（应用化学专业论文）芦荟汁中胶原酶抑制成分的分离纯化与抑制作用研究.pdf

摘要 摘要 本论文主要对芦荟汁中胶原酶活性抑制成分进行了研究，包括胶原酶活性和抑制剂抑 制效果测定方法、芦荟汁干粉中有效抑制成分的分离纯化、结构鉴定与抑制效果测定，初 步探讨了可能的抑制机理并进一步寻找到其它具有抑制作用的植物提取物。 实验首先研究了羟脯氨酸化学比色法的影响因素，确定实验条件：1 0 m l 待测溶液中 加入2 0 m l 异丙醇，1 0 m l 氧化剂氧化5 m i n ，再加入2 0 m l 显色剂，6 0 加热显色2 0 m i n ， 冰浴冷却5 m i n 后测定5 6 1 n m 处的吸光度，根据标准曲线法计算羟脯氨酸质量。 以羟脯氨酸含量测定为检测手段，初步研究了胶原酶对胶原蛋白的酶解反应过程，并 在此基础上设计了胶原酶活性及抑制剂抑制效果测定方法：胶原蛋白1 0 m g ，胶原酶液浓 度0 1 m g m l ，反应温度3 7 o ；t r i s h c l ( 三羟甲基氨基甲烷一盐酸) 缓冲溶液中胶原酶 催化降解固态不溶性胶原蛋白分解为可溶性肽进入溶液，反应终止后滤除未反应胶原蛋 白，滤液加浓盐酸密封加热酸解后测定其中游离羟脯氨酸的质量；抑制剂与空白实验的羟 脯氨酸质量差值体现出抑制剂的抑制效果。 实验发现芦荟汁干粉中葸醌苷类化合物具有明显的胶原酶抑制效果；芦荟汁干粉先用 热水煎煮，滤液经乙酸乙酯萃取，除去溶剂后得粗提取物；该粗提取物再经硅胶柱层析分 离多次，得到含有两种主要物质的混合物；最后经半制备高效液相色谱分离出两种纯物质； 经定性实验和h p l c 、u v 、i r 、m s 、1 hn m r 谱图鉴定化学结构，分别确定为芦荟素和 异芦荟素。抑制效果测定结果表明两者具有相似的抑制效果并随质量浓度的增大而近似线 性升高，l m g m l 时百分抑制率分别达到4 2 4 和3 5 o ，低浓度下的抑制效果高于常见 抑制剂四环素。 根据文献中胶原酶抑制机理z n 2 + 螯合理论，初步分析认为芦荟素、异芦荟素可能 也符合该理论，抑制作用可能与其分子结构有关；后续实验还发现芍药、川芎提取物也具 有胶原酶抑制效果。 关键词：胶原酶；抑制；羟脯氨酸；芦荟素；异芦荟素 a b s t r a e t a b s t r a c t i nt h i sp a p e r ，w em a i n l ys t u d i e dt h ec o l l a g e n a s ei n h i b i t o r yi n g r e d i e n t sf r o mt h es a po fa l o e ， i n c l u d i n gt h em e t h o do fc o l l a g e n a s ea c t i v i t ya n di n h i b i t i o nt e s t ，t h ee x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no f u s e f u li n g r e d i e n t s ，c h e m i c a ls t r u c t u r ei d e n t i f y ，i n h i b i t i o nr a t i ot e s t ，p r i m a r i l yd i s c u s s e dp o s s i b l e i n h i b i t o r ym e c h a n i s ma n do t h e ri n h i b i t o r yp l a n t se x t r a c t si nf u r t h e rs t u d y f i r s to fa l l lw es t u d i e dt h ee f f e c t i v ef a c t o r so fh y d r o x y p r o l i n ep h o t o c o l o r i m e t r i cm e t h o d ， c o n f i r mt h et e s tc o n d i t i o na s ：1 0 m ls a m p l ea d d2 0 m li s o p r o p a n 0 1 1 o m lo x i d a t i o nr e a g e n t a n do x i d a t e d5 m i n ，t h e na d d2 。0 m lc o l o rr e a g e n t ，c o o l e di ni c yw a t e r5 m i na f t e rh e a t e d2 0 m i na t 6 0 ；t e s ti t su va b s o r p t i o na t5 61n m ，c a l c u l a t et h eh y d r o x y p r o l i n em a s sb yi t ss t a n d a r dc u r v e u s et h eh y d r o x y p r o l i n ep h o t o c o l o r i m e t r i cm e t h o d ，w es t u d i e dt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e n c o l l a g e n a s ea n dc o l l a g e n ，t h e nd e s i g n e dt h em e t h o do fc o l l a g e n a s ea c t i v i t ya n di n h i b i t i o nt e s t ： 10 m gc o l l a g e nw i t ho 1m g m lc o l l a g e n a s es o l u t i o na t3 7 0 * ci n 嘣s h c lb u f f e r , c o l l a g e n a s e d e g r a d e dt h ei n s o l u b l ec o l l a g e nt o s o l u b l ep r o t e i ni n t ot h eb u 能r ，f i l t r a t e dt h eu n d e g r a d e d c o l l a g e na n da d dh c lh e a t e di nas e a l e dt u b e t h e nt e s tt h eh y d r o x y p r o l i n e sm a s si nt h et u b eb y h y d r o x y p r o l i n ep h o t o c o l o r i m e t r i cm e t h o d c o l l a t e r a l l yc a l c u l a t e d t h ec o l l a g e n sm a s s t h e d i f f e r e n c eb e t w e e nb l a n ks a m p l ea n di n h i b i t i o ns a m p l ei n d i c a t e dt h ee f f e c to fi n h i b i t o r i n h i b i t o r yt e s tf o u n dt h ea n t h r a q u i n o n e sg l y c o s i d em a t e r i a l si na l o es a ph a v eo b v i o u s l y c o l l a g e n a s ei n h i b i t i o n ；a l o ep o w e r w a sd e c o c t e db yh o tw a t e r , e x t r a c t e db ye t h y la c e t a t ea n dg o t c r u d ee x t r a c ta f t e rd i s s o l v e n t ；t 1 1 i sc r u d em a t e r i a lw a ss e p a r a t e ds e v e r a lt i m e sb ys i l i c ac o l u m n a n dg o ta ne x t r a c tm a i n l yc o n t a i nt w oi n g r e d i e n t s ，t h e ni s o l a t e dt ot w op u r ei n g r e d i e n t sb ys e m i p r e p a r a t i v eh p l c u vi r ，m s & 1 hn m rt e s t e dt h e i rc h e m i c a ls t r u c t u r e ，c o n f i r m e d a s b a r b a l o i n & i s o b a r b a l o i nr e s p e c t i v e l y i n h i b i t i o nr a t i ot e s tf o u n dt h e yh a v es i m i l a ra n dd o s e d e p e n d e n ti n h i b i t o r ya c t i v i t y , r e s p e c t i v ei n h i b i t i o nr a t i ow a s4 2 4 & 3 5 0 a tl m g m l ，h i g h e r i n h i b i t i o nr a t i oi nl o wc o n c e n t r a t i o nc o m p a r e dw i t ht e t r a c y c l i n e a c c o r d i n gt ot h ec o l l a g e n a s ei n h i b i t o r ym e c h a n i s mo fz n 2 + c h e l a t i n gt h e o r y , w ep r i m a r i l y c o n s i d e r e db a r b a l o i n & i s o b a r b a l o i na l s of o l l o wt h i st h e o r y , t h ei n h i b i t i o nm a y b ed u et ot h e i r s p e c i a lc h e m i c a ls t r u c t u r e i nt h em o l e c u l e f u r t h e rs t u d i e sf o u n dp a e o n i al a c t i f l o r a & l i g u s t i c u mc h u a n x i n ge x t r a c t i o na l s oh a v ec o l l a g e n a s ei n h i b i t i o n k e y w o r d s ：c o l l a g e n a s e ，i n h i b i t i o n ，h y d r o x y p r o l i n e ，b a r b a l o i n ，i s o b a r b a l o i n i l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是泰人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我- - n 工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名： 黑堑 日 期： 2 理z ! 呈z ：碰 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 星坚 导师签名： 盈鱼奠 日 期： 2 盟呈：! 乙繇 绪论 第一章绪论 引言 胶原蛋白是一种由动物成纤维细胞分泌的生物大分子，广泛存在于皮肤、肌腱、软 骨、内脏、血管等组织中，是脊椎动物体内含量最丰富、分布最广的结构蛋白质，具有 支撑器官、保护机体的功能。 胶原酶是一种z n 2 + 、c a 2 + 依赖性的基质金属蛋白酶，能在一定温度、p h 及离子强 度等条件下，降低胶原蛋白分子三螺旋结构的稳定性，使其能够被组织中的其它蛋白酶 进一步降解为肽和氨基酸。胶原酶主要参与组织重建、修复、细胞迁移、血管生成、炎 症反应、伤口愈合、肿瘤侵袭和转移等，在人体组织的正常代谢及减轻病理损坏中起着 重要作用。 正常组织中胶原酶抑制剂能有效调节胶原酶的活性，两者之间的动态平衡对保持组 织内环境的稳定具有重要意义。这种平衡一旦被打破，活性过高的胶原酶就会过度降解 组织中的胶原蛋白，破坏细胞与基质、细胞与细胞之间的正常关系。为降低过高活性胶 原酶对正常组织的损坏，就需要依靠外源性抑制剂抑制胶原酶活性。 中草药在几千年的应用中已经积累了许多经验，药效与安全性也得到长时间的验证； 从中提取出的多种活性物质，不仅化学结构和生物活性可以得到保持，而且又具有独特 的功效，药效持久稳定，适用面广，副作用小。我国是中草药的发源地，历史悠久，资 源丰富，为天然提取物在医疗、美容等领域的应用与研究提供了广阔的发展空间。 1 1 胶原蛋白与胶原酶简介 1 1 1 胶原蛋白 胶原蛋i 兰l ( c o l l a g e n ) 是一种由动物成纤维细胞合成的白色、透明、无分支纤维，主要 存在于脊椎动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带、血管中，是结缔组织中极其重要 的结构性蛋白质，起着支撑器官、保护机体的功能，也是组成细胞间质的重要功能性蛋 白质。 胶原蛋白是哺乳动物体内含量最多、分布最广的结构性蛋白质，约占蛋白质总量的 2 5 - - 3 0 ，相当于体重的6 t 1 1 。不同组织中的胶原蛋白，其化学组成和结构都有差异， 根据外观差异可以分成纤维状胶原蛋白、网状胶原蛋白、丝状胶原蛋白等，各形态胶原 又由多种不同类型的胶原分子组成【2 】( 表1 1 ) ，不同类型的胶原分布在体内多种组织中 ( 表1 2 ) 。 江南人学碗i 岸怔论立 表l - i 腔原的形态分类 j 坐：! ：! 旦! 盟! ! ! ! ! ! ! 竖! 胶原的形态胶原的类型 嵌l 之备型腔原在姐数中的分布 t a bi - 2 t h e d i s t r i b u t i o n o f c o l l a g e n i n t i s s a e 腔原类型组【织分布 i 皮肤、骨骼、角膜、肌腱 软骨、玻璃体 i l i 皮肤、【f 【l 管壁 嬉底膜、胎斑 v 皮肤、胎盘、羊膜 皮肤、角膜 羊膜、皮肤 内皮细胞 软骨 x 软骨 软骨、脊牲盘 皮肤、腱 胶原蛋白分子长约3 0 0 r i m 、直径约1 5 r i m 、由3 条相同或不同的肚链( a 链，矗璇 螺结构) 相互缠绕形成右于螺旋结构的原纤维( 罔11 ) ，每个螺旋结构区大小约86 r i m ， 平均分子量3 0 0 k d a ；原纤维先聚集形成纤维，然后再形成更人的纤维束pj 。每条肚链上 约古有1 0 0 0 个氨基酸残基，井具有高度相似的氨筚酸结构a 链除n 、c 末端的1 6 2 5 个残基顺序以外，其余部分母隔两个其它氨罄酸残基就有一个甘氨酸，其序列可用 g l y - - x - - y 表示( g l y 为甘氨酸，x 常为脯氨酸，y 常为羟脯氨酸或羟赖氨酸) 4 1 ( 图 12 ) 。胶原蛋自的氰基酸组成见表1 3 ，其r l 甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸古量比较高，占 总量的1 ，3 以上，并古有其它蛋白质巾小存在或含量很少的脯氨酸、羟脯氨酸和羟赖氨 酸，占总量的1 5 以上：但色氪酸，酪氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸的含量很少，届于不完 全蛋白。胶原蛋白中的羟腑氨酸和羟赖氨酸不是以现成的形式参与胶原的合成，而是从 已成的脯氨酸和赖氨酸经羟化酶作用转化而来：羟脯氨酸约占氨基酸总星的1 0 1 4 ，羟赖氨酸约为1 ，两者都是环状氨壮酸，锁住了整个腔原分子，使胶原蛋白具 有微弹性和很高的抗张强度。胶原蛋白属于硬蛋白。不溶于水、稀酸、稀碱溶液和般 的溶剂并具有耐蛋广酶的作j j 。 图1 1 胶原蛋白的 三螺旋蛄掏 f i gl 1t h e t - h e l i x s 1 n l c t u r e o f c o l l a g e n 1 j ，l v - - 1 , ov 、一：，啦! ， 由 一 ，一 t晌 囤12 腔原蛋白氨基醯序列蛄掏 f i 9 12 t h e a m i n o a c i ds e q u c n c e o f c o l l a g v n 绪论 表1 - 3 胶原蛋白的氨基酸组成 t a b 1 3t h ea m i n oa c i dc o m p o s eo fc o l l a g e n 氨基酸组成 w 氨基酸组成 w 人体中胶原蛋白共有1 3 种，其中皮肤中含有6 种，都是由成纤维细胞生成并具有 组织特异性。皮肤的主要成分是蛋白质，此外还有水份、脂类、无机盐和碳水化合物等； 表皮层及其毛发的蛋白质主要是角蛋白，真皮层的蛋白质主要是纤维状胶原蛋白，含量 达到8 0 一8 5 ，其中以i 型胶原蛋白为主，还有少量i i i 型胶原蛋白、弹性蛋白、网硬蛋 白、白蛋白和类粘蛋白等1 5 】。胶原蛋白的代谢具有两个特点：1 更新缓慢；2 成年动物 胶原蛋白的分解大于合成；胶原蛋白的过度分解和合成减少是机体和组织器官老化的重 要特征之一【6 】。年轻时胶原蛋白含量较丰富，当皮肤衰老时，胶原蛋白含量逐渐降低， 导致皮肤出现皱纹。 胶原蛋白为生物体提供了一种机械支撑作用，维护器官与组织的完整性，保障其正 常功能。胶原蛋白在人体组织内的含量、分布、代谢及其动态变化异常会引起组织纤维 化、骨质疏松、动脉瘤和椎间盘突出等疾病。同时胶原蛋白以其天然低毒性、低抗原性、 低免疫性、良好的生物相容性等优点，在医药、食品、生物、保健品、化妆品等领域都 具有重要作用【7 9 1 。 1 1 2 胶原酶 胶原酶( c o l l a g e n a s e ，m m p 1 ) 是一种z n 2 + 、c a 2 + 依赖性的基质金属蛋白酶( m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e ，m m p ) ，能在一定温度、p h 及离子强度等条件下，降低胶原蛋白分子 三螺旋结构的稳定性，改变二级结构，为进一步被其它蛋白酶降解奠定基础，在结缔组 织的j 下常代谢及病理损坏中起重要作用l l 。 1 9 6 2 年c r o s s 和l a p i e r e 首次发现胶原酶，也是第一个被确定的m m p ，全称为成纤 维细胞型胶原酶( f i b c l ) 。胶原酶分布广泛，可表达于各种动物体内的成纤维细胞、角 质细胞、内皮细胞、单核巨嗜细胞、成骨细胞和软骨细胞等。胶原酶以5 7 k d a 和5 2 k d a 两种酶原形式分泌，活化时从n 末端裂解下一段8 1 个氨基酸的多肽，生成稳定的4 2 k d a 活性酶；能特异性的作用于i ，i i ，i i i 型胶原蛋白的三螺旋结构，裂解距氨基末端0 【1 链 g l y 7 7 5 和i l e 7 7 6 肽键，把胶原大分子分解成3 4 和1 4 的两个片段i l 。 胶原酶由信号肽区域、前肽区域( 酶被激活时除去，主要作用是保护酶的稳定性) 、 含z n 2 + 结合催化区( 两个保守的组氨酸是锌离子结合的配体并含钙离子结合位点，含有 一个半胱氨酸开关，可封闭或暴露活性中心二价离子，并维持酶蛋白的稳定) 、铰链区 江南人学硕士学位论文 域、c 末端血红素结合蛋白区域( 决定其底物特异性，参与大分子底物的识别及同t i m p 结合) 等5 个高度保守的相同结构片段组成【1 2 1 ( 图1 3 ) 。 活 催化活性中心 图1 3 胶原酶的结构 f i g 1 3t h es t r u c t u r eo f c o l l a g e n a s e 胶原酶具有以下特性：可降解细胞外基质( e x t r a c e l l u l a rm a t r i x ，e c m ) 成分；以 酶原的形式分泌，在适当条件下被激活而发挥作用；在活性位点存在锌离子并需要 钙离子维持其活性与稳定性；在p h 为中性时发挥作用；活性可被抑制剂抑制。 胶原酶在维持细胞外基质的合成与降解平衡上发挥着重要作用，正被广泛应用于组 织培养细胞分离、培养和移植，手术后加速伤口愈合，皮肤慢性溃疡、褥疮、灼伤等疾 病的清疮、脱痂，预防和治疗瘢痕疙瘩以及注射治疗治疗腰椎间盘突出、眼角膜溃疡和 前列腺肥大等疾病【1 3 - 15 1 。 1 2 胶原酶活性与羟脯氨酸测定方法简介 1 2 1 胶原酶活性测定方法 测定胶原酶抑制剂的抑制效果，首先需要建立胶原酶活性测定方法。文献报道的方 法有胶原悬浮分析法、粘度法、放射性标记法、活性染料标记法、空斑法、电泳法、荧 光法、f a l p g a 法、羟脯氨酸法、甘氨酸法等。胶原酶底物有液态胶原蛋白、固态胶原 蛋白和人工合成肽等。 ( 1 ) 胶原悬浮分析法l l 6 j 不溶性胶原在o 0 5 m o l m l i r i s h c l 缓冲液( p h 7 4 ，含5 m m o l m lc a c l 2 ) 中3 7 c 恒温 3 0 m i n ，取上清液加入胶原酶液反应，1 h 后加h c l 终止反应；紫外a 2 1 5 和a 2 2 5 吸收差标 准曲线法测量上清液中可溶性蛋白含量，根据溶液中胶原水解量的多少来判断胶原酶的 活性。 ( 2 ) 电泳法【1 7 j 由正常或重组的组织中提取的胶原酶其所带电荷密度不同、泳动率不同、电泳缓冲 液的p h 值和离子强度对胶原酶的影响不同，从而可获得不同的分离效果。醋酸纤维素 膜( 2 x 8 c m ) 为支持介质浸泡于s d s 一磷酸电泳缓冲液中，在膜无光泽面上点样；0 6 1 2 m a c m 通电5 0 m i n ，电泳完毕后取出薄膜放在固定液中固定，再放入染色液中染色： 将着色的各胶原酶区带剪下，放入脱色液中脱色，再加入洗脱液将各染色带洗脱下来。 测定样品色带光密度与胶原酶标准溶液光密度的比值乘以胶原酶标准液含量再乘以时 间，计算出各样品的胶原酶活性。 4 绪论 ( 3 ) 放射性标记法【1 8 】 利用5 0 的二嗯烷能够沉淀非变性的胶原，但不能沉淀变性的胶原的原理来分离胶 原的降解产物，然后对降解产物的放射性作定量测定。以1 4 c 标记的可溶性胶原为底物， 将酶一底物作用后分离，所得的上清液进行闪烁计数，表征酶活性。将一定量1 4 c 标记 的i 型胶原与酶溶液混合，在3 5 孵育2 4 h ，然后加入二氮杂菲( 溶于5 0 的二嗯烷中) ， 终止酶反应，反应液在3 5 放置1 h ，然后将反应液加入到二嗯烷后，充分混匀，室温 下离心，取上清液放入闪烁杯中，加入闪烁液，置于液体闪烁计数仪中计数，胶原酶活 性用d p m 值表示。 ( 4 ) 空斑法【1 8 1 用生理盐水将胶原酶配成4 0u m g 的溶液，i 型胶原蛋白和琼脂糖溶于0 0 5m o l l 的“s h c l 缓冲液，胶原蛋白溶液与琼脂糖溶液各2 5 m l 于3 7 混匀铺于载玻片上， 凝固成胶后，在凝胶上打孔以测定胶原酶的反应曲线。将试验样品转入凝胶中相应的孔 中，然后将凝胶置于3 7 。c 温育2 4 h 。用l 氯化钠溶液洗涤凝胶后，再将凝胶置于0 1 考马斯亮蓝r 2 5 0 溶液染色，最后脱去多余染料，用游标卡尺测量各孔周围空斑直径， 空斑直径与胶原酶活性成正比。 ( 5 ) 荧光法【1 9 】 2 9 mi 型胶原蛋白溶液中加入一定量胶原酶溶液( 3 0 0 m u ) ，再加抗生素溶液，o 1 m o l l s h c l 缓冲液，3 5 。c 反应3 小时；反应前后各取2 5 k t l ，加0 2 m o l l 磷酸缓冲液 ( p h 6 8 ) 4 m l ，加荧光胺试剂( o 1 m g m l 丙酮) 2 m l 。激发波长3 9 0 n m ，测定波长4 7 5 n m ， 荧光分光光度计测定反应前后荧光强度差值。 ( 6 ) f a l g p a 法【2 0 】 n 一( 3 - 2 一f u r y l a c r y l o y o ) - l e u - g l y p r o - a l a ( f a l g p a ) 是一种专用于胶原酶活性测定的 人工合成肽。用5 0 m m o l m lt r i c i n e ，0 4 m o l ln a c l ，1 0m m o l m lc a c l 2p h = 7 5 的缓冲液 调节底物f a l g p a 的浓度，使其在波长3 0 5 n m 处的吸光值在o 7 左右；调节待测胶原酶 浓度，使其在波长2 0 8 n m 处的吸光值小于0 3 ，波长3 0 5n n l 处的吸光值小于0 1 。取酶 样品5 1 t l 加入9 5 1 t l 底物溶液中，2 5 反应l m i n ，测量反应前后3 0 5 n m 处光吸收值的 变化，以f a l g p a 浓度减少l i t m o l l 作为一个活性单位。 ( 7 ) 考马斯亮蓝法【2 l 】 将1 0 0 u 胶原酶4 0 此和待测的药液标本4 0 此充分混合均匀加入胶原板微孔之中， 每种药物5 个孔，放入恒温箱3 7 c 孵育2 4 h 后，用5 0 m m o l le d t a - - n a 2 终止作用，考 马斯亮蓝染色后用g x m - - 2 0 1 酶标光度计检测，波长5 9 0 n m ，以双蒸水、盐水和1 0 0 u 胶原酶作阳性和阴性对照。 ( 8 ) 羟脯氨酸法【2 2 】 羟脯氨酸是胶原蛋白的特异性氨基酸，在同一批次胶原蛋白中含量恒定；耐s h c l 缓冲溶液中，胶原酶催化降解胶原蛋白：通过测定羟脯氨酸质量，间接计算出反应的胶 原蛋白质量表示胶原酶的活性。 ( 9 ) 甘氨酸法1 2 3 l 1 i i i 型酸溶性胶原蛋白在o 1 m o l lt r i s h c i ( p h = 7 2 含5 0 m mc a c l 2 ) 缓冲液中3 7 c 反应，茚三酮法测定反应所释放的水溶性氨基酸、短肽，通过甘氨酸的质量计算酶活。 垩堕查兰堡主兰竺堡- 文 以上多种胶原酶活性测定方法中，有的方法需要特殊仪器，有的方法虽i i 钡, 1 定但不 是特异的方法，还需与其它方法联用进行验证。本实验受仪器条件、知识背景限制，决 定选择国内较多采用的比较简便的羟脯氨酸法。 1 2 2 羟脯氨酸测定方法 羟脯氨酸测定方法主要有：化学比色法、氨基酸自动分析仪法、反相h p l c 法、毛 细管电泳一激光诱导荧光法等。 ( 1 ) 化学比色法【2 4 】 游离的羟脯氨酸被氯胺t 氧化生成含吡咯环的氧化物，再用高氯酸将多余的氯胺t 破坏，同时使氧化物于对二甲基氨基苯甲醛反应，生成红色化合物，紫外可见分光光度 计5 6 1 n m 下测定吸光度，通过标准曲线测定羟脯氨酸的含量。 ( 2 ) 氨基酸自动分析仪法【2 5 j 采用6 3 0 0 黄金系统氨基酸分析仪，氨基酸通过强酸性阳离子交换树脂对氨基的吸 附、洗脱速率不同而分离。检测条件：n a 柱( 1 2 c m x 4 0 m m ) ，流动相n a - a ，流速1 4 m l h ； 二甲亚砜与茚三酮显色剂，流速6 m l h ，柱温4 8 ；进样量5 0 9 l ，比色波长5 7 0 n m 。 ( 3 ) 反相h p l c 法【2 6 j 胶原蛋白经酸水解后生成含羟脯氨酸的氨基酸混合物，检测条件：2 ，4 二硝基氯苯 柱前衍生，c 1 8 色谱柱，流动相：0 0 1 m o l l 乙酸钠一乙酸缓冲液( p h 6 o ) 一乙腈( 8 0 ：2 0 ) ， 紫外检测波长3 6 0 n m 。 ( 4 ) 毛细管电泳一激光诱导荧光法【2 7 l 肌腱细胞中的胶原蛋白碱水解生成氨基酸，经异硫氰酸荧光素( f i t c ) 衍生：激光诱 导荧光检测一毛细管电泳仪，氦氖激光器发射波长5 4 3n l ，5 9 0n l n 波长处采集荧光。 电泳缓冲液为2 0 m m o f lp b s ( p h = 1 0 0 ) ，电泳电压1 2k v ，温度2 2 ；电动进样( 1 5k v ， 1 0s ) ，进样端为正极；未涂渍毛细管柱长6 0c m ，有效长度5 2c m ，内径1 0 0 斗m 。以进 样液中羟脯氨酸浓度为横坐标，相对荧光强度h , ( f i t c - - 羟脯氨酸比罗丹明b ) 为纵坐标 绘制校准曲线。 以上几种方法中，化学比色法虽然比较古老、影响因数多、精度略低，但不需特殊 仪器、操作简便，测定时间短，因此根据本实验条件和要求选择化学比色法。 1 3 胶原酶抑制剂 1 3 1 胶原酶抑制剂的应用价值 胶原酶抑制剂是指能有效抑制胶原酶活性的物质，主要分为组织基质金属蛋白酶抑 制剂( t i s s u ei n h i b i t o ro fm e t a l l o p r o t e i n a s e ，t i m p ) 矛i 化学合成抑制剂两大类。t i m p 是人体 组织中分泌的主要胶原酶抑制物，在正常生理状态下，胶原酶与t i m p 之间保持动态平 衡，共同协调细胞外基质( e c m ) 的降解与重建，维持组织结构的完整和内环境的稳定。 当有过量e c m 产生时能被胶原酶降解，同时t i m p 又可以调节胶原酶的活性，使正常 组织不受损害。一旦受外界影响打破了两者之间的平衡，活性过高的胶原酶就会过度降 解组织中的胶原蛋白，破坏细胞与基质、细胞与细胞之间的正常关系；这时就需要其它 6 绪论 抑制剂抑制胶原酶活性，降低胶原酶对正常组织的破坏【2 8 1 。 胶原酶与t i m p 的平衡一但在调控基质重塑和血管生成过程中遭到破坏，就会导致 创伤愈合延迟或纤维化。皮肤创伤愈合过程中细胞迁移、肉芽组织形成、新血管生成和 基质重塑都要求控制周围基质的溶解，而t i m p 作为胶原酶的抑制剂能有效地抑制胶原 酶诱导的细胞外基质降解，具有重要的调控作用。研究表明在急性创伤愈合中t i m p 1 ，3 分别表达于正常愈合伤口3 5 天的增生上皮及角朊细胞中参与基质代谢，而t i m p 2 4 表达不明显；与急性创伤愈合相比慢性创伤伤口中t i m p 1 ，2 ，3 的表达均降低，故t i m p 的不足可导致不愈合或慢性伤口的形成，此时就需要其它类型的抑制剂辅助t i m p 降低 胶原酶的活性j 。 e c m 的蛋白酶解是皮肤创伤愈合过程中修复与重塑的基本特征之一，胶原酶与其抑 制剂间的平衡在创伤愈合过程中可能起着至关重要的作用。与急性创伤相比，不愈合的 静脉性溃疡和压力性溃疡面的渗液中含有高水平的已激活的胶原酶和低水平的t i m p 1 。 同样，在慢性创伤中角朊细胞表达t i m p 1 ，而胶原酶的表达并无质的差别，这说明过度 的胶原蛋白酶解延缓了静脉性溃疡的愈合【3 。 沈敏华1 3 l j 发现牙龈组织中胶原酶活性与牙周病关系密切。胶原蛋白是牙周组织的主 要结构蛋白，占齿龈总蛋白的6 0 年d 牙槽骨有机质的9 0 以上。胶原酶主要存在于牙周 炎病人结合上皮的结缔组织中，且胶原酶含量与活性都与对照组之间有显著差异，可见 宿主细胞来源的胶原酶参与牙周组织的降解、附着丧失，对牙周组织具有破坏作用。牙 龈有炎症时，龈沟液中能检测到m m p 1 ，2 ，3 ，8 ，9 的活性增加，而且随着牙龈炎症程度加 重，其酶活性反而增加。患牙周疾病时，牙周部位非活性前胶原酶转变成活性胶原酶的 量增多，活性胶原酶水平增高造成了结缔组织破坏、附着丧失及牙槽骨吸收是牙周袋形 成的关键环节，因此抑制胶原酶活性是牙周疾病时胶原降解的关键因素。 椎间盘是一个无血管组织，其内存在调节基质代谢的酶系统，基质的分解主要是依 靠各种降解酶的作用，其退变与酶系统的激活有密切关系。椎间盘内各种降解酶一般与 抑制剂共同存在，呈潜伏状态，可能由于椎问盘内环境改变，激活了潜伏状态的降解酶， 使椎间盘基质分解加速，导致椎间盘退变。椎间盘内胶原酶来源于椎间盘内软骨细胞， 正常椎间盘中胶原酶活性处于较低水平和以潜伏状态存在，而突出椎间盘胶原酶活性明 显高于正常，随着椎间盘老化，椎间盘内环境的改变和不断受到机械作用是椎间盘细胞 崩解，胶原酶抑制物合成减少，溶酶体内的组织蛋白酶释放，激活潜伏状态的胶原酶， 使椎间盘基质分解加速，其生物力学性能减退，是导致椎间盘突出的重要原因。如能减 少椎间盘内胶原酶的含量、抑制其活性，将可防止或减缓椎间盘的退变【3 引。 张永波等1 3 3 j 研究了胶原酶等几种基质金属蛋白酶的表达，发现动脉粥样斑块与非病 变的动脉有着不同的基质金属蛋白酶表达形式，在非病变的动脉中，只有明胶酶a 在血 管平滑肌细胞表达，而没有检测到其他m m p 。在动脉粥样硬化病变中，则可检测到胶 原酶等多种m m p ，可见于病变的巨噬细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞中，表明胶原 酶等几种基质金属蛋白酶参与了动脉粥样硬化的发生和发展中的基质重建过程。 王辉兵 3 4 1 认为在胆脂瘤型中耳炎中骨基质降解是由于临近骨细胞( 破骨细胞或成骨 7 江雨大学硕i l ：学位论文 细胞) 、肉芽组织或胆脂瘤上皮释放的蛋白水解酶胶原酶所致，而且胆脂瘤中基底膜 超微结构的紊乱也与胶原酶的活性有关。纤溶酶原激活物纤溶酶可激活胆脂瘤组织中胶 原酶的前酶原，使有活性的胶原酶在胆脂瘤骨破坏过程中发挥重要作用。钟小军【3 5 1 发现 胶原酶在肺癌肿瘤组织中有过度表达，阳性率为4 1 - - 6 8 ，明显高于周围f 常支气管 上皮。针对胶原酶进行靶向治疗是近年来的研究热点，国外有研究者将选择性胶原酶抑 制物m m i 1 6 6 长期应用于小鼠肿瘤模型，发现其具有明显的抑制肿瘤作用。刘艳【3 6 】发 现类风湿性关节炎患者的胶原酶水平明显比骨性关节炎和j 下常对照组增高，且在关节的 滑膜血管一软骨结合处及其他部位有过度表达，而t i m p 的表达明显低于骨性关节炎， 活性过高的胶原酶会导致软骨的过度降解并加速血管再生。 综上所述，高活性胶原酶与多种疾病相关，其抑制剂在疾病治疗方面具有重要作用。 1 3 2 胶原酶抑制剂的研究进展 由于从动物组织中分离纯化t i m p 难度较大，也不易保存，因此胶原酶抑制剂的研 究重点主要是已知药物的抑制效果测定，临床应用和化学合成抑制剂的开发。 吴智群等【37 j 研究了激素类药物地塞米松、麻醉药物利多卡因、对比剂欧乃派克对胶 原酶溶解活性的影响。取相同质量的椎间盘髓核组织，用相同浓度的胶原酶溶解，加入 一定量药物，2 4 h 后通过检测各组溶液中羟脯氨酸含量测定胶原酶的溶解效果。实验发 现地塞米松组、利多卡因组和欧乃派克组溶液中的羟脯氨酸含量明显低于对照组，由其 以利多卡因组为甚。而几种药物的组合：地塞米松+ 利多卡因组合、地塞米松+ 欧乃派 克组合、利多卡因+ 欧乃派克组合、地塞米松+ 利多卡因+ 欧乃派克组合的溶液中的羟 脯氨酸含量明显低于对照组低，同时也分别比地塞米松组、利多卡因组、欧乃派克组低。 说明地塞米松、利多卡因、欧乃派克可不同程度地抑制胶原酶的溶解活性，任何两者或 三者同时使用会增强对胶原酶活性的抑制。 金星等1 3 8 】测定了盐酸罗哌卡因、盐酸曲马多、枸橼酸芬太尼、盐酸布比卡因、盐酸 普鲁卡因、盐酸利多卡因、碳酸利多卡因、盐酸吗啡、醋酸曲安奈德、维生素b 1 2 、维生 素b 1 、地塞米松磷酸钠这1 2 种药物对胶原酶活性的影响，实验结果发现对胶原酶均有抑 制作用，抑制效果从1 0 1 0 0 。沈远萍等【2 l 】通过考马斯亮蓝比色法比较了6 种眼科外用药 物对胶原酶活性的抑制作用，发现这6 种药物有不同程度抑制胶原酶作用，其中卡托普利 极强、乙酰半胱氨酸和依地酸钠较强，枸橼酸钠、硫代硫酸钠和四环素较差。沙月琴等1 3 9 】 给慢性牙周炎患者口服强力霉素，发现龈沟液中胶原酶活性较用药前明显下降，证实低 剂量强力霉素对胶原酶具有抑制作用。并发现四环素类药物米诺霉素、盐酸四环素、强 力霉素均有抑制胶原酶降解胶原的功效，但强力霉素更为有效，用量更低。 近3 0 年来国外研究者对胶原酶抑制机理和化学合成抑制剂进行了大量基础研究，有 的药物已经应用于临床治疗，不少药物正处于研究阶段。第一类胶原酶抑制剂是羟氨类 ( h y d r o x a m a t e ) 化合物，结构类似于胶原蛋白，抑制作用基于羟氨基z n 2 + 螯合基团。 b a t i m a s t a t ( b b 9 4 ) h o j ( 图1 4a ) 是第一个临床实验的羟氨类胶原酶抑制剂，是一种模拟天 然胶原的肽类结构的异羟肟酸衍生物，其胶原样骨架结构易与胶原酶活性基团结合，分 子中的羟氨结构可对胶原酶z n 2 + 活性位点产生螯合作用。m a r i m a s t a t ( b b 2 5 1 6 ) ( 图1 4b ) 8 绪论 是另一个异羟肟酸衍射物，其结构也类似于胶原蛋白分子，模拟胶原酶的底物切割位点 结构，起始段能可逆结合胶原酶z n 2 + 活性位点，通过与底物竞争性地结合胶原酶活性位 点而抑制酶的活性。 o 馥飞一弱o付o-k ， o ， ( a ) b a t i m a s t a t ( b ) m a r i m a s t a t 图1 4b a t i m a s t a t 和m a r i m a s t a t 的化学结构 f i g 1 4t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo fb a t i m a s t a t & m a d m a s t a t 第一类羟氨类抑制剂大多具有广谱抑制作用，对胶原酶和其它多种m m p 都具有较好 的抑制效果，但后期临床研究发现这类抑制剂往往会引起病患的肌肉和骨骼疼痛，并可 能会影响正常的基质逆转，因此需要开发新类型胶原酶抑制剂。 现阶段新胶原酶抑制剂的化学结构设计从早期具有广谱抑制作用的羟氨类抑制剂转 变为具有二级结构选择性的羟氨类抑制剂和非羟氨类抑制剂。主要有三种设计思路：1 非 羟氨类抑制剂，新抑制剂将具有不同的z n 2 + 螯合基团；2 具有酶蛋白二级结构选择性的 抑制剂；此类抑制剂将不再具有广谱抑制作用，只针对某种m m p 具有良好的抑制效果， 但对其它类型m m p 的抑制作用较小。3 以m m p 化学结构为基础设计抑制剂，转变早期 抑制剂模拟m m p 天然底物化学结构的设计思路【4 l ，4 2 1 。以下是几种新类型胶原酶抑制剂： 新硫醇结构抑制剂，如r e b i m a s t a t l 4 引，y i - i j 一13 2 1 4 4 1 ，此类化合物具有一个硫醇基( 一 s h ，t h i 0 1 ) z n 2 + 螯合基团( 图1 5 ) 。 9 9 ) ( 9 9 ) ( 9 9 ) 中国医药集团上海化学试剂厂 中国医药集团上海化学试剂厂 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 上海金山区兴塔美兴化工厂 宜兴洋溪镇徐渎化工厂 国药集团化学试剂有限公司 上海试剂厂 s i g m a h 5 4 4 0 9 s i g m a c 9 8 7 9 g i b c oi n v i t r o g e n1 7 1 0 0 1 7 a m r e s c o0 4 2 2 无锡华晶电子厂 苏州市中元喷灯厂 瞄s h c l 缓冲液( 3 7 。cp h = 7 4 含5 m m o l m lc a c l 2 ) 加入t r i s6 0 5 7 m g ，浓盐酸0 3 3 m l ( 参见附录1 ) ，无水c a c l 25 5 5 m g ，超纯水溶解、 定容至1 0 0 m l 。( 可长期保存) 羟脯氨酸储备液和工作液 2 0 0 0 9 9 m l 储备液：称取2 0 0 m g 羟脯氨酸标准物，超纯水溶解、定容至1 0 0 m l 。 工作液：取一定量储备液分别稀释至1 0 ，2 0 ，3 0 ，4 0 ，5 0 ，6 0 ，8 0 i _ t g m l ( p h = 6 1 ) 。 醋酸一柠檬酸缓冲溶液( p h = 6 0 ) 醋酸钠( c 2 h 3 0 2 n a 3 h 2 0 ) 5 7 0 9 ，柠檬酸三钠( c 6 h 5 n a 3 0 7 2 h 2 0 ) 3 7 5 9 ，柠檬酸 ( c 6 h 8 0 7 h 2 0 ) 0 5 5 9 ，异丙醇3 8 5 m l ，超纯水溶解、定容至1 0 0 m l 。( 可长期保存) 氧化剂 0 3 5 9 氯胺t 加5 m l 纯水溶解，再加入2 0 m l 醋酸一柠檬酸缓冲溶液。( 无色透明 溶液有氯气样气味；不稳定，测定前临时配置) 显色剂 1 9 对二甲氨基苯甲醛加入4 m l7 0 高氯酸和6 m l 异丙醇( 亮黄色油状液体，不稳