（遗传学专业论文）刺茄金属蛋白酶基因及病程相关基因的克隆和分析.pdf

摘要 蛋白酶在植物生长发育的许多方面都起着重要的作用 植物基因组中1 5 的基因编码蛋白酶 就结构和功能而言 金属蛋白酶是蛋白酶中种类最多的 近 年来植物细胞器金属蛋白酶引起了人们极大的研究兴趣 本研究利用生物信息学 和各种实验技术相结合的方法对分离获得的三条刺茄e d n a s s s z n m p l s s z n m p 2 及s s z n m p 3 进行了细胞内的定位 基因组组成 成熟蛋白的形式及结 构和功能研究 从g e n b a n k 数据库中推导和拼接出9 条其它植物的z n m p s 和6 条蓝细菌的z n m p s 分析表明 这些蛋白质是一类新的保守的膜结合的锌金属 蛋白酶家族 为植物和蓝细菌所特有 它们的功能可能与光合作用有关 其它植 物的z n m p s 序列与s s z n m p 3 之间有超过6 2 的相同性 而6 条蓝细菌的 z n m p s 序列与s s z n m p 3 之间只有约2 0 的相同性 但是其中一些氨基酸残基 和区域则相当保守 s o u t h e r n 杂交和基因组分析表明 植物中这类基因在基因组 中只有1 个或2 个拷贝 成熟的z m pm r n a s 可由7 个或更少的外显子精确地 拼接而成 植物朋 m p 基因编码的膜蛋白可能定位在叶绿体 内质网 膜 和质 膜上 而蓝细菌的此类蛋白定位在细胞质膜上 刺茄s s z n m p 基因在不同的组织 中有差异地表达 各种刺激因素也可以诱导其表达 w e s t e r n 杂交结果表明 刺 茄中仅表达膜蛋白s s z n m p l 并且植物中这类高度保守的家族成员可以形成不 同的成熟形式 成熟的此类蛋白将剪切掉其n 端的导肽 这类z n m p s 蛋白含有 一个保守的锌结合位点 h e a g h x l 9 e d x 4 6 q 8 e x 7 e g g 一个可能的g 蛋白偶 联受体家族l 标志和一个三联氨基酸残基元件 该元件在植物和蓝细菌中分别为 n r k f d e r y 仃 这表明不同成熟形式的z n m p s 可能作为蛋白酶或 和信 号受体 本研究为进一步研究此类金属蛋白酶的生化和生理功能奠定了坚实的基 础 第十类病程相关蛋白在植物抗病性和系统获得抗性中起重要作用 因而对 这些蛋白功能的研究在农业应用上具有重要的作用 虽然有研究报道第十类病程 相关蛋白具有酶活性 但是这类蛋白的生理功能仍不清楚 拥有许多优良农业性 状包括多种疾病和昆虫抗性的刺茄是茄子的远缘植物和极具价值的茄子育种的 种质资源 用r a c e 方法从刺茄中克隆出了一条编码s s p r l 0 的e d n a g e n b a n k 登录号为 a y 6 6 0 7 5 3 并对其进行了分析 s s p r l 0 编码1 6 0 个氨基酸残基组成 的多肽 其预测的分子量为1 7 5 8k d a 等电点 p i 为5 2 9 s s p r l 0 同其它的 p r l 0 蛋白序列比较分析表明 在氨基酸水平上s s p r l 0 同辣椒c a p r l 0 有很高的 相同性 6 8 1 但与水稻j i o s p r l 0 仅有3 1 7 的相同性 基因组d n a 杂交 结果表明 s s p r i o 属于多基因家族 组成型表达的s s p r i o 在生长于培养罐中的 i i i 无菌植株的根中表达量最高 但是在经过含烟草花叶病毒的汁液喷洒后再在温室 中培养6 天后的植株老黄叶中s s p r l 0 的表达量最高 防御或胁迫途径中的信号 分子如m e j a s a a b a g a 3 h 2 0 2 及c u 2 可以显著地诱导s s p r l 0 表达 而 黑暗不诱导s s p r i o 的表达 在低温条件下s s p r i o 的表达受到抑制 本研究成 功地在大肠杆菌中表达和纯化了重组蛋白s s p r l 0 透析复性后的原核表达产生 的没有被磷酸化的重组蛋白s s p r l 0 可以降解刺茄叶的总r n a 和抑制稻瘟病菌 菌丝的生长 这些结果表明 来自于刺茄的s s p r l 0 具有核糖核酸酶和抑菌活性 环境胁迫和病菌可以诱导其表达 说明s s p r l 0 可能不仅参与植物的防御和抗逆 反应 还与植物生长 发育和衰老有关 s s p r i o 基因的克隆和分析为今后进一 步明确其功能和机制并应用于植物遗传改良奠定了基础 关甜j 乳生物信息学 防御 胁迫 g 蛋白偶联受体 g p c r 蛋白酶 锌金属 蛋白酶 z n m p 第十类病程相关蛋白 光合作用 刺茄 系统获得抗性 核 糖核酸酶活性 中图书分类号q 3 7 a b s t r a c t p r o t e o l y t i ce n z y m e sa r ei n t r i c a t e l yi n v o l v e di nm a n ya s p e c t so f p l a n tp h y s i o l o g y a n dd e v e l o p m e n t p e p t i d a s e sc o n s t i t u t eo f1 5 o f t h eg e n ec o n t e n t i nt e r m so f b o t h s t r u c t u r ea n df u n c t i o n m e t a l l o p r o t e a s e sa r et h em o s td i v e r s eo f p r o t e a s e s r e c e n t l y r e s e a r c h e so np l a n to r g a n e l l a rm e t a l l o p r o t e a s e sh a v ei n t r i g u e dg r e a ti n t e r e s ti nt h e i r p o t e n t i a lf u n c t i o n s h e r ew er e p o r t e do ni s o l a t i n g i d e n t i l y i n ga n dc h a r a c t e r i z i n gt h r e e n o v e lc d n a s n a m e l ys s z n m p l s s z n m p 2a n ds s z n m p 3 f r o ms o l a n u ms u r a t t e n s e t oi d e n t i f yt h ei n t r a c e l l u l a rl o c a t i o n g e n o m i co r g a n i z a t i o n m a t u r ep r o t e i nf o r m s s t r u c t u r e sa n df u n c t i o n so ft h e s et h r e ei s o l a t e dn e wc d n a sf r o mss u r a l t e n s e i n t e g r a t e da p p r o a c h e sw e r eu s e d i nt h i ss t u d y 9z n m p sd e d u c e do ra s s e m b l e df r o m o t h e rp l a n ts p e c i e sa n ds i xz n m p sf r o mc y a n o b a c t e r i ai nt h eg e n b a n kd a t a b a s ew e r e u s e d b e i n gs p e c i f i ct ot h ep l a n ta n dc y a n o b a c t e r i u mk i n g d o ma n dr e l a t e dt o p h o t o s y n t h e s i s t h ep l a n tz n m pm e m b e r ss h a r e dm o r et h a n6 2 o v e r a l li d e n t i t yw i m s s z n m p 3a n dt h es i xc y a n o b a c t e r i u mp u t a t i v ep r o t e a s e sh a da b o u t2 0 i d e n t i t yw i t h s s z n m p 3i nw h i c hs o m er e s i d u e sa n dr e g i o n sw e r eh i g h l yc o n s e r v e d s o u t h e r nb l o t a n dg e n o m i ca n a l y s e sr e v e a l e dt h a tt h e r ei sp r o b a b l yo n l yo n eo rt w oc o p i e so f z n m p i nt h eg e n o m ea n dt h em a t u r em r n a s c o d i n gt h ez n m p sc o u l db ea c c u r a t e l ys p l i c e d w i t hs e v e no rl e s se x t r o n si np l a n t s t h ep l a n t 朋 m pg e n e se n c o d i n gm e m b r a n e p r o t e i n sa r ep o t e n t i a l l yt a r g e t e d t oc h l o r o p l a s t e n d o p l a s m i cr e t i c u l u m m e m b r a n e a n dp l a s m am e m b r a n e a n dt h eb a c t e r i u mz n m p st ot h ec y t o p l a s m i cm e m b r a n e s s z n m p se x p r e s s e dd i f f e r e n t l yi nt i s s u e sa n dr e g u l a t e db yv a r i o u ss t i m u l i w e s t e r n b l o ta n a l y s e ss h o w e dt h a to n l ys s z n m p ie x i s t sa sam e m b r a n ep r o t e i ni n s u r a t t e n s e t h eh i g h l yc o n s e r v e df a m i l ym e m b e r sc o u l df o r md i f f e r e n tf o r m so f m a t u r ep r o t e i n si np l a n t s a n dt h e s ep r o t e i n sw i l lb ec l e a v e do f ft h e i rn t e r m i n a l t a r g e t i n gp e p t i d e a n a l y s e sr e v e a l e dt h a tt h e s ep r o t e i n sb e l o n g st oa n o v e lc o n s e r v e d m e m b r a n ez i n cm e t a l l o p r o t e a s e z n m p f a m i l y t h ez n m pp r o t e i n sc o n t a i n e da c o n s e r v e dz i n cb i n d i n gs i t e h e a g h x l 9 e d x 4 6 4 s e x v e g g ap o t e n t i a lg p r o t e i n c o u p l e dr e c e p t o r g p c r f a m i l yis i g n a t u r ea n d at r i p l e tm o t i f t h en r k fm o t i f i np l a n tz n m p sa n dt h ed e r y 厂rm o t i fi n 血es i xb a c t e r i u mz n m p s s u g g e s t i n g t h a tt h ed i f f e r e n tm a t u r ef o r m so fz n i v i p sm a yf u n c t i o na sp r o t e a s e so r a n ds i g n a l r e c e p t o r s t h i ss t u d yp r o v i d e sab a s i sf o r 缸r t h e ri n v e s t i g a t i n gt h eb i o c h e m i c a la n d p h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n so f t h en e wm e t a l l o p r o t e a s ef a m i l yi nt h ef u t u r e v c o n s i d e r i n gt h ep o t e n t i a li m p o r t a n c eo fp r i o p a t h o g e n e s i s r e l a t e dp r o t e i n so f c l a s s1 0 i np l a n td i s e a s ed e f e n s ea n ds y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e s h r r e s e a r c h e s o ft h e i rf u n c t i o n sw o u l db es i g n i f i c a n ti na p p l i c a t i o no fa g r i c u l t u r e a l t h o u g hr e s u l t s a b o u tt h ep u t a t i v e e n z y m a t i ca c t i v i t yo fp r l 0p r o t e i n sh a v eb e e n r e p o r t e d t h e b i o l o g i c a lf u n c t i o n so ft h i sc l a s so fp r o t e i n sr e m a i nu n c l e a r h o l d i n gm a n yu s e f u l a g r o n o m i ct r a i t si n c l u d i n gr e s i s t a n c e st oav a r i e t yo fd i s e a s e sa n di n s e c t s y e l l o w f r u i t n i g h t s h a d e s u r a t t e n s e i sav a l u a b l eg e r m p l a s mf o re g g p l a n tb r e e d i n ga n daw i l d r e l a t i v eo fe g g p l a n t ac d n ac l o n e d e s i g n a t e da ss s p r l 0 g e n b a n ka c c e s s i o n n u m b e ra y 6 6 0 7 5 3 e n c o d i n gap r i op r o t e i nf r o my e l l o w f r u i tn i g h t s h a d ew a s i s o l a t e da n dc h a r a c t e r i z e d s s p r ioe n c o d e da16 0 一a m i n o a c i dp o l y p e p t i d ew i t ha p r e d i c t e dm o l e c u l a rm a s so f1 7 5 8k d aa n dp lo f5 2 9 s e q u e n c ea l i g n m e n t ss h o w e d t h a ts s p r l 0h a dh i g hi d e n t i t y 6 8 1 w i t hc a p r l 0 b u th a do n l ya b o u t3 1 7 i d e n t i t yw i t hj i o s p r l 0a tt h ea m i n oa c i dl e v e l g e n o m i cd n ag e lb l o ta n a l y s i s i n d i c a t e dt h a ts s p r i ob e l o n g e dt oam u l t i g e n ef a m i l y t h ec o n s t i t u t i v e l ye x p r e s s e d s s p r i ow a sd e t e c t e dt ob et h eh i g h e s ti nr o o t so f t h es t e r i l es e e d l i n g sc u l t u r e di n j a r s w h i l es s p r i oe x p r e s s i o nw a st h eh i g h e s ti no l dy e l l o wl e a v e sf r o mt h es e e d l i n g s i n c u b a t e dw i t hs a pc o n t a i n i n gt m v f u r t h e re x p r e s s i o na n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h e s i g n a l i n gc o m p o n e n t so fd e f e n s e s t r e s sp a t h w a y s m e j a s a a b a g a 3 h 2 0 2a n d c u u p r e g u l a t e ds i g n i f i c a n t l yt h es s p r i om r n a l e v e l so v e rt h ec o n t r 0 1 h o w e v e r d a r k n e s sf a i l e dt oi n d u c es s p r i oe x p r e s s i o na n di t se x p r e s s i o nw a si n h i b i t e db yc o l d t r e a t m e n t t h es s p r i ow a ss u c c e s s f u l l ye x p r e s s e di nec o l ia n dt h ee x p r e s s e d p r o t e i nw a sp u r i f i e dt on e a rh o m o g e n e i t y t h ed i a l y t i c a l l yr e n a t u r e ds s p r i op r o t e i n w i t h o u tp h o s p h o r y l a t i o ne x h i b i t e dr i b o n u c l e o l y t i ca c t i v i t ya g a i n s t s u r a t t e n s el e a f t o t a lk n ap r e p a r a t i o n sa n dc o u l di n h i b i th y p h a lg r o w t ho fp y r i c u l a r i ao r y z a e t h e s e f i n d i n g ss u g g e s tt h a t t h en o v e ls t r e s s a n dp a t h o g e n i n d u c i b l es s p r l 0w i t h r i b o n u c l e o l y t i ca n da n t i m i c r o b i a la c t i v i t yp a r t i c i p a t e sn o to n l yi nt h ed e f e n s e s t r e s s r e s p o n s ep a t h w a y sb u ta l s oi np l a n t s g r o w t h d e v e l o p m e n ta n ds e n e s c e n c e t h i s s t u d yi s o fp o t e n t i a l i m p o r t a n c en o to n l y f o rf u r t h e ri n v e s t i g a t i n gf u n c t i o n sa n d m e c h a n i s mo ft h ep r l 0p r o t e i n sb u ta l s of o ru s i n gi ti ng e n e t i ce n g i n e e r i n gf o rc r o p i m p r o v e m e n t k e yw o r d s b i o i n f o r m a t i c s d e f e n s e s t r e s s g p r o t e i nc o u p l e dr e c e p t o r g p c r p r o t e a s e p r io p h o t o s y n t h e s i s z i n cm e t a l l o p r o t e a s e z n m p s o l a n u ms u r a t t e n s e s y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e s a r r i b o n u c l e o l y t i ca c t i v i t y v i 刺茄金属蛋白酶基因及病程相关基因的克隆和分析 c l o n i n ga n da n a l y s i so fm e t a l l o p r o t e a s eg e n e sa n d a p a t h o g e n e s i s r e l a t e dg e n ei nss u r a t t e n s e 生命科学学院 遗传学研究所 遗传工程国家重点实验室 复旦一交大一诺丁汉植物生物技术研发中心 上海市邯郸路2 2 0 号 中国 2 0 0 4 3 3 s t a t ek e yl a b o r a t o r yo f g e n e t i ce n g i n e e r i n g i n s t i t u t eo f g e n e t i c s f u d a n s j t u n o t t i n g h a mp l a n tb i o t e c h n o l o g yr dc e n t e r s c h o o lo f l i f es c i e n c e s f u d a nu n i v e r s i t y 2 2 0h a n d a n r o a d s h a n g h a i er c h i n a2 0 0 4 3 3 刘晓军 指导小组 唐克轩教授 杨金水教授 沈大棱教授 2 0 0 5 0 4 2 5 刺茄盘二瞩蛋白 t 基国a h 曼相关基园的童捌 耳嗡析 j 0 0 髭 o 第 章襄献缫述i i 羔凌 i j 鬟 j i 蠹誊 j j 羞 奠 譬曩越誊i o 囊叠氆 量叠一鬟鬈 曩 叠 植物聋茸酶白可 i 离i 节萌能1 j j j 薯 一 j 1 1 前言 k 期以来植物科学家认识到蛋白质转换 p r o t e i n t u r n o v e r 是植物生长及发 育中的一个基本组成部分 然而传统上的研究兴趣都集中在与农业相关的生理过 程上 这些过程包括种子萌发期的储藏蛋自的降解 叶片开始衰老时的蛋白转运 和伴随着氮源到生殖器官的再分配 h u f f a k e r 1 9 9 0 虽然这些研究仍然是高度 活跃的领域 但是我们现在开始认识到蛋自质选择性降解对调节植物发育的各方 面所起的重要作用 这种认识来自于近年来的研究成果 把真核细胞中主要的蛋 白水解途径 泛素 蛋白酶体途径与大量的发育过程 包括胚胎发育 光形态 发生 昼夜节律 花和毛状体发育 以及激素信号传导 包括对生长素 细胞分 裂素 赤霉素 脱落酸和茉莉酸的反应 联系在一起 v i e r s t r a 2 0 0 3 后来 c a l l i s 1 9 9 5 在她的一篇综述中写道 受调节的蛋白质水解可能直接或者间接地参与 大多数的细胞过程 这是真正具有预见性的 因为实际上人们很难在植物中找 到一个与泛素化没有多大联系的生物过程 b a e h m a i re ta 1 2 0 0 1 然而 泛素 蛋白酶体途径绝不是唯一潜在地参与调节植物生长和发育的蛋白水解系统 拟南 芥基因组中除1 3 0 0 个基因参与了泛素 蛋白酶体途径之外 还有6 0 0 多个蛋白酶 基因可能不仅有助通过完全降解时的蛋白质周转和蛋白质半衰期的控制 还有助 于通过有限的或特定位点的蛋白质水解时的蛋白质的运输 前体蛋白的加工以及 蛋白活性的调节 近年来一些非常优秀的文章 s e r i n oa n dd e n g 2 0 0 3 s u l l i v a ne t a l 2 0 0 3 v i e r s t r a 2 0 0 3 d h a r m a s i r ia n de s t e l l e 2 0 0 4 f u j i n a g ae ta 1 2 0 0 4 概述了 在泛素 蛋白酶体领域中所取得的巨大进展 因此本文把目光集中到其它的蛋白 酶上 从每个主要蛋白水解酶类群中选一些代表性的例子 讨论这些蛋白酶近年 来在调节方面的新发现 肽酶 肽水解酶 蛋白酶 催化肽链的水解 此类反应通过提供质子给易 断肽键上的氨基团达到亲核攻击羰基碳原子 从而实现肽键的断裂 外切蛋白酶 e x o p r o t e a s e 也就是作用于多肽链末端的蛋白质 可根据它们的底物特异性 分成氨肽酶或羧肽酶 而作用于 多 肽内部的蛋白酶 e n d o p r o t e a s e so r p r o t e i n a s e s 内切蛋白酶或水解蛋白酶 的分类是建立在各自的催化机制基础上 的 蛋白酶家族根据它们的催化类型 代表催化类型的最重要特征 分成以下 几大类 s 丝氨酸 t 苏氨酸 c 半胱氨酸 a 天冬氨酸 m 金属 g 刺茬 金属蛋白叠粕基因a 嗍关蓉目的宴舅 粉析 谷氨酸 u 未知 含有的不止一种类型的蛋白酶家族被认为是p 型 p u e n t ea n d l o p e z o t i n 2 0 0 4 r a w l i n g se ta i 2 0 0 4 丝氨酸 苏氨酸和半胱氨酸蛋白酶催化 时活性位点氨基酸残基中的羟基或巯基作为亲核基团 另一方面 天冬氨酸和金 属蛋白酶依赖活化的水分子作为亲核基团 近年来谷氨酸蛋白水解酶被认为是一 类新型的催化谷氨酸而不是天冬氮酸残基的酸性蛋白酶 f u j i n a g ae ta 1 2 0 0 4 根据在m e r o p s 数据库 h t t p m e r o p s s a n g e r a c u k r a w l i n g se ta 1 2 0 0 4 使用 的分类 每种催化类型的肽酶可根据序列相似性分成不同的家族 f a m i l y 家 族内成员差异可能很大以致于亲缘关系并不能通过初级结构的比较而稳固地确 定 如果能够通过三维结构的相似性而得出共同的祖先 则各不同的家族 f a m i l y 可以归为一个群落 c l a n 因此 群落的不同数目显示了主要类型 的蛋白酶中结构的差异程度 2 0 0 4 年6 月m e r o p s 数据库释放了6 7 0 版 列出 了拟南芥6 2 8 种蛋白酶和1 3 8 种推测无活性的同源基因 下面仅考虑假设编码有 功能的蛋白酶基因 这些蛋白酶被分进7 2 家族3 0 个群落 代表除了谷氨酸蛋 白水解酶之外的所有主要的肽酶类群 下面就这些主要的催化酶类 金属蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 半光氨酸蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶 近年来的发现进行分析 主 要集中在一些代表性酶的调节功能上 1 2 金属蛋白酶 就结构和功能而言 金属蛋白酶是六大催化类型蛋白酶中最多样化的 金 属蛋白酶的活性依赖二价阳离子 通常是锌 也有钴和锰 二价阳离子通过激活 水分子亲核攻击易断裂的肽键而起催化作用 它们中的大部分都 l q z i n c i n s 拥有 d 段共有序列 h e x x h 其中两个组氨酸残基作为起催化作用锌的配基而 谷氨酸残基作为常见的支点 m a t r i s i a n 1 9 9 0 g o m i s r u t h 2 0 0 3 根据蛋白质的 性质和锌离子的第三个配基所在的位置 z i n c i n s 被分成不同结构的三个族群 g l u z i n c i n s 下游的谷氨酸残基作为蛋白质的第三个金属离子配基 a s p z i n c i n s 含天冬氨酸残基 和m e t z i n c i n s 含组氨酸或天冬氨酸残基 g o m i s r u t h 2 0 0 3 另一类金属蛋白酶 q i n v e r z i n c i n s 因为在这些蛋白质序列中有一个反向插入的锌 结合位点 h x x e h 2 4 个蛋白群落中发现t s o 多个蛋白家族 拟南芥基因组 中含有1 2 个不同金属蛋白酶群落的8 1 个基因 植物中的金属蛋白酶包括肽链外切 和内切酶 这些蛋白酶位于许多不同的亚细胞部位中 具有有限的降解能力和高 度特异性加工功能 迄今为止 这些酶中只有少数几个被研究 下面将着重对亮 氨酸氨基肽酶和间质的加工肽酶这两个金属蛋白酶进行讨论 1 2 1 亮氨酸氨基肽酶 刺茅 强 j 赢蛋白确睡园a 茹啊玉相豢基因的克瑚 和r 分析 亮氨酸氨基肽酶 l a p m 1 7f a m i l y c l a nm f 广泛地存在于生物体中 在 原核细胞 动植物中都很保守 b a r t l i n ga n dw e i l e r 1 9 9 2 所有被研究的有机体中 活性l a p s 是由六个相同亚基组成的寡聚物 这些亚基的初级结构同样非常保守 的 特别是包含不变的锌结合残基的羧基端 这些残基参与催化作用和形成活性 的同源六聚体所必需 这通过被番茄l a p a 定向诱变证实的f g ua n dw a l l i n g 2 0 0 2 来自不同物种的l a p 的相似性延伸到反应机理和底物特异性 猪 大肠 杆菌和番茄的l a p s 之间的底物特异性比较表明这三种酶都可以有效切割n 端的 亮氨酸 精氨酸 蛋氨酸而不能切割天冬氨酸和甘氨酸残基 人们发现这三种酶 对倒数第二位的氨基酸的偏爱也相似 但是对底物n 端的芳香族氨基酸的容忍性 却不同 g ua n dw a l l i n g 2 0 0 0 2 0 0 2 人们对真核细胞l a p 的功能并未完全了解 动物中的l a p 是晶状体的丰富蛋 白 可能参与晶状蛋白质沉积物的降解 l a p 惊人的稳定性是它们作为动物晶状 体蛋白的先决条件 也观察到植物起源的l a p b a r t l i n ga n dw e i l e r 1 9 9 2 h e r b e r s e ta 1 1 9 9 4 g ue ta 1 1 9 9 9 动物和植物的l a p 可能对于蛋白半衰期的调节是重 要的 这大部分是n 端氨基酸残基影响的 n e n d r u l e v a r s h a v s k y 1 9 9 6 n 端氨基酸残基的裂解可能要么除去 要么暴露一个不稳定的残基 导致各个蛋 白的稳定 或者导致由泛素 蛋白酶体介导的降解定位 然而 番茄中l a p 的反 义抑制和野生型和反义植株蛋白质提取物的比较 不能揭示二维凝胶电泳中蛋白 组分的可重复的差异 p a u t o te ta 1 2 0 0 1 同样 马铃薯中在野生型和l a p 反义植 株之间没有观察到表型变化 h e r b e r se ta 1 1 9 9 4 在反义抑制的马铃薯植株中 l a p 转录减少到检测限度以下 当叶片提取物仍然存在8 0 的活性 因此 缺少 可辨别的表型可解释为带有多余活性的附加肽酶 h e r b e r se ta 1 1 9 9 4 实际上 对拟南芥基因组分析表明在金属蛋白酶m l a l a n y la m i n o p e p t i d a s e s 家族 m 1 8 a s p a r t y la m i n o p e p t i d a s e s 家族 和m 2 4 m e t h i o n y la m i n o p e p t i d a s e s a n d a m i n o p e p t i d a s ep 家族中存在着更多的氨基肽酶 然而 这些家族中只有一个植 物酶被描述过特征 番茄氨肽酶 p a m i n o p e p t i d a s ep 有特异氨基末端x a a p r o 键 因此不可能有助于反义抑制马铃薯叶片残留的l a p 活性 除普通的l a p l a p n 之外 它在所有的植物物种中组成型表达 b a t t l i n g a n dn o s e k 1 9 9 4 c h a oe ta 1 2 0 0 0 一些茄科植物有另外的l a p s 番茄中有 l a p a 1 和a 2 在生殖器官中表达 在正常的发育期和通过十八 烷 醇信号通 路正调节 在一些压力条件下 包括渗透压 受伤和病原体感染 h i l d m a r m e ta 1 1 9 9 2 p a u t o te ta l 1 9 9 3 s c h a i l e re ta 1 1 9 9 5 c h a ne ta 1 1 9 9 9 p a u t o te ta 1 2 0 0 1 l a p 被认为是促进碳源和氮源的流通 这些资源是来自于承担死亡和加强蛋白质 周转的细胞 以考虑到对食草动物和病原体攻击的响应的代谢程序重排 g ue t 刺茅每釜属蛋自首曩基因a 爿时基相寺黾a 因的克商 和分析 a 1 1 9 9 9 研究表i j j l a p 在茉莉酸诱导的衰老中 也起着相似的作i 羽 h e r b e r se ta 1 1 9 9 4 1 2 2 间质加工肽酶和别的m 1 6 肽酶 绝大多数的叶绿体蛋白质都是核基因组编码的 在细胞质中合成分子量较 大的前体蛋白 翻译后转运至叶绿体 前体蛋白的运输依赖氨基末端的定位信号 一转运肽 t r a n s i t p e p t i d e 它被蛋白水解后离开质体间质 一方面 叶绿体蛋 白质非常丰富 另一方面 叶绿体对光合作用 植物发育 生物合成能力都具有 重要作用 转运肽的切除很可能是植物细胞中最重要的翻译后蛋白质修饰 r i c h t e r a n dl a m p p a 2 0 0 2 转运肽的切除是由基质加工蛋白酶 s t r o m a l p r o c e s s i n gp r o t e a s e s p p 催化的 s p p 是一类与p i t r i l y s j n 胰岛素降解酶以及线 粒体加工肽酶b 亚基相似的可溶金属蛋白酶 f a m i l ym 1 6i ne l a nm eo f m e t a l l o p r o t e a s e s v a n d e r v e r ee ta 1 1 9 9 5 r i c h t e ra n dl a m p p a 1 9 9 8 前体蛋白加 工涉及至少三个步骤 前体蛋白最初的识别不依赖s p p 活性 而依赖蛋白酶n 端 结构域和转运肽c 端1 0 1 5 个残基的相互作用 接着 在第一个内切酶水解反应中 成熟蛋白被释放 而转运肽仍与s p p 结合 第二个裂解反应破坏了转运肽c 端结 合位点 亚碎片被释放 两个水解反应都依赖于s p p 氨基端附近的h x x e h 锌结 合结构 r i c h t e ra n dl a m p p a 1 9 9 9 2 0 0 2 2 0 0 3 拟南芥中单个s p p 基因的反义抑 制表明s p p 是叶绿体蛋白质运输器的基本组成部分 对叶绿体生物发生和植物生 存是必需的 z h o n ge ta 1 2 0 0 3 有趣的是 连接在前导肽氨基端的g f p 叶绿体 运输在s p p 反义株系中是受损的 这表明叶绿体基质中s p p 介导的蛋白质成熟 不是一个独立事件 而是影响运输途径的早期步骤 z h o n ge ta 1 2 0 0 3 尽管大量蛋白质运输进叶绿体一据体外铁氧 化 还 原 蛋白前体估算 摄入率是每个叶绿体每分钟2 5 x 1 0 4 个蛋自质 p i l o ne ta 1 1 9 9 2 但没有观察到 裂解的前导肽在体内或体外积累 因此 推测来自叶绿体基质的前导肽的选择性 消失的蛋白水解系统 暂时把它作为可溶性a t p 依赖的金属蛋白酶 r i c h t e ra n d l a m p p a 1 9 9 9 2 0 0 2 与在线粒体中相似 一个蛋白酶必须切除靶序列才能生存 这可能是有害的 因为它们的可透过膜活性 实际上 近来前序列降解的蛋白酶 p r e p 已经用层析法从洋芋线粒体中分离出来 并认为是锌依赖金属蛋白酶 z n m p s t a h le ta 1 2 0 0 2 有趣的是 发现拟南芥的同源物 a t z n m p 能 够在体外裂解线粒体和叶绿体的靶序列 而且在体内定位到线粒体和叶绿体 b h u s h a ne ta 1 2 0 0 3 m o b e r ge ta 1 2 0 0 3 这些数据强有力地表明 靶序列的降 解是不依赖a t p 的 是由z n m p 催化 这是一类带有双重功能 不确定的定位于 叶绿体和线粒体上的金属蛋白酶 刺杀 金属蛋白矗喙困及痈程相关基因的史捌晰析 碰巧的是两个催化靶序列消除和降解的蛋白酶是高度相关的 s p p 和z n m p 分别属于m e 族的m 1 6 b 和m 1 6 c 亚家族 剩余的亚家族m 1 6 a 由哺乳动物胰岛 素降解酶同源物组成 拟南芥基因组中有两个代表 番茄的同源物在筛选能够裂 解多肽愈伤激素系统素的蛋白酶而克隆得到 p e a r c ee ta 1 1 9 9 1 表明在受伤反 应中有调节作用 在大肠杆菌中表达的重组酶表明在体外裂解和使系统素失活 据称这个功能在体内仍然存在 m 1 6 家族中所有的蛋白酶独特特征似乎是作为底 物特异性的决定者 缺少对特定氨基酸的偏爱 可能的底物似乎被高级结构特征 或缺乏所识别 而不是主要氨基酸序列的特异结构 k u r o c h k i n 2 0 0 1 r i c h t e r a n d l a m p p a 2 0 0 2 m o b e r ge ta 1 2 0 0 3 1 3 丝氨酸蛋白酶 丝氨酸蛋白酶类是植物中最大类的蛋白酶 m e r o p s 数据库为拟南芥列举 t 2 4 8 个酶 代表了已知1 2 家族中的8 个群落 它们中的三个蛋白群落 胰凝乳蛋 白酶p a s 枯草杆菌蛋白酶 羧肽酶d s c 都有一个共同的反应机制 该机制基于研究得很清楚的催化三联征 包括一个丝氨酸 一个天冬氨酸和一个 组氨酸残基 但是三个蛋白群落的蛋白折叠和三个重要的催化残基的初级结构 的排列是不一样的 这提供了一个趋同进化惊人的例子 在这章中找来讨论的酶 是s b s u b t i l a s e s 群落的s 8 a 家族和s c 群落 c a r b o x y p e p t i d a s e s s 1 0 家族 这两 个蛋白家族一起占据了拟南芥中超过半数的丝氨酸蛋白酶 两类家族的规模在植 物中比动物中大 可能在进化过程中指向获得新的植物特异性功能 1 3 1 丝氨酸羧肽酶 丝氨酸羧肽酶 s c p 功能已经很明确 其功能就是进行蛋白转化 它发生 在种子萌发和受伤的时候进行氮源的转运 它们的多样性部分归因于底物特异性 的差别 d a l d e g a ne ta 1 1 9 9 4 m e h t ae ta 1 1 9 9 6 m o u r ae ta 1 2 0 0 1 g r a n a te ta 1 2 0 0 3 s c p s 也参与了油菜素内酯信号 l ie ta 1 2 0 0 1 种子发育 c e r e o se ta 1 2 0 0 3 细胞程序性死亡时细胞成分的自我分解 d o m i n g u e za n dc e j u d o 1 9 9 8 d o m i n g u e ze ta 1 2 0 0 2 然而s c p s 令人惊讶的多样性可能更应该解释为新的非蛋