（神经生物学专业论文）dna的损伤和修复对多巴胺能神经元存亡的作用及其机制.pdf

a c k n o w l e d g e m e n t s t h ew o r kp r e s e n t e dh e r ew o u l dn o th a v eb e e np o s s i b l ew i t h o u tt h es u p p o r t ， a d v i c ea n dh e l po fm a n yp e o p l e f i r s ta n df o r e m o s t ，ia mv e r yg r a t e f u lt h a tm ya d v i s o r ，d r ，f e n g y a ns u n ， g a v em et h eo p p o r t u n i t yt ot a k ep a r ti nt h ep o s t d o c t o r a lt r a i n i n gi nh e rr e s e a r c h p r o g r a m 1 w o u l dl i k et ot h a n kh e rf o rp r o v i d i n gm ew i t ha p r o d u c t i v e a n d s t i m u l a t i n ge n v i r o n m e n ta n df o r h e rc o n s t a n t s u p p o r tt h r o u g h o u tt h i sp r o j e c t h e re n t h u s i a s ma n do p e n m i n d e d n e s sh a v em a d em yp o s t d o c t o r a lr e s e a r c ha n e x c i t i n ga n dd e l i g h t f u le x p e r i e n c e it h a n kdr x u e j u nl if o rs h a r i n gh e rp r i m a r yr e s e a r c hr e s u l t s 1w o u l da l s o l i k et oa c k n o w l e d g es c i e n t i f i cd i s c u s s i o nw i t h ，a n do c c a s i o n a la s s i s t a n c ef r o m ， m yc o l l a b o r a t o r so ns e v e r a lo ft h es t u d i e sd e s c r i b e dh e r e i n ：p r o f ，y u r t q i ng a o ， j i n gg u ，d i h a ns h e n ，d r j i a n h u tl i u ，d r m e t h o n gq i u ，s h a n z h e ny a n ga n d y a ow a n g t h i sr e s e a r c hh a sb e n e f i t e df r o mt h ee x c e l l e n tt e c h n i c a l s u p p o r t p r o v i d e db yl i n g m e tz h a n g ，y a l i nw a n g ，s h i d u ol ua n dy a n - l i u s i m i l a r t h a n k sa r ea l s od u et oa l lm e m b e r so ft h en a t i o n a lk e yl a b o r a t o r yo fm e d i c a l n e u r o b i o l o g y ，p a s t a n dp r e s e n t ，a n di n d e e d ，t o om a n yo t h e r sa tt h e s h a n g h a i m e d i c a lc o l l e g eo ff u d a nu n i v e r s i t y ia me t e r n a l l yg r a t e f u lf o rt h eu n y i e l d i n gl o v ea n ds u p p o r tm yf a m i l i e sh a v e s h o w n 箍e t h r o u g h o u tm yl i f e 1 w o u l d e s p e c i a l l y t i k et ot h a n km yw i f e m i n g f e n gj i nf o rh e rc o n s t a n ts u p p o r tt h r o u g h o u tm y s t u d i e s t h i sr e s e a r c hw a ss u p p o r t e db yg r a n t sf r o mt h en a t i o n a lk e yp r o j e c to f b a s i cs c i e n c er e s e a r c h ( g 1 9 9 9 0 5 4 0 0 7 ) ，n a t u r a ls c i e n c ef o u n d a t i o n ( 3 0 2 7 0 4 7 9 ) a n ds h a n g h a im e t r o p o l i t a nf u n df o rr e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n t ( 0 2 j c l 4 0 2 5a n d 0 4 d z l 4 0 0 5 ) 6 l i s to fa b b r e v i a t i o n s 8 o x o g 8 一h y d r o x y g u a n i n e b e rb a s ee x c i s i o nr e p a i r d a d o p a m i n e d a b 3 ，3 一d i a m i n o b e n z i d i n e t e t r a h y d r o c h l o r i d e d m e md u l b e c c o sm o d i f i e de a g l e sm e d i u m d m s o d i m e t h y ls u l p h o x i d e e c le n h a n c e dc h e m i l u m i n e s c e n c e e d t a e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d e r c c l e x c i s i o n r e p a i rc r o s sc o m p l e m e n t i n g1 e t ce l e c t r o nt r a n s p o r tc h a i n f b sf e t a lb o v i n es e r u m f i t cf l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e g s hr e d u c e dg l u t a t h i o n e j c 1 5 , 5 ，6 ，6i - t e t r a c h l o r o 1 ，1 ，3 ，3 - t e t r a e t h y l b e n z i m i d a z 0 1 0 c a r b o c y a n i n ei o d i d e k r h k e r e b s - - r i n g e r - h e p e s m a obm o n o a m i n eo x i d a s eb m p p + 1 - m e t h y l 一4 一p h e n y l p y r i d i n ei o n m p t p 1 - m e t h y l 4 一p h e n y l 一1 ，2 ，3 ，6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e m t d n am “o c h o n d r i a ld n a m t t 3 - ( 4 ，5 一d i m e t h y l t h i a z o l 一2 y 1 ) 一2 ，5 一d i p h e n y l t e t r a z o l i u n b r o m i d e n e rn u c l e o t i d ee x c i s i o nr e p a i r n 0n i t r i co x i d e o f r o x y g e n f r e er a d i c a l s o g g l8 - o x o gg l y c o s y l a s e p a p a r a f o r m a l d e h y d e p b s p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e p dp a r k i n s o n sd i s e a s e r n a s e ar i b o n u c l e a s ea r n sr e a c t i v en i t r o g e ns p e c i e s ； r o sr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s r tr o o m t e m p e r a t u r e s n cs u b s t a n t i an i g r ap a r sc o m p a c t a t h t y r o s i n eh y d r o x y l a s e 掣掰m i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a l 7 a b s t r a c t t h ep a t h o g e n e s i so fp a r k i n s o n sd i s e a s e ( p d ) r e m a i n so b s c u r e ，b u tt h e r ei s i n c r e a s i n g e v i d e n c et h a to x i d a t i v e d a m a g e t o d n a ，e s p e c i a l l y m i t o c h o n d r i a l d n a ，m a yp l a y a n i m p o r t a n t r o l ei n d o p a m i n e r g i cn e u r o d e g e n e r a t i o n i nt h e s u b s t a n t i a n i g r ap a r sc o m p a c t a ( s n c ) o fp a t i e n t s w i t h p d t h e r e f o r e ，t h e s u p p l e m e n t a t i o n w i t ha n t i o x i d a n t so r i m p r o v e m e n t o fd n a r e p a i ra c t i v i t y ， w h i c hp r e v e n to rr e d u c et h ee x c e s s i v ea c c u m u l a t i o no fd n ao x i d a t i v ed a m a g e ， m a y h o l d p a r t i c u l a rp r o m i s e a s p o w e r f u ln e u r o p r o t e c t i v et h e r a p i e s i nt h e t r e a t m e n to fp d i nt h e p r e s e n ts t u d y ，w ee v a l u a t e t h ee f f e c to fm e l a t o n i n ，a p o t e n t f r e er a d i c a l s c a v e n g e r a n d a n t i o x i d a n t ，o nm p t p m p p + i n d u c e d m i t o c h o n d r i a ld n ao x i d a t i v e d a m a g ei n v i v oa n di n v i t r o a l s o ，t h e r o l eo f e x c i s i o n r e p a i r c r o s s c o m p l e m e n t i n gi ( e r c c l ) o v e r e x p r e s s i o n ，w h i c h i sa n i m p o r t a n tn u c l e o t i d e se x c i s i o nr e p a i rf a c t o r ，o nm p p + 一i n d u c e dd n a o x i d a t i v e d a m a g ei si n v e s t i g a t e d r e s u l t ss h o w e da sf o l l o w s ： p a r thm e l a t o n i np r o t e c ta g a i n s tm p t p m p p + - i n d u c e dm i t o c h o n d r i a ld n a o x i d a t i v ed a m a g ei nv i v oa n di nv i t r o t h ee f f e c t so fm e l a t o n i no t lt h em i t o c h o n d r i a l d n a ( m t d n a ) d a m a g e i n d u c e d b y1 - m e t h y l - 4 - p h e n y l 一1 ，2 ，3 ，6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e ( m p t p ) a n d 1 - m e t h y l 一4 一p h e n y l p y r i d i n ei o n ( m p p + ) w e r ei n v e s t i g a t e d b o t hi nv i v oa n di n v i t r o m p t p ( 2 4m g k g ，s c ) i n d u c e dar a p i di n c r e a s ei nt h ei m m u n o r e a c t i v i t yo f 8 - b y d r o x y g u a n i n e ( 8 一o x o g ) ，ac o m m o n b i o m a r k e ro fd n ao x i d a t i v ed a m a g e ，i n t h ec y t o p l a s mo fn e u r o n si nt h es n co fm o u s eb r a i n m e l a t o n i np r e i n j e c t i o n ( 1 5 o r3 0m g k g ，i p ) d o s e d e p e n d e n t l y p r e v e n t e dm p t p i n d u c e dd n a o x i d a t i v e d a m a g e i ns h s y 5 yc e l l s ，m p p + ( 1m m ) i n c r e a s e dt h e i m m u n o r e a c t i v i t yo f 8 - o x o gi nt h em i t o c h o n d r i aa t1h ra n di nt h en u c l e u sa t3h ra f t e rt r e a t m e n t m e l a t o n i n ( 2 0 0 1 x m ) p r e i n c u b a t i o nc o u l ds i g n i f i c a n t l y a t t e n u a t em p p + - i n d u c e d m i t o c h o n d r i a ld n ao x i d a t i v e d a m a g e f u r t h e r m o r e ，m p p + t i m e - d e p e n d e n t l y i n c r e a s e dt h ea c c u m u l a t i o no fm i t o c h o n d r i a lo x y g e nf r e er a d i c a l s ( o f r ) f r o m1 t o2 4h ra n dg r a d u a l l yd e c r e a s e dt h em i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a l ( 即砂 f r o m1 8t o3 6h ra f t e ri n c u b a t i o n a t7 2h ra f t e ri n c u b a t i o n ，m p p + c a u s e da b o u t 4 9 c e l ld e a t h h o w e v e r m e l a t o n i nc o u l d p r e v e n t m p p + 一i n d u c e do f r g e n e r a t i o na n dp mc o l l a p s e a n dl a t e rc e l ld e a t h t h ep r e s e n tr e s u l t ss u g g e s tt h a t c y t o p r o t e c t i o n o fm e l a t o n i n a g a i n s t m p t p m p p + 一i n d u c e dc e l ld e a t h m a y r a s s o c i a t ew i t ht h ea t t e n u a t i o no fm i t o c h o n d r i a id n ao x i d a t i v e d a m a g e v i a i n h i b i t i n gm i t o c h o n d r i a lo f rg e n e r a t x o na n dt h ep r e v e n t i o no ff 脚c o l l a p s e k e yw o r d s ：m e l a t o n i n ，m i t o c h o n d r i ad n a o x i d a t i v ed a m a g e ，8 - h y d r o x y g u a n i n e ， 1 - m e t h y l 一4 一p h e n y l 1 ，2 ，3 ，6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e ，l - m e t h y l - 4 - p h e n y l p y r i d i n ei o n ， m i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a l ，m i t o c h o n d r i a lo x y g e nf r e er a d i c a l s p a r ti i ：o v e r e x p r e s s i o no fe r c c l p r o t e c t sa g a i n s tm p p + - i n d u c eo x i d a t i v e d n a d a m a g e i nv i t r o i nt h e p r e s e n t s t u d y ，t h e r o l eo fe r c c l o v e r e x d r e s s i o no n 1 - m e t h y l 4 - p h e n y l p y r i d i n i u m ( m p p + ) 一i n d u c e o x i d a t i v ed n a d a m a g e a n dc e l l a p o p t o s i s w a s i n v e s t i g a t e d i np c i 2c e l l s o x i d a t i v ed n ad a m a g e a n dt h e e x p r e s s i o no fe r c c lp r o t e i nw e r ed e t e r m i n e db yi m m u n o s t a i n i n g t h er e s u l t s s h o w e dt h a ta d m i n i s t r a t i o no fm p p + i nt h ec u l t u r em e d i u m a tt h ef i n a l c o n c e n t r a t i o no f1m mc o u l d t i m e d e p e n d e n t l ye l e v a t et h ea m o u n t so fe r c c l e x p r e s s i o na n d8 - h y d r o x y g u a n i n e ( 8 一o x o g ) ，ac o m m o n e s to x i d i z e db a s e ，i nt h e c e l l s f u r t h e r m o r e ，w e e s t a b l i s h e dp c i 2c e l ll i n e s s t a b l ye x p r e s s i n g h u m a n e r c c lt o i n v e s t i g a t e t h er o l eo fe r c c lo v e r p r o d u c t i o ni n m p p + 一i n d u c e d c y t o t o x i c i t y o x i d a t i v ed n ad a m a g ew a st i m e d e p e n d e n t l yi n c r e a s e di nc o n t r o l c e l l sf r o m6t o4 8h ra f t e rm p p + e x p o s u r e ( p 4 o 、t oa g e n e o nt h es h o r ta r mo fc h r o m o s o m e1 ( 1 p 3 5 - p 3 6 ) ( 8 2 ) t h em a i nf e a t u r e so ft h e s ep a t i e n t sa r es l o wp r o g r e s s i o na n da g o o dr e s p o n s et ol e v o d o p a ，b u tw i t hf r e q u e n td r u g i n d u c e dd y s k i n e s i a ss i m i l a rt o t h o s ei np a r k 2c a s e s p a r k 7 ( d j - 1 ) p a r k 7i sl i n k e dt oa g e n e t i c a l l yi s o l a t e dp o p u l a t i o ni nt h es o u t h w e s to ft h e n e t h e r l a n d s ( 1 a t e rc o n f i r m e di n a ni t a l i a nf a m i l y ) ，a n dp r e s e n t sw i t he a r l y o n s e t a u t o s o m a l r e c e s s i v e p a r k i n s o n i s m ( 8 3 8 5 ) f u r t h e rs t u d y h a si d e n t i f i e da h o m o z y g o u sp o i n tm u t a t i o n ( tt o ct r a n s i t i o na t p o s i t i o n4 9 7r e s u l t i n gi n t h e s u b s t i t u t i o no fl e u c i n e b yp r o l i n ea tp o s i t i o n1 6 6 ) c l i n i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f 1 r d j ，l p a r k i n s o n i s m i n c l u d eas l o w p r o g r e s s i o n w i t hs u s t a i n e d r e s p o n s e t o l e v o d o p a ( 8 6 ，8 7 ) p a r k 8 t h ep a r k 8l o c u sh a sb e e nl i n k e dt oc h r o m o s o m e1 2 p 1 1 2 - q 1 3 1i nal a r g e j a p a n e s e f a m i l y w i t ha u t o s o m a ld o m i n a n t p a r k i n s o n i s m ( 8 8 ) t h e c l i n i c a l f e a t u r e sa r et y p i c a lo fi d i o p a t h i cp d ，i n c l u d i n gar e s p o n s et ol e v o d o p a ；h o w e v e r ， t h em e a na g ea to n s e ti s s l i g h t l yy o u n g e rt h a n i nt h em o r ec o m m o nf o r m so f d i s e a s e ，w i t ha na v e r a g ea g eo fo n s e to f5 1y e a r s ac o m m o nd i s e a s eh a p l o t y p e w a sf o u n da m o n ga l l1 5a f f e c t e di n d i v i d u a l si nt h e f a m i l y h o w e v e r e i g h t u n a f f e c t e df a m i l ym e m b e r sh a da l s oi n h e r i t e dt h ed i s e a s eh a p l o t y p e ，s u g g e s t i n g ad i s e a s em u t a t i o nw i t hl o w e r p e n e t r a n c e t h a t m i g h t b em e d i a t e d b y o t h e r g e n e t i co re n v i r o n m e n t a lf a c t o r s a u t o p s yr e p o r t so ff o u ra f f e c t e di n d i v i d u a l si n t h ef a m i l ys h o w e d “p u r en i g r a ld e g e n e r a t i o n ，a l t h o u g hl e w yb o d i e sw e r en o t o b s e r v e d ( 8 8 ) p a r k9 p a r k9i sl i n k e dt ok u f o r r a k e bs y n d r o m e ( a ne a r l y o n s e ta u t o s o m a l r e c e s s i v e t r a i to fa n i g r o s t r i a t a l p a l l i d a l p y r a m i d a ln e u f o d e g e n e r a t i o nd i s o r d e r ) o f f c h r o m o s o m e1 p 3 6 ( 8 9 ) i tw a s i n i t i a l l yt h o u g h tt o r e s e m b l ec l a s s i c a lp dw i t ha g o o dr e s p o n s e t o l e v o d o p a h o w e v e r t h e a d d i t i o n a lc l i n i c a lf e a t u r e so f s p a s t i c i t y ，d e m e n t i a a n d s u p r a n u c l e a rg a z ep a r a l y s i s d i f f e r e n t i a t e di tf r o m c l a s s i c a lp d b r a i ns c a n ss h o w e da t r o p h yo ft h e g l o b u sp a l l i d u sa n dp y r a m i d s a n d ，l a t e ri nt h ed i s e a s ep r o g r e s s i o n ，w i d e s p r e a dc e r e b r a la t r o p h y ( 8 9 ) p a r k l o p a r k l 0i sa s s o c i a t e dw i t hl a t e o n s e tp d ，t h ec l i n i c a lf e a t u r e so fw h i c ha r e s i m i l a rt os p o r a d i cp d ( 9 0 ) o ft h e11 7i n d i v i d u a l ss t u d i e di nac r o s s m a t c h e d n a t i o n w i d e g e n e a l o g y d a t a b a s eo fi c e l a n d i c p a t i e n t s w i t h p d ，8 4 h a v e d i s e a s e o n s e ta f t e r 5 0 y e a r s o f a g e ( m e a na g e a to n s e t = 6 5 ：8 y e a r s ) s i g n i f i c a n tl i n k a g eh a sb e e nc o n f i r m e do nc h r o m o s o m el p 3 2f o rah a p l o t y p eo f 7 6c mi nag r o u po ff a m i l i e s n op a t h o l o g yh a sb e e nr e p o r t e d n r 4 a 2 n r 4 a 2i sam e m b e ro fan u c l e a r r e c e p t o rs u p e r f a m i l yr e q u i r e d f o r t h e 1 9 d i f f e r e n t i a t i o na n dm a i n t e n a n c eo fn i g r a ld o p a m i n e r g i cn e u r o n s c a r m i n ee ta 1 r e c e n t l yr e p o r t e dt w om u t a t i o n s ( 一2 9 1 t d e la n d 一2 4 5 t g ) i nt h ef i r s te x o no f n r 4 a 2i na u t o s o m a l d o m i n a n tf a m i l i a lp d ( 9 1 ) t h em u t a t i o n si nn r 4 a 2i np d s e e mt ob ev e r yr a r ea n dp o p u l a t i o nr e s t r i c t e d ( 9 2 9 5 ) p h e n o t y p e so fp a t i e n t s w i t hm u t a t i o n si nt h en r 4 a 2g e n ea r ei d e n t i c a lt ot h o s eo fl a t e o n s e tp d n o p a t h o l o g i c a ld a t aa r ec u r r e n t l ya v a i l a b l e p i n k l t h ep i n k lg e n ec o n t a i n se i g h te x o n ss p a n n i n g - 1 8k i l o b a s e sa n d e n c o d e sa 5 8 1 a m i n oa c i d p r o t e i n t h et r a n s c r i p t i s u b i q u i t o u s l ye x p r e s s e d a n di s p r e d i c t e dt oe n c o d ea 3 4 一a m i n oa c i dm i t o c h o n d r i a lt a r g e t i n gm o t i f ( t h ec l e a v a g e s i t ef o rt h em i t o c h o n d r i a lp r o c e s s i n gp e p t i d a s eb e t w e e nr e s i d u e s3 4a n d3 5 ) a n d ah i g h l yc o n s e r v e dp r o t e i nk i n a s ed o m a i n ( r e s i d u e s1 5 6t o5 0 9 ) t h a ts h o w sh i g h d e g r e e o fh o m o l o g yt ot h es e r i n e t h r e o n i n ek i n a s e so ft h ec a 2 + c a l m o d u l i n f a m i l y ( 9 6 ) v e r yr e c e n t l y ，v a l e n t ea n dc o l l e a g u e si d e n t i f i e dt w oh o m o z y g o u s m u t a t i o n sa f f e c t i n gt h ep i n k lk i n a s ed o m a i ni nt h r e ec o n s a n g u i n e o u sp a r k 6 f a m i l i e s ：at r u n c a t i n gn o n s e n s em u t a t i o na n dam i s s e n s em u t a t i o na ta h i g h l y c o n s e r v e da m i n oa c i d ( 9 7 ) c e l lc u l t u r e s t u d i e s s u g g e s t t h a tp i n k li s m i t o c h o n d r i a l l yl o c a t e da n dm a ye x e r tap r o t e c t i v ee f f e c to nt h ec e l l t h a ti s a b r o g a t e db yt h em u t a t i o n s ，r e s u l t i n gi ni n c r e a s e ds u s c e p t i b i l i t yt oc e l l u l a rs t r e s s t h e s ed a t a p r o v i d ea d i r e c tm o l e c u l a rl i n kb e t w e e nm i t o c h o n d r i aa n dt h e p a t h o g e n e s i so fp d s u m m a r y i nt h e p a s t 2 0 y e a r s t w o d i s c o v e r i e sh a v e p r o f o u n d l y i n f l u e n c e do u r u n d e r s t a n d i n go fp dp a t h o g e n e s i s ，p r o v i d e dac o n c e p t u a lf r a m e w o r kf o rn o v e l t h e r a p i e s ，a n ds p a w n e da na c c e l e r a t i n gr e s e a r c he f f o r t f i r s t ，t h ed i s c o v e r yo f m p t p i n d u c e dp da n ds u b s e q u e n tr e s e a r c he x p l o r i n gt h em o l e c u l a rb a s i so f m p t p i n d u c e d n e u r o d e g e n e r a f i o n e s t a b l i s h e d r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n m i t o c h o n d r i a lf u n c t i o n ，o x i d a t i v es t r e s s ，a n ds p o r a d i cp d s e c o n d ，t h ed i s c o v e r y o fg e n e t i cc a u s e so ff a m i l i a lp da n dt h ed e m o n s t r a t i o nt h a td y s f u n c t i o no ft h e s e g e n e sp r o b a b l yp l a y sar o l ei ns p o r a d i cp dh a sh i g h l i g h t e dt h ei m p o r t a n c eo f p r o t e i nm i s f o l d i n g r e l a t e dt o x i c i t ya sf u n d a m e n t a li n s u l ti nn e u r o d e g e n e r a t i o n a l t h o u g ht h el i n ko fo x i d a t i v es t r e s s o rm i t o c h o n d r i a ld y s f u n c t i o nw i t ht h e k n o w nm u t a t i o n si nf a m i l i a l - l i n k e dp dr e m a i n su n c l e a r ，i ti sc o n c e i v a b l et h a tt h e 2 n o x i d a t i v es t r e s sg e n e r a t e db yc h r o n i cc o m p l e xii n h i b i t i o ni ns p o r a d i cp ds t r e s sc o u l dl e a dt o d n