c 9 c 9 c 9 c 9 a b u a b u a b u 回 a b u 园 a b u a b u a b u 囤 a b u a b u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u 回 m e l e u 囤 m e l e u m e l e u 回 v a l v a l a l v m v a l v a l a l v r a l m e l e ua l a m e l e ua l a m e l e ua l a m e l e u a m e l e ua l a m e l e ua l a m e l e ua l a m e l e ua l a m e l e ua l a m e l e ua l a m e l e ua l a m e l e ua l a m e l e ua l a m e l e ua l a m e l e ua l a m e l e ua l a 幽a l a m e l e ua i a 吐l l i a l a m e l e u u l d a l a d a l a d 叫u a d a l a d a l a d 叫u a d 叫蛆a d u a d 叫u a d 叫吣a d 叫u a d a l a d a l a d 叫u a d a l a d a l a d u a d a l a d 枷a d a l a m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u m e l e u 圆 m e l e u m e l e u m e l e u 圆 m e l e u m e l e u m e l e u 圆 m e l e u m e l e u m e l e u m e v a l m e v h l m e v i i l 圆 m e v r a l m e v 矾 m e v j l l m e v 砒 m e v i l l m e v i l l m e v a l m e v r a l m e v a l m e v u m e v r a l m e v r a l m e v i l l m e v i i l c 9 m e b m t a b u l n a m i n o b u t y r i ca c i d n v a l n o r v a l i n e m c v a l n m e t h y l l v a l i n e m e l e u n m e t h y l l l e u c i n e 1 2 2 真菌中产生的环孢菌素和环孢菌素样多肽 1 9 7 6 年m d r e f u s s 等首次报导从多孔木霉t r i c h o d e r m ap o l y s p o r u m t a n kc xp e r s r i f a i 分离到两中抗真菌抗生素环孢菌素a 和c 除了1 7 个分类单位能产生环孢菌素a 及其天 然同系物b z 外 最近报导一些另外的和分类学不同的菌株产生单个新组分 1 1 1 r 2 l e u 5 l e u l o 环孢菌素 l l 和环孢菌素样内酯如s d z2 1 4 1 0 3 也就是 t h r 2 l e u s d h i v s l e u l 0 卜环孢 菌剥1 0 l 又报道了从桉树皮下组织h y p o d e r m ae u c a l y p t i ic o o k e h a r k n 分类为支顶孢属 a c r e m o n i u ml u z u l a e f u c k e l wg a m s 和l e p t o s t r o m aa n a m o r p h 分别分离出 t h r 2 k u s a l a l o 环孢菌素 3 0 1 和 t i l r 2 i l e 5 环孢菌素 3 1 1 在两个新的菌株中未发现通常的环孢菌素a z 模 式 2 和3 的结构测定依据核磁共振分光光度术并提供了生物学数据 免疫抑制活性 亲 环孢素蛋白结合亲和力和抗真菌效应 1 3 2 l 1 2 3 环孢菌素a 的理化性质 环孢菌素a 不溶于水而溶于一般有机溶剂如乙醇 甲醇 丙酮 微溶于石油醚 一般 情况下 环孢菌素a 是白色无定型粉末 在 1 5 的丙酮中可得到白色结晶 5 r r r r r r r r r r r r r r r r r f r r 白g g g g g g g 福建师范大学邓市新硕士学位论文 1 2 4 环孢菌素a 的分离纯化 环孢素是一种多肽类化合物 通过对突变株发酵液性质的研究 发现c y a 发酵液的单 位有3 0 左右在胞外 胞内只含7 0 左右c y a 单位 根据c y a 有多肽化合物的性质 选 用有针对性的絮凝剂沉淀单位 加溶媒提取沉淀物 发酵液加絮凝剂后 不仅提高了滤速 而且使滤液单位控制在6 0 u g m l 左右 从而过滤收率得到提高 使用针对性的溶媒提取菌 渣 使其能穿透细胞 同时对c v a 溶解度大 提取试验结果非常理想 收率均在9 5 以上 通过萃取与反萃提高抽提液质量 经过实验选择最佳萃取剂 使中间体c y a 含量由3 0 左右提高到7 0 左右 通过柱层析分离组分 柱层析载体的选择 洗脱剂的选择是分离组 分成功与否的关键 通过结晶方法 结晶溶剂的选择 确定了合理的结晶工艺路线 成品 纯度和结构得到确认 1 3 环孢菌素a 的药理及毒理学 1 3 1 免疫抑制活性及其作用机制 作为一种有效的免疫抑制剂 环孢菌素a 的主要特点是抑制作用的选择性 它主要作 用于t 细胞 抑制其增殖和分化 环孢菌素a 抑制t 细胞的活化 抑制t h 产生i l 2 i l 3 i f n y 等各种淋巴因子和i l 2 r 的表达 从而抑制了细胞毒t 细胞 t c 的产生 在药理剂 量下环孢菌素a d 对t 细胞的产生没有抑制作用 环孢菌素a 对b 细胞和巨噬细胞增殖 和功能没有直接的抑制作用 这一点对移植耐受性的形成很有意义 这些特点是环孢菌素 a 以前的任何免疫抑制剂所没有的 从而使免疫抑制剂的研究进入了一个新时代 称之为 环孢素时代 研究还发现环孢菌素a 抑制t 细胞活化的早期 即作用于细胞周期的g o g l 期的界面 阻止细胞进入g 1 期 环孢菌素a 能抑制植物血凝素 p h a c a 2 载体a 2 3 1 8 7 等引起细胞内 钙离子增加所诱导的淋巴细胞活化 而不抑制由佛波脂等直接活化蛋白激酶c 所诱导的淋 巴细胞活化 环孢菌素a 抑制i l 2 和i l 2 r 等的基因活化和m r n a 的转录 另外 还发 现环孢菌素a 能与淋巴细胞内的一种蛋白质分子结合 起到把环孢菌素a 摄取和浓缩到靶 细胞内的作用 这种蛋白质称为亲环孢素蛋i 兰t c y c l o p h i l i n c y p 其分子量为1 7 7 k d a 它 广泛的分布于胞浆和胞核内 含量丰富 c y p 具有顺反 肽酰一脯氨酰异构酶活性 其活性 受环孢菌素a 的抑制 因此以前认为该异构酶的活性与淋巴细胞的活性有关 己有的研究表明小分子免疫抑制剂联合使用时的疗效和毒性 即作用位点相同的药物 联合使用时对疗效具有拮抗作用 且毒性增加 重叠者为作用机制相同 而联合使用作用 机制不同的药物 则能够降低毒性和提高疗效 雷帕霉素与c y a 联合使用具有协同作用的原理是前者抑制由i l 2 的传导途径 后者 抑制1 1 2 的产生 由于两者的作用位点不同而产生协同作用 而雷帕霉素和f k 5 0 6 由于 结合蛋白都是f k b p 因此两者联合使用虽然作用位点不同 也仍然具有拮抗作用 6 第1 章绪论 1 3 2 亲环孢素蛋白质 亲环孢素蛋白质 e c 5 1 2 8 属于一群具有肽酰一脯氨酰顺 反异构酶活性的蛋白质 这些蛋白质统称为亲免疫因子并且同时包括f k 一5 0 6 结合蛋白质和微小菌素 在所有研究 的原核和真核生物体的所有细胞中 均发现有亲环孢素蛋白质 人类总共有1 6 个亲环孢 素蛋白质 a r a b i d o p s i s 超过2 9 个 酿酒酵母8 个 哺乳动物中鉴定到的亲环孢素蛋白质 的第一个成员 亲环孢素蛋白质a 是免疫抑制药物环孢菌素a 的主要细胞靶并因此调节其 作用 亲环孢素蛋白质a 与环孢菌素a 和钙 调钙蛋白 活化丝 苏氨酸 特异性蛋白质磷酸 酶 钙调磷蛋白磷酸酶形成三元复合物 此复合物的形成阻止钙调磷蛋白磷酸酶调节细胞 因子基因转录 最近的研究表明亲环孢素蛋白质不同配置的额外的细胞功能 包括伴侣蛋 白和细胞信号过程的作用 3 引 c y p a 飞l 夕i 7 c s a 心1 1 c n b o 一 7 一 j 产 o o 叉 人 一f l i k 1 i c n a 一 图2 药物环孢菌素a c s a 人亲环孢素蛋m c y p a 和人钙调磷蛋白磷酸酶三元复合物结构 引自剐 f i g2t h es t r u c t u r eo ft h et e m a r yc o m p l e xb e 峨nt h ed r u gc y c l o s p o r i na c s a h u m a nc y c l o p h i l i na c y p a a n dh u m a nc a l c i n e u d n 依赖钙调蛋白的磷酸酯酶是亲环孢素蛋白和f k b p f k 5 0 6 复合物的共同的靶 虽然 c y c l o s p o r i na c s a 和f k 5 0 6 的直接受体不同 它们抑制细胞信号的相似机制表明它们 相关的亲环孢素蛋白与共同的靶相互作用 c y e l o p h i l i n c s a 复合物和f k b p f k 5 0 6 而不是 亲环孢素蛋白 f k b p f k b p 雷帕霉素 或f k b p 一5 0 6 b d 竞争性结合并抑制c a 2 和钙调 蛋白依赖磷酸酶 钙调磷蛋白磷酸酶 这些结果表明钙调神经磷酸酶参与与t 细胞受体相 互作用的共同步骤以及免疫球蛋白e 受体信号途径 并且亲环孢素蛋白和f k b p 分别介导 福建师范大学邓立新硕士学位论文 c s a 和f k 5 0 6 通过形成药物依赖的化合物并改变钙调磷蛋白磷酸酶 钙调节蛋白的活性 如图2 c s a c y p a 二元复合物位于钙调磷蛋白磷酸酶的催化亚基 c n g 与调节亚基 c n b 结合螺旋状臂中 其安置在疏水的凹槽与两个亚基均紧密接触 钙调磷蛋白磷酸酶所特有 但在其它磷酸酶中未发现的区域 并且此紧密接触产生相互作用的高度特异性 1 3 3 环孢菌素a 的毒理学 1 急性毒理给药后即可看到毒性反应 包括痉挛 呼吸过度 2 亚急性毒理未发现 3 致畸作用未发现 4 诱变性研究未发现诱变潜在性 1 3 4 环孢菌素a 的副作用 1 肾毒性 2 淋巴瘤的风险 3 其主要的副作用和并发症是高血压和高血脂症 其发病率均在6 0 左右 主要出现 在心脏移植病人和肾脏移植病人中 有相当数量的病人因而改用其它免疫抑制治疗或致移 植失败 1 4 环孢菌素a 产生菌育种研究进展 1 4 1 雪白白僵菌产生环孢菌素a 1 4 1 1 雪白白僵菌色素变异体与环孢菌素a 产量相关 1 9 9 0 年a a m i ot h 和a g a t h o ss n 分离了四种不同的产环孢菌素a 的雪白白僵菌菌落 类型 分别为白色 红色 橙色和形态学不同的小的茶色菌落 红色菌落环孢菌素a 的特 别产量是白色正常菌落的三倍 川 1 4 1 2 表氯醇处理提高雪白白僵菌环孢菌素a 产量 1 9 9 0 年a g a t h o ss n 和p a r c k hr 用0 1 5 m 表氯醇产环孢菌素a 的雪白白僵菌的分生孢 子 分离出菌株m 6 m 6 与亲本菌株有相似的生长速度 但孢子产量更多 整体环孢素产 量是亲本的数倍1 3 引 1 4 1 3 雪白白僵菌紫外诱变提高环孢菌素a 产量 m g h a r a v i r b a h r in a j a f i 和a k l o o b a n d i 利用紫外照射使雪白白僵菌 d s m9 1 5 诱 变获得高产菌株 通过沉没发酵完成半知菌t o l y p o c l a d i u mi n f l a t u m d s m9 1 5 的发酵 应 用化学和物理方法诱变增加诱变c y a 的生物合成 在此研究中 利用紫外 u 照射进行 诱变并制备了利用q 一氨基丁酸的营养缺陷型 其改变了细胞的代谢并增加了c y a 的合成 在发酵过程中使用的营养缺陷型表明有更高的c y a 产量 1 4 1 4 营养缺陷型回复突变提高环孢菌素a 的产量 a g a t h o s 等19 8 6 年成功利用zi n f l a f u ma t c c3 4 9 2 1 筛选营养缺陷型 接着回复突 变成原养型作为一方法增加环孢菌素a 的产量 第二代营养缺陷型丢失但保留增加产量 3 6 1 8 第1 章绪论 1 4 1 5 固定化细胞与雪白白僵菌环孢菌素a 产量关系 l e et h c h u ng t 和c h a n gy k 利用孢子形成 固定化方法应用于雪白白僵菌持续产生 环孢菌素a 提出有效的孢子形成 固定化方法真菌细胞培养修饰原有的固定化技术缩短孢 子形成的时间和步骤次数 该方法用于固定化灌注生物过程 i p b 雪白白僵菌持续产生环孢 菌素a 结果发现反应器中 发酵培养基中大量孢子原位诱捕进入新添加的硅藻土珠子并 此后发芽 形成新的固定化细胞 了7 1 1 4 1 6 氨基酸对雪白白僵菌环孢菌素a 生物合成的影响 在m 2 培养基中加入l 天冬酰胺 l 谷氨酸和d l 缬氨酸对真菌生长速率无明显影响 但对环孢菌素a 形成有明显影响 研究结果表明 无论在发酵开始或者在发酵8h 以后加 入这些氨基酸 都对环孢菌素a 的形成有促进作用 但在发酵开始时加入l 谷氨酸对环孢 菌素a 的形成有所抑制 加入d l 缬氨酸 在环孢菌素a 的形成过程中出现双峰现象 第 2 个峰很高 l e ej 和a g a t h o ss n1 9 9 1 年报导研究内生l 广缬氨酸的动力学与雪白白僵菌环孢菌素产 量的关系 以助于了解外源添加l 缬氨酸提高在合成培养基中免疫抑制剂环孢菌素a 的产 量效应 与有实质的生长相关未添加培养基中的环孢素a 产量相比较 在添加l 广缬氨酸培 养基中产生免疫抑制剂的稳定期延长 环孢菌素a 对i 广缬氨酸转换率在稳定期保持在o 2 7 gc y gl v a l i n e p 1 9 9 3 年继续报导l 缬氨酸效应与雪白白僵菌环孢菌素产量关系的算 术模型 提出了沉没真菌培养动力学 营养物质消耗 免疫抑制药物环孢菌素a 产生的算 术模型 特别强调实验观察到具有对环孢菌素a 明显刺激效应的l 缬氨酸 模型提供了改 进此重要免疫抑制剂产量的合理的新方式 删 c h u ng t 和a g a t h o ss n1 9 9 3 年提出固定化 细胞脉冲加入l 缬氨酸在环孢菌素a 生物合成过程的动力学应答 研究了在硅藻土固定化 真菌雪白白僵菌 生产环孢菌素a 过程 输送l 厂缬氨酸的策略 在1 0 8 h 和1 5 6 h 指数生长 期加入l 厂缬氨酸 固定化细胞环孢菌素a 产量显著提高达2 3 倍 4 1 1 1 4 1 7 培养基最优化与雪白白僵菌的环孢菌素a 的产量关系 k b a l a r a m a n 和n i s h am a t h e w1 9 9 5 年最优化培养基提高t o l y p o c l a d i u m v c r c f 2 1 n r r l n o 1 8 9 5 0 环孢素a 产量 含葡萄糖 8 干酪素酸解产物 3 麦牙浸膏 2 蛋 白胨 1 和d l q 氨基丁酸 o 5 培养基有助于最大产量 2