（生物医学工程专业论文）羧甲基壳聚糖的制备及其生物学评价.pdf

天律医科大学硕士学位论文 摘要 壳聚糖及其衍生物是一类新型的生物多糖，它们在农业、工业、医药等领 域都有广泛用途，在过去的十年中，这类材料成为医学界关注的热点。其中一 种水溶性衍生物一羧甲基壳聚糖( c m c ) 的研究较早，也是最引人注目的课题 之一。本论文目的在于通过实验摸索确定三种不同取代位置的c m c ( n ，o c 犯， n c m c ，o c m c ) 的制备工艺的并对这三种c m c 进行生物学评价。 本论文利用氯乙酸和壳聚糖在碱性条件下可得到n ，o c m c ；采用乙醛酸为 羧甲基化试剂，经硼氢化钠还原就可得到n c m c ；用甲壳素为原料，利用氯乙 酸先进行羧甲基化，再进行脱乙酰化反应产物即为o _ c 眦。制备过程中从黏度 和羧甲基取代度两个角度对反应物质的量、反应温度、反应时间等影响因素进 行定量的单因素研究和讨论，并从羧化度( d s ) 、黏均分子量、红外( i r ) 光 谱等方面对产物c m c 进行了分析和表征，从而得到了它们的制各条件、工艺过 程、及产物结构性能之间的关系： n ，0 一c m c 制各的工艺过程：壳聚糖5 9 ，异丙醇壳聚糖( v w ) = 7 5 ： 1 ，l o m 0 1 l n a o h 溶液6 2 5 m 1 在一1 0 碱化1 2 h ，氯乙酸壳聚糖( m m ) = 6 ： 1 ，反应温度为6 0 ，羧甲基化时间为5 h 。 n c m c 制备的工艺过程：壳聚糖1 9 ，加入1 5 0 m l 蒸馏水中分散均匀后， 乙醛酸壳聚糖( m m ) = 1 2 ：1 ，常温( 2 0 4 0 ) 反应2 h ，调节体系p h 值为8 1 0 ，分批加入1 0 硼氢化钠l o m l 常温( 2 0 4 0 ) 反应2 h 。 o c m c 制备的工艺过程：甲壳素5 9 ，异丙醇5 0 m l ，5 0 n a o h 3 0 m l 一1 0 碱 化1 2 h ，氯乙酸甲壳素( m m ) = 4 5 ：1 ，在5 0 反应4 h ，脱乙酰化在9 0 下反应1 5 h ，反应时加入少量硼氢化钠 在c m c 的纯化过程中比较了磁力搅拌洗涤法和超声洗涤的清洗效果，发现 超声清洗效果佳，清洗六次后c m c 中氯离子含量小于万分之一。本实验中用黏 度法测量c m c 的特性粘度，还将传统的逐步稀释法和一点法进行了比较，发现所 测的特性粘度误差均在5 ，所以一点法可以代替逐步稀释法测量c m c 的特性粘 墨苎垦型查兰堡主兰垡丝苎 度，从而大大减小了工作量。在用胶体滴定法测量c m c 的d s 时，本实验对影响 滴定的因素进行了分析，发现测定时ph 值一定要在能使c m c 充分解离成离 子的ph 范围内进行，滴定速度以0 0 2 m l s 左右为宜，c m c 的测定浓度在 o 0 1 0 0 2 ( w ) 左右。三种c m c 等电点在3 5 5 o 附近，在偏离其等电点的 溶液中均可形成具有乳光的胶体溶液，它们在p h 值大于6 5 的情况下有良好 的溶解性能。 生物学评价试验包括细胞毒性试验和溶血试验。细胞毒性试验采用细胞增 殖度法用材料溶液培养l 9 2 9 细胞，观察其对细胞生长、增殖的影响，测定加 样后2 、4 、7 d 的0 d 值，计算r g r ，评定细胞毒性等级；溶血试验：采用溶 血率法评价材料的溶血性能，取新鲜兔血与材料直接接触，测定溶血率。 毒性试验结果发现：经纯化的壳聚糖和三种c m c 的细胞毒性均为o 级或l 级，符合医疗用途的技术要求。材料溶液浓度越大，细胞毒性越大，壳聚糖的 三种羧甲基化产物中，n c m c 和n ，o c m c 的细胞毒性比壳聚糖小，o _ c m c 的细 胞毒性最大。 溶血试验结果发现：壳聚糖和三种c m c 的溶血率均小于5 ，符合医疗用 途的技术要求。n 弋m c 的溶血率最小，沪c m c 的最大，这结果与细胞毒性试验 一致。 经体外细胞毒性试验和溶血试验可知：经初步检验，可认为壳聚糖的羧甲 基化衍生物具有良好的生物相容性，为以后更深一步的研究提供了科研基础和 实验依据。 关键词：壳聚糖，羧甲基壳聚糖，羧甲基取代度，生物学评价，细胞增殖度，胶体 滴定，细胞毒性，溶血 丕兰堡型查堂雯圭兰些堡苎 a b s t r a c t c h i t o s a nm di t sd e r i v a t i v e s 盯ean g wt y p eo f b i o 一锄y l o s e ，w k c ha r ew i d c l y u s e di nm e 丘d d so f a 鲥c 1 1 l t l l r e ，i n d u 8 虹ya n dm e d i d n e 咖i nt h ep a s t1 0y e a r s ， t t l i sk i n do f 瑚a t 硎a l sh 髂b e e d a i dm o r ea n dm o r ea l t c 嘣i o n si nn l em e d i c i n e o n e o f i t sd e r i v a t i v e s ，c a r b o x y m e t h y lc h i t o s 眦( c m c ) ，h a sb e e n 瑚c a r c h 。dm u c he 盯1 i c r 锄di sa i s oo n eo f t l l em o s t 撇t e dr e s e a r c hf i e l ds t h ep u r p o s e so f m i sp 印e ra f e t oc o n f i 彻脚嘲t i o nt 幽i c so fc 盯b o x y ls u b s t i t t l 埘c m co n 也r e ed i 脓肌t p o s i t i o n s ，她dm a k eb i 0 1 0 西c a le v a l u a t i o n n ，o c a f b o x y t n e t h y lc h i t o s 蛆( n ，o c m c ) w a sp r 印盯e dw 胁c h l o r o a c e t i ca c i d a n dc h i t o s 蚰i na l k a l i n ec o n d 诟o n n - c a r b o x 蛐e n l y l 洲t o s a i l ( n c m c ) w 鹋 p 唧肿db y “v os t 印s ：_ 丘r s n y ，c h i 幻s a l l 士e a c 矧谢t 1 1g l y o x y l j c8 d d ，t l l c i l ， d e o x i d i z e db vs o d i 啪b o r o h v d r i d e c h i t i i lw a sm o d i f i e dw i mc l l l o r o a c e t i ca c i di n m ep r c s e n c eo f s o d i 啪h y d r o x i d e ，t h ep r o d u c t i o nw 船c a r b o x y i i l e i l l y lc h i t i 芏l ，w ec 姐 g e to - c m ca f 【盯c 曲o x y i i l 甜l y lc h i t i nw a sd e a c e t y l a t c d t h em o r s ，s c h 器也e 聊o u m so fr e a c t a n t ，t l l ev o l u m e so fi s o p r o p y la l c o h o l ， r c a e 蛀o nt 舶叩e r 砒m e ，r e a 商o nt i m ee t c 。，i n f l u e l l c i n gt h ey i e l d ，d e 蓼e eo f s u b s t i 抛d o n ( d s ) a n di n 伍n s i cv i s s i t yw e r er e s p e c t i v e l yi n v e s t i g a t e d t h ec m cp r o d u c t sw e r e c h a m c t 耐z e df o rd s ，a v e r a g cm o l e c u l a rw e i g i l t ，ms p e c 胁s o o p y ，e t c ，r e s p e c t i v e l y a tl 龉t ，t h ep r 印a r a t i o nc o n d i t i o n so f n ，o - c m cw 盱eo b t a i n e d 髂：t l l e 锄o u n t o fc h i t o s a n5g ，i s o p r o p y la l c o h 0 1 c h i t o s a n ( v o h 珊e n a s s 产7 5 ：1 ，1 0 i n o l ls o d i 砌 h y d r o x i d es 0 1 u t i o n6 2 5 m l ，b a s m e dt i m e1 2h o u r s ，b a s i 矗e dt 锄p e r a t u r e 1 0 ， c m o r o a c e t i ca c i d c h i t o s a i l ( m 0 1 e m o l e ) = 6 ：1 ，r e a c t i o nt 唧p 盯栅e6 0 ，r e a c t i o n t i m e 5 h o u r s 1 1 1 ep r 印a m t i o nc o n d i t i o n so fn - c m c ：t h e 锄o u to fc h 主t o s 蛐1g ，d i s t d l e d w a t c r 1 5 0 m l ，g 1 y o x y l i ca c i d c h i t o s a l l ( m o l 曲n 0 1 妒1 2 ， r e a c t i o n t c l l l p e r a t u r e 2 0 4 0 。r e a c t i o nt i m e2h o u r s ，p h8 1 0 ，1 0 s o d i u mb o r o h y m d es o l u t i o n1 0 n 1 1 ， d e o x i d i z a t i o nt e m d c 】阿n 聪2 0 4 0 ，d e o x i d i z a t i o n 岫e2h o u r s t h ep r 印嘲c i o nc o n d i t i o n so fo - c m c ：t 1 1 e 锄o m to fc h i 血5 9 ，t l l ev 0 1 眦l e s o fi s o p r o p y la l c o h o l5 0 1 1 1 1 ，5 0 s o d i 啪h y d r o x i d es o l u 廿o n3 0 l n l ，b 髂i f i c dt i m e1 2 h o u r s ，b a s i 矗e dt e m p 盯a t u r e 一1 0 ，d ：l l o r o a c e i i ca c i d c h m n o _ i l o l e ，m o l e ) = 4 5 ：1 ， 3 天津医科大学硕士学位论文 r e 枷o nt 锄1 p e r a t u r e5 0 ，r e a c t i o n 劬e4h o u r s ，d e e t y l a t i o nt 锄p e f 咖r e9 0 ， d e a c e t y l a t i o nt i m e1 5h o l 】r s ，ab “o fs o d i 啪b o r o h y d r i d ec 蛆b ed r o p p e di nt l l e r e a c t i v es y s t c m t h ep 嘶f i c a t i o ne 疵c to fm a 鲫e t i cf o r c em i xm e t i l o da i l du l t m s o n i cm e f h o d w e r ec o m p 盯e di nn l ep r o c e s so fc m c 删f i c a t i o n t h er e s u l tw 器t h a tm el a t t e r w a sb e t t e r 廿l a nt h ef o n n e ra n dm ea m 0 1 肛l to fc h l o r i n ei o nw a s1 e s s 血a no 0 1 硪e rw 船h i n g6t i m e s c m ci n 仃诅s i c 、r i s c o s i t yw 够m e a s l l r e db yv i s c o s i t ym e m o d i n c l u d i n g 缸a d i t i o n a ls t e pb ys t 印d i h n i o nm e n l o da n do n e - 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9 2 9m o u s e 助r o b l a s t sw e r cc u l t i l r e di i lt l l em e d b 砌o fs 0 1 u t i o n o fm a t e r i a l s c d lv i a b i l i t ya n dp r 0 1 i 向a t i o nw e r ct e s t c db yc e np r 0 1 i 衙a t i o n 鹊s a y m r o u 班v a l u e so fo d a t2 ，4 趾d7d a y sr e s p e c t i v d ya f t e ri n n o c l l l a t i o n 1 1 他c d l r e l a l i v eg r o w mr a t e ( r g r ) w a sc a l 砌a t e d 柚dt h ec y t o t o x i c i t yw 鼬芦a d e db y g e n e m l l ya c c 印t e ds 伽1 d a r d h 锄o l y s i st e s t ：h 锄o l y s i sp 盯c t a g em e a s u r 锄e n t w 嬲u s e dt o 勰s a y 血e h e m 0 1 如cp m p e n i e so ff o u rt y p e so fm a t 耐a l st h r 0 1 】曲d i r e c t c o n t a c t 丽mr a b b i tb l o o d r e s u l t 8o fm ec y t o t o x i c i t yo f 州矗e dc h i t o s a l la n dt h i e et y p e so fc m cw a s 伊a d eoo r1 ，u pt om e d i c a lp l 】r p o s e w ef o u n dm a th i g h e rt l l ec o n c c i = 【仃a t i o no f s 0 1 u t i o no fm a t e r i a l s ，1 l i g h e rm ec ”o t o x i c i 可w a ss h o w e d 孤dt 1 1 ec y t o t o x i c i t yo f n - c m cw 鹊t h el o w e s t n eh e i n o l y s i sr a t e so ff o u rt y p 嚣o fm a t 耐a l sw e r e1 e s s t 1 1 锄5 ，u pt om e d i c a l 脚o s e n - c m ch a dm el o w c s th 黜0 1 洒sr a t e s 柚d 4 天津医科大学硕士学位论文 o c m ch a dm eh i 曲e s t 1 1 1 i sr c s l l l tw 髂i na c c o r dw i t hc 咖t o x i c i t yt e s t 仃0c y t o t o x i c i t yt c s t 蚰dh e m 0 1 y s i st e s th a ds h o w n ：c h i t o s a na n di t s d e r i v a t i v e sh a dg o o db i o c o m p a 曲i l i t yw h i c hp r 0 v i d e dp o s s i b i l i t i 柚df b l l i l d a t i o i l s f b rt l l e 如1 1 h e rr e s e a r c h 蛋时 w o r d s ：c h i t o s 趾( c h s ) ，c a m x y i i l 如y l c b i t o s a l l ( c m c ) ，d e g r e e o f s u b s t i t l l t i o n ( d s ) ， c o l l o i d a ld 舰t i o n ， b i o l o 百c a le v a l 瑚t i o n ，y t o t o x i c i 饥 c e l l p r o l i 锄a t i o mh e t i l o l y s i s 5 天津医科大学硕士学位论文 前言 天然高分子材料是人类最早使用的医用材料之一，由于这类材料具有合成 材料不可替代的优点，如在体内很容易降解，降解产物对人体无毒且可为人体 所吸收，参与人体的代谢循环等，尽管在性能上它们仍有不少不尽人意之处， 如强度低，降解过快等，但人们一直没有放弃对它的深入研究。目前临床应用 的天然材料主要由天然多糖类材料和天然蛋白质材料两大类，甲壳索和壳聚糖 属于前者，胶原蛋白属于后者。 1 甲壳素与壳聚糖的概述 甲壳素( c h i t i n ) 广泛存在于昆虫和甲壳类动物( 如虾、蟹等) 的硬壳及 真菌的细胞壁中，是继纤维素之后，地球上蕴藏量最丰富的天然有机物“1 。其 结构式如下： 晦髓晦擗 自从本世纪6 0 年代以来，甲壳质及其衍生物的研究十分活跃。甲壳素又 称甲壳质、壳质、几丁质，是一种带正电荷的天然多糖高聚物，是由2 一乙酰胺 基一2 一脱氧一d 一葡萄糖通过b 一( 卜4 ) 糖苷键连接起来的直链糖。壳聚糖 ( c h i t o s 。n ) 是甲壳质大分子脱去乙酰基后的产物，结构见下图： 国悟。喻协 茎堡垦型查兰堡圭量垡笙茎 故又称脱乙酰甲壳素、可溶性甲壳素、甲壳胺等。随脱乙酰化度的不同， 其分子链中存在含量不同的2 一乙酰基葡萄糖和2 一氨基葡萄糖两种结构单 元。一般而言，n 一乙酰基脱去5 5 以上的就称之为壳聚糖。其结构式为：壳聚 糖是白色或淡黄色片状固体。不溶于水、乙醇和丙酮，能溶于无机酸和水杨酸、 酒石酸及抗坏血酸等有机酸，也能溶于许多稀酸溶液中。1 。在酸性介质中，壳 聚糖的分子中的一n h 。基团被质子化为一n h 。+ 离子，产生酸性溶解；而未被脱n 一乙酰基的甲壳素无溶解性。因此，壳聚糖的溶解性与脱乙酰化度密切相关： 脱乙酰度在6 0 以下的壳聚糖只有部分离析溶解于稀醋酸溶液中；脱乙酰度为 6 0 8 0 的壳聚糖呈絮凝悬浮于稀醋酸溶液中；脱乙酰化度为8 0 以上的则以 油状清澈地溶于稀醋酸溶液中。 壳聚糖具有良好的生物相容性，无免疫原性，无毒无味，可生物降解等特点 甲壳素和壳聚糖在医药和卫生材料方面的应用研究由来已久，有些研究成果已 付诸实际应用，甚至已经工业化生产。随着产业化的实施其临床应用的范围不 断拓宽，既有不直接与人体接触的，也有与人体组织接触的；既有做成药物使 用，也有作药物载体；既有用于治疗的，也有用于保健的。其中以人工皮肤和 外科手术缝合线最引入瞩目，展现了诱人的应用前景。特别要看到由于壳聚糖 具有优良的生物相容性和生物可降解性，是理想的细胞外基质材料，从而使壳 聚糖及其衍生物被广泛地应用于生物医学领域0 1 。目前已利用壳聚糖成功地开 发出人工皮肤、人工肾的透析膜等产品：在作为神经、肌腱、骨骼、牙齿等组 织器官的修复材料和作为培养肝脏、肾脏等实质器官细胞的支架材料的研究中 展现出广泛的应用前景n ，。 与甲壳素相比，脱去部分乙酰基的壳聚糖溶解性能已有很大程度的改善， 但也只能溶解在稀酸性溶液，这在很大程度上限制了其推广应用，因此改善壳 聚糖的溶解性能，特别是改善其水溶性，是壳聚糖改性研究中最重要的方向之 一。在众多改性方法中，水溶性羧甲基壳聚糖的研究较早，也是最引人注目的 课题之一。羧甲基壳聚糖在日化、食品、造纸、制药、化妆品等方面都有着重 要的用途，这主要是因为羧甲基壳聚糖具有如下优良性能“3 ： 7 天津医科大学碉士学位论文 ( 1 ) 水溶性。取代度大于o 6 的羧甲基壳聚糖易溶于水，取代度愈高，水 溶性愈好，其溶液的透明度也愈好。( 2 ) 保湿性。羧甲基壳聚糖上的羧基及氨 基都是亲水基团，有着较强的吸水性，o 2 5 的羧甲基壳聚糖溶液的吸湿度与 2 0 的丙三醇相当，溶液的粘度恒定。( 3 ) 成膜性。羧甲基壳聚糖有较好的成膜 性，其膜具有光泽，透明而柔韧，并有较好的透气性。( 4 ) 高分子性能。对胶体 有稳定作用，有增稠及凝胶的作用和气泡稳定作用。( 5 ) 生物学性能。羧甲基壳 聚糖生物学性能优异，安全、无毒、无害。 2 羧甲基壳聚糖的制备 壳聚糖的化学改性的主要类型有以下几种：酰化、醚化、n 烷基化、酯化 等。在众多的化学改性，醚化反应之的羧甲基化是研究比较多的一种。羧甲 基壳聚糖( c a r b o x y m e t h y lc h i t o s a n ，c m c ) 是壳聚糖经羧甲基化反应后的一 类壳聚糖衍生物。由于壳聚糖分子中存在游离氨基和羟基，反应时取代基可进 入o ( c 。) 和n ( c 。) 。则相应的产物有0 - 羧甲基壳聚糖( o _ c ) 、n 一羧甲基壳 聚糖( n 一例c ) 和n ，o 一羧甲基壳聚糖( n ，o c m c ) 。 2 1o _ c 眦的制备 o _ c 粥一般是在碱性和低温条件下，壳聚糖的c 。伯羟基与一氯乙酸发生 反应而制得的。这种制备方法是m u z z a r e l l i 等人m 首先提出来的：用氢氧化钠 溶液( 4 2 ) 浸渍过的甲壳素，与一氯乙酸钠低温3 0 进行羧甲基化反应5 小 时，得到o c m c 。 也有人利用壳聚糖为原料，通过不同的工艺方法制各出沪c m c 。例如， 陈鲁生、李嘉林等。1 ，将壳聚糖粉碎到定细度以下，浸泡在n a o h 溶液中数 小时后挤压成滤饼状，然后加入一定量氯乙酸与异丙醇混合溶液，室温下搅拌 数小时，除溶剂，加二次水，用h c l 溶液调节p h 值，加乙醇，离心，烘干 得到粗产品。粗产品粉碎至1 5 姗后，用n a o h 溶液浸泡一段时间后，与氯 乙酸反应8 小时，所得产率较高，可达8 0 以上。邵健等”3 取一定量壳聚糖溶 于乙酸溶液中，抽滤除去不溶物，搅拌下滴加氢氧化钠溶液至定p h ，抽滤， 将沉淀加入氢氧化钠溶液匀浆，得悬浊液冷冻过夜。解冻后，加入氯乙酸和乙 圣望堕型盔堂堡主兰些笙苎 醇溶液，反应5 小时后，经过精制得o _ c m c 。李治等。取壳聚糖粉末，悬浮 于一定浓度的n a 0 h 溶液中，加入氯乙酸与冰醋酸混合液，在一定温度下反应， 每隔一段时间，加入氯乙酸钠与冰醋酸的混合液，搅拌反应数小时，然后用h c l 溶液调节p h 值，静置，取下层沉淀，用去离子水洗涤，烘干，得o _ c m c ， 羧甲基化最高可达8 0 。 2 2n c 眦的制各 n c m c 通常是在酸性介质中进行，采用乙醛酸作为羧甲基化试剂，通过壳 聚糖上的自由氨基与乙醛酸的反应，生成可溶性的醛亚胺，然后用适当的还原 剂还原产物制得的。第一步反应是在均相体系进行因而非常容易制备，而且反 应常温下就能进行。反应生成的n c m c 含有乙酰基、羧甲基和自由氨基基团， 其比例取决于壳聚糖的选择( 脱乙酰度及摩尔质量) 以及乙醛酸所用的量。所 选用的原料壳聚糖来源不同，制得的n c m c 水溶性差别较大“。该反应的特 点是取代有选择性，不需要加热，可在水溶液中进行，为均相体系。 在上述方法基础上。也有人通过先加冰醋酸溶解原料，而后再加入乙醛酸 进行反应。例如，m u z z a r e l l i 等“3 将壳聚糖粉末( 7 9 ) 悬浮于一定量的去离子水 ( 4 8 2 1 l ) 中，在2 0 温度下加冰醋酸( 4 6 5 9 ) 促进溶解，再加入5 8 9 乙醛 酸溶液( 5 0 浓度) 搅拌一段时间。使壳聚糖溶液中含有等比例乙醛酸和氨基， 用氢氧化钠调节p h 值至4 0 0 。加入硼氰化钠后p h 值达到4 8 。将所得的 清澈粘性溶液用去离子水透析，得到n c 。 2 3n ，o c m c 的制备 目前，c m c 的制备方法中，以n 0 一c m c 的制各最为普遍。因为n ，o c m c 的制备方法相对简便，同时原料易得。一般，n ，o c m c 是通过壳聚糖在浓碱液 中与氯乙酸反应，适当控制反应条件得到的。由于反应是非均相反应，收率和 取代度，以及反应的均匀性都不理想，科研工作者采用了各种不同措施对原有 工艺进行了改进。 按h a y e s 等o ”人的专利，碱液在低温溶胀阶段已全部加入，随即进行羧甲 基化，这属于一次加碱反应，取代度在o 4 o 8 之间，氯乙酸利用率低。 天津医科大学硕士学位论文 陈忻等1 将壳聚糖溶于稀乙酸，用过薰的丙酮沉淀得壳聚糖乙酸盐后，加 入定量的氢氧化钠溶液和异丙醇，控制壳聚糖与氯乙酸反应温度和时间，得 粗产品；产物调p h 值至中性，用8 5 的甲醇洗涤，干燥得产品。 吴国杰等“3 1 在异丙醇中加入壳聚糖，将氢氧化钠水溶液分成若干等份，每 隔一定时间加入一份，在所得的碱液中分数次加入一氯乙酸，一定温度下，反 应数小时后精制得n ，沪c m c ，其水溶液具有很好的透明度。 于兹东等“”将壳聚糖在乙醇中浸泡并用5 0 氨氧化钠碱化，制得碱化壳聚 糖。然后加入氯乙酸在一定温度范围内搅拌反应数小时得粗产品，用乙醇提纯 得到白色片状c m c 。 张芝芬等“”对壳聚糖粉碎处理后，加一定量的异丙醇，在一定温度下加入 一定量n a o h ，搅拌一段时间，再加入氯乙酸，在一定温度下保温使其充分反 应，然后精制获得成品，由于他们采用了正交试验中对n ，o _ 羧甲基壳聚糖进 行制备条件的优化组合，所获得产品的羧甲基化程度较高，水溶性好，具有较 高的开发利用价值。 3 c m c 在医学方面的应用 c m c 可作为生物医用材料，应用于伤口贴、包扎带、人工骨和人工皮肤以 及酶的固定化载体等方面。利用c m c 易于阻止组织间粘结的性质，可将其凝胶 或膜做成伤口贴、包扎带用于外科伤口，由于c m c 形成的凝胶粘度和弹性大于 血浆，可阻止血液在组织表面凝结从而阻止粘结“”1 。 c m c 具有抑菌杀菌功能，口服羧甲基壳聚糖具有促进肠内共生有益菌群的 繁殖如双歧杆菌的繁殖，抑制有害菌的生存，提高身体免疫力，有显著的降血 脂及胆固醇的作用，并能清除机体内的铅、汞。不同取代位置的羧甲基壳聚糖， 其抗菌性方面各有其独特的一面。例如，取代度1 o 以上的n ，o c m c 进行了 体外抑菌试验，证实了分子量低于5 0 0 0 的n ，o _ c m c 的抑菌活性较强，该样品 对金黄色葡萄球菌等细菌具有抑菌杀灭作用。”。o c 也具有一定的抗菌性能， 其抗菌性随羧甲基度升高呈先升后降的规律。与壳聚糖相比，表现出相当强的 抗菌性能“。 1 0 天津医科大学硕士学位论文 0 一c m c 还可作为固定酶的载体，如固定d 一葡萄糖异构酶，溶菌酶等。若将 可防治癌细胞生长的天门冬酰胺酶固定上去，有可能成为医治白血病的新型药 物3 。 利用n ，o _ c m c 与亚铁离子络合的基本特性，可以用于治疗缺铁性贫血，因 为人体对c m c 壳聚糖一亚铁络合物的吸收远远大于传统的f e s 0 4 药物，这方面 的研究以期为开发天然生物补铁制剂开辟新途径“”。 4 论文选题的目的和意义 由于壳聚糖优良的生物相容性和生物可降解性，是理想的细胞外基质材料。 但壳聚糖亲水性较差( 只能溶解在稀酸性溶液) ，降解速率慢等原因，已很难满足 组织工程的需要，现在的组织工程的细胞支架大都是以水溶性天然材料为基本 材料。因此改善壳聚糖的溶解性能，特别是改善其水溶性，是壳聚糖改性研究 中最重要的方向之一。壳聚糖具有较多的侧基宫能团，可以进行化学改性，在众 多改性方法中，水溶性羧甲基壳聚糖( c m c ) 的研究较早，也是最引人注目的课题 之一。 c m c 的制备一直是壳聚糖研究领域内的热点课题之。在同时，随着应用范 围逐渐扩大，对可控取代度c 的需求日渐突显。因此，对c m c 可控制备方 法、影响取代度因素及相关规律的研究显得非常重要。但是，目前这方面的文 献报道较少，基于此，我们对碱用量、原料配比、反应时间、反应温度、以等影 响产物取代度的因素进行了系统的研究，以期为可控制备不同取代度c m c 提供 依据。 n c m c 的制备是采用乙醛酸作为羧甲基化试剂，可使反应只发生在n 上，经还 原后可得到n c m c 。由于乙醛酸的合成比较困难，主要来自进口，价格昂贵。用乙 醛酸合成n c m c 的报道较少。本实验中对影响产物n 一例c 取代度的因素进行了 探索性研究。o c m c 的制备方法中，先对甲壳素进行羧甲基化，再进行脱乙酰 化的方法是近几年来被提出来了，相关文献报道少，本实验中运用这种思路对 影响产物沪c m c 取代度的因素进行了探索性研究。 每一种医用材料应用于临床之前，都必须进行一系列生物学评价，以保证使 天津医科大学硕士学位论文 用安全。国内外许多学者对壳聚糖和c 淞的生物学性能等进行了大量的试验研 究，但其中大部分都是针对n ，o c m c 进行的研究，对其余两种c 们的研究报道较 少，所以在本研究从生物学性筏方面着手对本实验室箭各的n o 一踊e 、n c 磷c 和 0 一c m c 三种材料进行了初级生物学评价( 包括细胞毒性试验和溶血试验) ，并且 把它们的生物相容性进行了比较，为扩大壳聚糖及其衍生物在医学中的应用提 供实验基础。 天津医科大学硬士学位论文 第一章羧甲基壳聚糖的制备 1 材料与方法 l1 试剂 甲壳素和壳聚糖( 脱乙酰度8 5 ) 氯乙酸 乙醛酸 硼氢化钠 聚乙烯醇硫酸钾( p v s k ) 聚二丙烯二甲基氯化铵( p d 从c ) 溴代十六烷基吡啶 甲苯胺蓝( t b ) 盐酸 氢氧化钠 氯化钠 硝酸银 异丙醇 无水乙醇 1 2 仪器 微量天平a b l 0 4 7 2 1 分光光度计 酸度计p l _ 2 5 型 电热恒温鼓风干燥箱 超声清洗器a s 0 1 1 2 4 3 乌氏粘度计 电热恒温水浴锅h h s 1 1 l 恒温磁力搅拌器9 0 一2 青岛利中甲壳质公司 天津市文达稀贵试剂化工厂 百灵威化学技术有限公司 天津市文达稀贵试剂化工厂 百灵威化学技术有限公司 百灵威化学技术有限公司 百灵威化学技术有限公司 百灵威化学技术有限公司 天津市化学试剂批发公司 天津市化学试剂三厂 天津市文达稀贵试剂化工厂 天津市化学试剂三厂 天津市化学试剂三厂 天津市化学试剂三厂 n m e l “i l e rf i 。o l e d o 上海第三分析仪器厂 上海伟业仪器厂 上海精宏设备公司 a u t o s c i e n c e 上海启航玻璃仪器厂 北京长安科学仪器厂 上海亚荣生化仪器厂 天津医科大学弼士学位论文 5m l 微量滴定管 北京玻璃仪器公司 电接点玻璃水银温度计黄骅仪表厂 玻璃仪器 北京玻璃仪器公司、天津玻璃仪器公 司 1 。3n ，o _ 弋m c 的制备 ( 1 ) 溶胀：称取5 9 干燥的壳聚糖粉末放入三角烧瓶中，加入4 0 m l 的异丙醇搅 拌使其常温溶胀2 小时： ( 2 ) 碱化：在上述溶液中加入6 0 m l 一定l o o l l n a o h 溶液，搅拌均匀，放入 一1 0 冰箱过夜( 1 2 h ) ，让壳聚糖在碱性条件下膨胀，形成碱化中心： ( 3 ) 反应：将2 0 9 氯乙酸水浴加热充分溶于1 0 m l 的异丙醇中，分五次加入溶 液中，每次间隔1 0 m i n ，加热至6 0 ，反应5 h ，得羧甲基壳聚糖混合物： ( 4 ) 抽滤、干燥：反应结束后，向溶液中加入少量蒸馏水，1 0 盐酸调p h 至7 o 。 布氏漏斗抽滤，滤液中加入4 倍量的无水乙醇充分沉淀，过滤，9 5 乙醇溶液洗 涤。所得产品放入真空干燥箱内干燥，即得白色或淡黄色的c 。 1 4n - - c m c 的制各 ( 1 ) 称取1 9 干燥的壳聚糖于5 0 0 m l 锥形瓶中，加蒸馏水1 5 0 m 1 ，搅拌均匀，按乙 醛酸与壳聚糖的摩尔比为1 2 ，常温( 2 5 ) 反应2 h 。 ( 2 ) 用l o n a o h 溶液调p h 至9 ，再分5 次缓慢滴加1 0 m l l o n a b 也溶液，常温反 应2 h 。 ( 3 ) 将反应完后的混合物用l o 盐酸调至中性，布式漏斗抽滤，滤液用4 倍量 的无水乙醇充分沉淀，过滤，9 5 乙醇溶液反复冲洗，真空干燥得到白色固体。 1 5o _ 删c 的制各 ( 1 ) 将粉碎的甲壳素称取5 9 悬浮于5 0 m l 的异丙醇中常温溶胀2 h 。 ( 2 ) 将上述混合物中慢慢滴加3 0 m l 的5 0 的氢氧化钠溶液，搅拌均匀后，放 入一1 0 的冰箱内冷冻过夜( 1 2 h ) 。 ( 3 ) 称取1 0 9 氯乙酸，水浴加热溶于1 0 m 1 异丙醇中，用磁力搅拌器边搅拌边 缓慢滴加，滴加完毕后，在5 0 下水浴保温。 1 4 天津医科大学硕士学位论文 ( 4 ) 倒出上清液，加入少量水溶解，抽滤，滤液用4 倍量的无水乙醇沉淀， 再用9 5 乙醇溶液洗涤，真空干燥得到o 一羧甲基甲壳索。 ( 5 ) 将得到的羧甲基甲壳素放入5 0 m l 的5 0 的氢氧化钠溶液中，搅拌均匀， g o 反应1 5 h ，进行脱乙酰化反应。 ( 6 ) 完应完毕后，加入少量水充分搅拌溶解，抽滤，滤液用4 倍量无水乙醇 沉淀，在加入适量的水，1 0 盐酸溶液调至中性，再沉淀，用9 5 乙醇溶液洗 涤，真空干燥得白色粉末状产物。 1 6 分析测定方法： 1 6 ic 配取代度的测定 按第二章第2 节所述的胶体滴定的方法来测定c m c 分子中的羧基和氨基的 含量。 1 6 2c m c 粘均分子量的测定 将已称量充分干燥的样品，溶于o 1 m o l l 氯化钠溶液中，用鸟氏粘度计 在2 5 下按一点法测定特性黏度( 见第二章第l 节) ，粘均分子量用 m a r k h o u w i n k 关系式得到： n = 7 9 6 1 0 。m “” ( 式1 1 1 ) 2 结果 在碱性环境中壳聚糖在异丙醇介质作用下与氯乙酸在一定温度下反应，生 成n ，沪c m c 。“。反应式如下： c 赡o hc h l o c l 鼍，c o o h 嘻令。c 。h 骂砷令。 h 矧z 瓿矗h o 盎 影响产物性能的因素很多，如异丙醇的用量，碱的用量，氯乙酸的用量， 反应温度，反应时间等都对产物性能有影响。下面就制备条件与工艺对c m c 性 天津医科大学硕士学位论文 2 1 1 异丙醇用量对反应的影响 在异丙醇壳聚糖( v w ) 分别为2 5 ：1 到1 7 5 ：1 ，在反应温度为6 0 ， 氯乙酸壳聚糖( w w ) = 4 ：1 ，反应时间为5 h 条件下，反应产物取代度随 异丙醇壳聚糖( v w ) 比例的变化见表1 1 1 。 表1 ，1 1 取代度随异丙醇用量的变化 下图1 _ 1 1 表示了这一变化趋势 异丙醇壳聚糖 图1 1 1 取代度随异丙醇用量的变化 由图1 1 1 可知，随异丙醇量的增加，产物取代度是呈先增后减的趋势， 当异丙醇壳聚糖( v w ) 为7 5 ：1 时，产品的取代度达到最高，进一步提 高异丙醇壳聚糖( v w ) 比例，产品的取代度反而会下降。异丙醇用量太 多或太少都不利于试验进行，它对反应体系的影响是多重的，异丙醇的量超过 溶胀壳聚糖的量时，会稀释o h 溶液，从而阻碍了n a o h 渗入壳聚糖分子中， 不能很好的形成碱化中心，另一方面异丙醇的量增大时又有利于壳聚糖溶胀， 促进碱液渗透和扩散，提高了氯乙酸利用率；另一方面异丙醇的量过少，壳聚 糖不能充分溶胀，从而影响产物的取代度。因此，适当选择异丙醇用量可提高 产物取代度。一般取代度大于o 6 的c m c 易溶于水，取代度愈高，水溶性愈好， 其溶液的透明度也愈好“”，用尽量少量异丙醇能达到高取代度的产品正是我们 所希望的，为此，我们选择当异丙醇壳聚糖( v w ) 为7 5 。 1 6 天津医科大学硕士学位论文 2 1 2 氢氧化钠用量对反应的影响 羧甲基化过程中严格的强碱性条件是能得到c m c 的前提。但碱用量和浓度 直接影响产品性能( 见图4 ，2 ) 。在异丙醇壳聚糖( v w ) 分别为7 5 ：1 ，在 反应温度为6 0 ，氯乙酸壳聚糖( w w ) = 4 ：1 ，反应时间为5 h 条件下固 定n a o h 溶液浓度( 1 0 m o i l ) ，反应产物取代度和分子量随碱量的变化见表 1 1 2 和表l _ 1 - 3 。 表1 1 2 取代度随n a o h 用量的变化 下面图l - i 2 和图i 1 3 分别表示了表1 1 2 和表1 1 3 的变化趋势： k 。 删 h 求 霞 椁 o o 8 0 6 0 4 0 2 0 0 1 52 02 53 03 54 0 n a 伽的量( g ) 1 1 2 取代度随碱量的变化图1 1 3 碱量对产物黏均分子量的影响 由上面的图和表可见：当碱用量过小，反应环境不能控制强碱性条件，羧甲 基反应不能进行；碱用量增大，产品水溶性很好，取代度也提高，但产物的分子 量明显降低：但随着