（植物学专业论文）天津地区14种果树叶提取物的研究.pdf

天津师范大学硕士论文 摘要 采用7 0 乙醇7 0 水浴回流提取桃叶、梨叶、杏叶，山楂叶、苹果叶、核 桃叶、李子叶、柿子叶、栗子叶、枣叶、葡萄叶、石榴叶、桑叶和海棠叶中的黄 酮化合物，含量分别为4 9 6 、1 8 5 、o 3 l 、2 9 2 和2 8 5 、2 4 0 、1 0 2 、 0 7 3 、0 2 8 、3 1 3 、1 5 9 、0 8 6 、o 9 9 、3 9 9 。 a b 8 型大孔树脂适合这1 4 种提取物总黄酮的纯化。 这1 4 种树叶中所含的提取物均具有抗氧活性。抗氧化能力大小关系为：v c 栗子叶 李子叶 b h t 石榴叶 柿子叶 桃叶 海棠叶 核桃叶= 山楂叶 杏叶 苹 果叶 梨叶 桑叶 葡萄叶 枣叶。 桃叶、梨叶、杏叶、山楂叶和苹果叶提取物5 种树叶提取物均有抑菌作用。 关键词：黄酮化合物；d p p h ；抗氧活性；大孔树脂；抑菌作用 天津师范大学硕士论文 a b s t r a c t u s i n g7 0 e t h a n o la t7 0 t oe x t m c tp e a c hl e a v e s ，p e a rl e a v e s ，印r i c o tl e a v e s ， h a 叭h o ml e a v e s ， 印p l el e a v e s ， w a l n u tl e a v e s ， p l u ml e a v e s ，p e r s i 舢m o nl e a v e s ， c h e s t n u tl e a v e s ，j 吗u b el e a v e s ，蹦l p el e a v e s ，p o m e 野m a t el e a v e s ，m u l b e n yl e a v e sa i l d b e g o n i al e a v e so fn a v o n o i dc o m p o u n d ss h o w e dt h a t ：l4k i n d so ft o t a lf l a v o n o i d si n m el e a v e sw e r e ：4 9 6 ；1 8 5 ；0 3 1 ；2 9 2 ；2 8 5 ；2 4 0 ；1 0 2 ；o 7 3 ；o 2 8 ；3 1 3 ；1 5 9 ；o 8 6 ；0 9 9 ；3 9 9 a b - 8m a c r o p o r o u sr e s i ns u i t a b l et 0p u i i f i c a t et h ee x t r a c to ft h el4k i n d so f n a v o n o i d s a l lo fe x t r a c to f “s14s p e c i e sl e a v e sh a v ea n t i o ) ( i d a i l ta c t i v i 啦a n t i 0 x i d a n t c 印a c i t yf o rt h es i z eo fr e l a t i o n s ：v c c h e s t n u tl e a v e s p l u ml e a v e s b h t p o m e g r a n a t el e a v e s p e r s i m m o nl e a v e s l e a v e s b e g o n i al e a v e s w a l n u tl e a v e s h 踟曲o ml e a v e s 印r i c o tl e a v e s 印p l el e a v e s p e a rl e a v e s m u l b e n yl e a v e s 掣a p el e a v e s j u j u b el e a v e s t i l ee x t r a c to fp e a c hl e a v e s ，p e a rl e a v e s ，印r i c o tl e a h a 、训幻ml e a v e sa j l da p p i e l e a fh a v ea n t i m i c r o b i a le 虢c t k e yw o r d s ：f l a v o n o i d s ：d p p h ：a n t i o x i d a n ta c t i v i t y ；m a c r o p o r o u sr e s i n 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨盗竖塾盘鲎或其它教育 机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡 献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 签名：日期：2 q 旦多，6 学位论文版权使用授权书 本人完全了解天津师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交 论文的复印件和磁盘。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：监导师签名： 日期： 天津师范大学硕士论文 第一章前言 1 1 文献综述 1 1 1 黄酮类化合物概述 黄酮类化合物是植物的次生代谢产物，广泛存在于高等植物及羊齿植物的 根、茎、叶、花、果实等中，是许多中草药的有效成分( 吴立军，2 0 0 3 ) 。由于 它们的生理活性多种多样，近年来，引起了国内外化学家、药物学家的广泛重视， 研究进展很快。1 9 7 4 年，国内外已发表的黄酮类化合物仅1 6 0 0 余种，而到1 9 9 8 年，黄酮类化合物总数则已超过5 0 0 0 个( 汤建国，2 0 0 4 ) 。黄酮类化合物通过食 物链对所有食草动物及人体产生影响，进入人体内的黄酮类化合物在人体的生理 和病理过程中起重要作用，因此无论从饮食、营养、药理作用，还是潜在的抗毒 性等方面考虑，这类化合物都是很重要的一类天然产物( 方起程，1 9 9 4 ) 。因此， 研究前景非常广阔。 黄酮类化合物在自然界中以c 。一c 。一c 6 方式构成。黄酮类化合物( f l a v o n o i d s ) ， 又名生物类黄酮化合物( b i o n a v o n o i d s ) ，以前主要是指基本母核为2 一苯基色原酮 ( 2 一p h e n y l c h r o m o n e ) 类化合物，现在则是泛指两个具有酚羟基的苯环( a 一环与 b 一环) 通过中央三碳原子相互连接而成的一系列化合物( 吴立军，2 0 0 3 ) 。基本 结构见图1 1 。 经过多年对黄酮类化合物生物合成的研究，多数人认为黄酮类化合物的基本 骨架是由三个丙二酰辅酶a 和一个桂皮酰辅酶a 生物合成而产生的。由同位素 标记实验证明：a 环来自于三个丙二酞辅酶a ，而b 环来自于一个桂皮酞辅酶a ( 汤建国，2 0 0 4 ；方起程，1 9 9 4 ；吴立军，2 0 0 3 ) 。黄酮类化合物具有多个苯环 和酚羟基结构，苯环为疏水基团，而酚羟基为亲水基团。采用分子轨道近似方法 m n d o 进行量子化学计算，结果表明，黄酮类物质在水溶液中最佳构象是苯并 吡喃环位于一个平面上，而另一个苯酚环( b 环) 与这一平面垂直。其中a 环多为 间苯三酚型结构，构成直键型聚合物，单元间连接键较不稳定而易于断裂，a 环 的c 。、c 8 为亲核反应中心，8 位的亲核活性高于6 位。b 环常含有邻位酚羟基结 构，酚羟基是活泼的h 供体。c 环为吡哺环，杂环上c 。、c 。原子是手性碳原子， 可形成4 个立体异构体。黄酮及黄酮醇类c 。位上有一个羰基，羰基可强烈地减 少a 环的亲核性质。( 陆曦，2 0 0 6 ) 天津师范大学硕士论文 表1 1 黄酮类化合物的基本类型 t a b l e 1 1b 硒i c 卿l eo ff l a v o n o i d s 类型基本结构类塑基本结构 黄酮 妒 二氢查尔酮 即： n a v o n e d i h y o x y c h 越c o n e 黄酮醇 花色素 f l a o n o l a n t h o c y a n e 二氧黄秉 妒 黄烷一3 一醇 嬲 n a v a n o n e 矗a v a n o l = 氢黄酮醇 黄烷 舻 n a v a n o n o l a a v a 帆e 异黄酮 吣 双苯毗酮 q p i s o f i a v o n c 二氢异黄酮 噢弄( 橙酮) 吁c 哂 i s o n a v a n o n ea u n 查耳酮 帮： c h a i c o n e 2 天津师范大学硕士论文 7 6 3 54 4 5 图1 1 黄酮类化合物基本结构示意图 f i g 1 1t h em o d e io ff l a v n o i d s 1 1 2 黄酮类化合物的理化性质 1 1 2 1 形态和颜色 黄酮类化合物多为结晶性固体，少数( 如黄酮苷类) 为无定形粉末。游离的各 种苷元母核中，除二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷及黄烷醇有旋光性外，其余则无 光学活性。苷类由于在结构中引入糖的分子，故均有旋光性，且多为左侧。黄酮 类化合物的颜色与分子中是否存在交叉共扼体系及助色团( 一h 0 、一o c h 。等) 的种 类、数目以及取代位置有关。以黄酮为例来说，其色原酮部分原本无色，但在2 一 位上引入苯环后，即形成交叉共扼体系，并通过电子转移、重排，使共扼链延长， 因而出现颜色。一般情况下，黄酮、黄酮醇及其苷类多显灰黄一黄色，查耳酮为 黄一橙黄色，而二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮类，因不具有交叉共扼体系或共 扼链短，故不显色( 二氢黄酮及二氢黄酮醇) 和显微黄色( 异黄酮) 。显然，在上述 黄酮、黄酮醇分子中，尤其在7 一位及4 一位引入一h 0 及一o c h 。等助色团后，则因促 进电子移位、重排，丽使化合物的颜色加深。但一h o 、一0 c h 。，引入其他位置贝i j 影 响较小。花色素及其昔元的颜色随p h 不同而改变，一般显红( p h 8 5 ) 等颜色。( 姚新生，2 0 0 1 ) 1 1 2 2 溶解性 黄酮类化合物的结构及存在状态使溶解度有显著差异。一般游离苷元难溶或 不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱液中。其中黄 酮、黄酮醇、查耳酮是平面型分子，因分子堆砌较紧密，分子间引力较大，故更 难溶于水，而二氢黄酮及二氢黄酮醇等，因系非平面型，故排列不紧密，分子间 引力降低，有利于水分子进入，因而对水的溶解度稍大。多数苷类因以离子形式 存在，具有盐的通性，故亲水性较强，偏向于较大的水溶性。黄酮类分子中具有 天津师范大学硕士论文 的羟基可提高在水中的溶解度。由于它们多数都具有酚羟基，因此纯的苷或苷元 都较易溶于碱性有机溶剂吡啶、二甲基甲酰胺等。羟基经甲基化后，则增加在有 机溶剂中的溶解度。黄酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇等强极性溶剂中，但难溶 或不溶于苯、氯仿等有机溶剂，糖链越长，则水中溶解度越大( 吴世荣，2 0 0 5 ) 。 1 1 2 3 酸碱性 ( 1 ) 酸性：黄酮类化合物因分子中多具有酚羟基，故显酸性，可溶于碱性 水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。由于酚羟基数目及位置不同，酸性强 弱也不同，以黄酮为例，其酚羟基酸性强弱顺序依次为：7 ，4 o h 7 一或4 一0 h 一般酚o h 5 一o h 。此性质可用于提取，分离及鉴定工作。 ( 2 ) 碱性：y 一吡喃环上卜氧原子，因有未共用的电子对，故表现微弱的 碱性，可与强无机酸，如浓硫酸、盐酸等生成盐，但生成的盐极不稳定，加水后 即可以分解。黄酮类化合物溶于浓硫酸中生成的盐，常常表现出特殊的颜色，可 用于鉴别。某些甲氧基黄酮溶于浓盐酸中显深黄色，且可与生物碱沉淀试剂生成 沉淀( b r i g g slh ，1 9 4 9 ) 。 1 1 2 4 紫外吸收 p h 为7 的溶液中，以乙醇或甲醇为溶剂，黄酮类化合物的紫外吸收在2 4 0 4 0 0 i l l t l 间一般有两个主要吸收带，处于2 9 0 3 8 0n m 区的吸收带称带i ，在2 4 0 2 8 0n m 区的为带i i 。分子中取代基的性质、位置和数目决定吸收带的波长、强度和吸收 谱形。黄酮的分子可视为由两个生色团组成( 如图1 2 所示) ：a 环的苯甲酰和b 环的肉桂酰。当黄酮分子中c 环2 ，3 位双键的3 位有羟基取代时，因存在相邻的 羟基与羰基，减弱了羰基与a 环的共轭，使肉桂酰生色团的紫外吸收受到影响， 吸收强度加强。二氢黄酮也是由两个不相共轭和干扰的生色团( 邻甲氧酰基的a 环和烷基苯的b 环) 所构成，它的紫外光谱也是两个生色团紫外吸收的加合( 黄 量，1 9 8 8 ) 。 4 天津师范大学硕士论文 。 荤甲酰肉桂酰 带ii2 9 0 。3 8 0 n m 带1 1 2 4 0 - 2 s o n m 图1 2 黄酮类化合物的两个生色团 f i g 1 2t w o 如n c t i o n a ig r o u p so ff l a v o n o i d s 1 1 2 5 黄酮类化合物的特征反应 各类黄酮化合物与镁粉盐酸、锌粉盐酸、钠汞齐盐酸、硼氢化钠、五氯化 锑、乙酸镁、三氯化铝、氢氧化钠等试剂产生特征颜色。黄酮类的颜色反应多与 分子中的酚羟基及y 毗喃酮环有关。在早期的研究工作中，常以这些特征颜色 反应定性地判断黄酮类化合物的存在和类别。黄酮类化合物的显色反应如表1 2 所示。 表1 2 各类黄酮类化合物的显色反应 1 阻b l e1 2t h ec o i o r i n gr e a c t i o no fn a v o n o i d s 注；1 表示订荧光 1 1 3 黄酮类化合物的提取方法 根据多年的研究表明，从中草药中提取黄酮类化合物的方法多种多样，只要 根据提取物的性质及伴存的杂质，选择适合的提取手段，就可以提高黄酮类化合 物的产率，从而达到降低生产成本和提高药材利用率的目的。 5 天津师范大学硕士论文 1 1 3 1 传统溶剂提取法 传统提溶剂取法包括热水、醇提取法和碱性水和碱性稀醇提取法。 热水仅限于提取黄酮甙类，在提取过程中要综合考虑加料液比、浸提时间、 温度及提取次数等因素。此方法操作简单、成本低，安全，适合于工业化大规模 生产。例如：淫羊藿总黄酮( 淫羊藿甙及淫羊藿次甙等) 的提取( 王昌利，1 9 9 6 ) ， 采用正交实验对其提取工艺进行了多因素研究，得出适合大规模生产的最佳工艺 参数，即加2 0 倍水，浸提1 5 h ，煎煮2 次，每次煎煮1 h ，这样可以得到良好的 提取效果。 醇提法与醇的浓度有极大关系，高浓度的乙醇( 9 0 以上) 适宜于提取黄酮甙 元，6 0 左右浓度的乙醇适宜于提取黄酮甙类。例如：葛根总黄酮的提取采用冷 浸法( 郭建平，1 9 9 5 ) 用乙醇渗漉法提取陈皮甙，研究得出乙醇的浓度和料液比对 提取率的影响，即用5 0 或6 0 的乙醇，l o 倍量提取效果最佳；银杏叶总黄酮 提取工艺( 李重，1 9 9 2 ) 为7 0 乙醇1 2 倍溶媒用量回流提取3 小时，其二次总提取 可达8 1 7 。 由于黄酮类成分大多具有酚羟基，因此可用碱性水( 如碳酸钠、氢氧化钠、 氢氧化钙水溶液) 或碱性稀醇( 如5 0 的乙醇) 浸出，浸出液经酸化后析出黄酮类化 合物。稀氢氧化钠水溶液浸出能力较大，但浸出物含杂质较多。石灰水的优点是 可使含有多羟基的鞣质，或含有羧基的果胶等水溶性杂质生成钙盐沉淀，有利于 浸出液的纯化。例如：从槐米中提取芦丁( 曹永刚，1 9 9 3 ) ，用6 0 c o 产生的y 射线 照射使芸香酶灭活，从而避免了在槐米洗涤、提取过程中芦丁的水解。用碱性较 强的饱和石灰水作溶媒，有利于芦丁成盐溶解，选用硼砂缓冲饱和石灰水的碱性 可保护芦丁的黄酮母核不受破坏，用亚硫酸氢钠为抗氧剂可保护芦丁的邻二酚羟 基。石灰水的缺点是浸出效果不如稀氢氧化钠水溶液，有些黄酮类化合物能与钙 结合成不溶性物质，不被溶出。5 氢氧化钠乙醇液浸出效果好，但浸出液经酸 化后，析出的黄酮类化合物在醇相中有一定的溶解，会在一定程度上降低了产品 的得率。 1 1 3 2 超滤法 超滤技术的主要特点是分离过程耗能低，分离率高，且分离成本较低。控制 超滤膜孑l 径大小能有效地筛选出大分子物质，选用适宜孔径的超滤膜是提高产品 6 天津师范大学硕士论文 收率和质量的关键。8 0 年代后期，采用超滤技术提取黄芩甙( 王世岭，1 9 9 4 ) ，收 效良好。 1 1 3 3 超声提取法 超声具有空化、粉碎、搅拌等特殊作用，对植物药材的细胞有破坏现象，使 其溶媒渗透到药材的细胞中，以便使药材中的化学成分溶于溶媒之中。通过分离、 提纯，以获得所需的有效成分。该法具有实验设备简单、操作方便，与常规提取 法相比，提取时间短、产率高、无需加热( 郭孝武，1 9 9 9 ) 。据报道，用1 9 5 8 k h z 超声波处理银杏叶，在相同温度、相同时间下提取黄酮苷，其提取率与常规水浸 提法相比大大提高，两者相差2 6 倍左右( 郭国瑞，2 0 0 1 ) 。郭孝武从槐米中提取芸 香苷，用2 0 k h z 超声波处理3 0 m i n 与热碱提取酸沉淀相比，提出率提高了4 7 6 ( 郭孝武，1 9 9 7 ) 。据有关资料介绍，还可用超声波提取山楂( 张妍，2 0 0 1 ：张 妍，2 0 0 1 ；毕丽君，1 9 9 9 ) 中的总黄酮，且效果良好。 1 1 3 4 微波提取法 微波具有高效性、选择性、波动性、高频性、热特性等基本特性，因而将微 波应用于提取技术具有提取时间短，操作简便安全，产率高等优点。微波可直接 作用于分子，使分子的热运动加剧，从而引起物质温度升高，极大地有利于各种 有效成分的溶解与扩散。微波的这种热效应使其穿透到介质内部，且可以快速破 坏细胞壁，使中草药中有药效的成分更快更有效的分离提取出来。因此，微波辅 助提取技术的应用对中药提取方法的改进和提取效率的提高具有很大意义。 g a l l z l e r ( 毕丽君，1 9 9 9 ：g a l l z l e rk ，1 9 9 0 ) 等首次将大功率微波应用在羽扇豆、玉米 等中的油脂，棉籽酚等有效成分的提取上。实验表明微波法提取2 m i n 的效果可 与传统方法提取数小时相媲美。将微波加热应用于植物细胞是一种快速、高效、 安全、节能的提取胞内耐热物质的新工艺。微波提取与传统的中药煎煮法相比， 微波加热法可以得到更高的产物提取率，而且整个大大缩短时间，提取物杂质含 量也明显减少( z h e n k ug u o ，2 0 0 1 ) 。该技术对于中药的提取有着重要的应用价值和 广阔的应用前景。但目前该技术还都处于实验室研究状态，尚未在工业化生产中 得到广泛的应用。 1 1 3 5c 0 ：超临界流体萃取法 近年来，随着超临界流体提取( s f e ) 技术研究的迅速发展，在天然药用植物 天津师范大学硕士论文 有效成分提取中应用越来越广泛。它与其他提取方法相比，具有提取效率高、无 溶剂残留、天然植物中活性成分和热不稳定成分不易被分解破坏等优点。同时还 可以通过控制临界温度和压力的变化，来达到选择性提取和分离纯化的目的。对 于制备高纯度，无公害天然产物，该方法已经应用到中药化学成分的提取分离之 中( k o u - l u i l gc h i u ，2 0 0 2 ) ，已经得到很高评价。但由于c 0 2 超临界流体萃取法操 作成本较高，尚未应用到大部分研究和生产当中。 1 1 4 黄酮类化合物的生物活性 黄酮类化合物是药用植物中主要活性成分之一，具有消除氧自由基、抗氧化、 抗过敏、抗炎、抗菌、抗突变、抗肿瘤、保肝、类似雌激素的作用、泻下、保护 心脑血管系统和抗病毒以及杀虫等广谱的生理活性( 彭芳，1 9 9 8 ；毛雪石，1 9 9 5 ； 吴文君，1 9 9 7 ；y 嬲u k a 、v a k ，1 9 8 9 ；s i m o e s c m o ，1 9 9 0 ) ，且毒性较低，因此还 可用作食品、化妆品的天然添加剂，如甜昧剂、抗氧化剂、食用色素等。 1 1 4 1 黄酮类化合物在心脑血管系统的作用 冠心病严重地危害人体的健康，心绞痛是冠心病的常见症状，由于管腔狭窄， 心肌血液供应不足，造成心肌缺血。心绞痛发作时，交感神经活性提高，心率加 快，心肌收缩大大加强，心肌耗氧量增加。研究表明黄酮类化合物具有抗心绞痛 的作用：减轻心脏工作负荷，以降低心肌耗氧量：扩张冠状动脉，促进侧枝循环 的形成，以便增加心脏耗氧量。许兰之等( 许兰之，1 9 9 4 ) 研究了淫羊藿总黄酮 ( t f e ) 对肾上腺素能受体阻断的作用，发现t f e 选择性阻断离体及整体动物心肌 p l 受体，对气管p 2 受体和血管平滑肌a 受体无阻断的作用。此研究为临床应用 淫羊藿治疗冠心病、心绞痛提供了理论依据。姜华等( 姜华，1 9 9 1 ) 对以淫羊藿 为主的成药“心复康”的实验研究表明：能显著增加小鼠冠脉窦流量，降低心肌耗 氧及心脏氧摄取率，能轻度、短暂降低血压，对心率无影响。干燥银杏叶提取物， 其中主要含总黄酮及白果总内酯( 又称冠心酮) ，经临床使用证明对冠心病、心绞 痛有良好的效果( 陈新谦，1 9 9 8 ) 。葛根黄豆甙元( d a i d z e i n ) 也均能显著地增加冠 脉血流量，降低心肌耗氧量( 王泽民，1 9 9 3 ) ，从而达到对冠心病的治疗。 1 1 4 2 黄酮类化合物的抗癌作用 异黄酮化合物为一种天然存在的植物雌激素，具有广谱抗肿瘤生长、分化诱 导和化学预防作用。异黄酮的4 o h 为其分化诱导作用所必须，增加o h 数目可 8 天津师范大学硕士论文 增加细胞的生长抑制作用。异黄酮的典型代表化合物染料木素( g e n i s t e i n ) ，其作 用机制起初认为与酪氨酸激酶抑制有关。最近研究证明( 韩锐，1 9 9 7 ) ，其它异 黄酮类化合物无酪氨酸激酶抑制作用，也具有明显的分化诱导作用。 大豆异黄酮对乳腺癌、前列腺癌及其它一些癌症的发生、发展具有显著的防 治效果。大豆异黄酮主要有三种：染料木甙( g e n i s t c i n ) 、大豆甙( d a i d z e i n ) 和6 一甲 氧基大豆甙( g l y c i t e i n - g l u c o s i d e ) ，总量约占大豆重的0 2 5 。对大豆异黄酮，尤 其是染料木素抗癌机制的研究虽至今尚未完全阐明，但在此领域已取得很大的进 展。康铁邦等( 康铁邦，1 9 9 7 ) 以完整人早幼粒白血病细胞株h l 6 0 细胞为材 料，研究了槲皮素对完整h l 6 0 细胞中肌醇磷脂转换的抑制作用。结果表明槲 皮素对h l 6 0 细胞增殖有抑制作用，且呈明显的剂量依赖关系。 人工合成的黄酮类抗癌药物黄酮乙酸( n a v o n e a c e t i c a c i d ) 在多种实体瘤模型 上有很强的抑制作用，它能抑制哺乳类动物体内的多种致病酶，其体内抗癌作用 与其改变肿瘤能量代谢密切相关( 孙琛，1 9 9 5 ) 。 1 1 4 3 黄酮类化合物对神经、内分泌、免疫系统的作用 陈志武等( 陈志武，1 9 9 7 ) 对银杏叶总黄酮的镇痛作用进行了研究。在小鼠 扭体模型上，皮下注射银杏叶总黄酮2 肚8 0 m g l ( g ，可显著减少小鼠扭体数，并 且呈依赖关系：在小鼠热板模型上，皮下注射和侧脑室注射银杏叶总黄酮均可显 著地延长小鼠舔足潜伏期，结果表明银杏叶总黄酮有明显镇痛作用，其镇痛作用 可能有中枢机制的参与。宋必卫等( 宋必卫，1 9 9 5 ) 对芦丁的镇痛作用研究结果 表明芦丁( 6 2 5 1 0 0 m g 瓜g ) 呈剂量依赖性的抑制小鼠扭体反应：芦丁( 5 0 一1 0 0 m g 瓜g ) 明显提高小鼠嘶叫刺激阈值，显著延长小鼠热板舔足反应潜伏期，表明芦 丁有镇痛作用。其镇痛作用比阿斯匹林强，但比吗啡弱。 崔志清等( 崔志清，1 9 9 5 ) 在雪莲黄酮甙a l 对小鼠中枢神经系统的作用， 实验结果表明雪莲黄酮甙a i 使小鼠自主活动次数明显减少，脑电图0 波均有不 同程度的增加，同时尚有a 波的减少：能降低小鼠学习能力，延缓其完成学习过 程，延迟巩固性条件反射的建立。证实了雪莲黄酮甙a i 对小鼠中枢神经系统产 生明显的抑制作用。 甘草黄酮能使胰脏容积及其分泌量明显增加，导致内源性的胰促胰液肽的释 放。范桂香( 范桂香，1 9 9 6 ) 研究雪莲黄酮总甙对小鼠免疫功能的响，实验结果雪莲 9 天津师范人学硕士论文 黄酮总甙4 0 肛g l ( g 或8 0 p g 瓜g 可显著提高正常小鼠经p h a 刺激后的淋巴细胞转 化率，高血清抗绵羊红细胞抗体效价及溶血素效价，对环酰胺造成的免疫抑制状 态，雪莲黄酮总甙4 0ug 瓜g 或8 0ug l ( g 可使淋巴细胞转化率、抗绵羊细胞抗体 和溶血素效价有所提高。实验结果表明雪莲黄酮总甙对小鼠免疫功能有明显地促 进作用。 1 1 4 4 黄酮类化合物对消化呼吸系统的作用 甘草黄酮对多种溃疡模型引起的药物性溃疡均有明显抑制作用，已作为消化 性溃疡药收入日本医药品集中，有抗溃疡作用的甘草黄酮是：l i q u i r i t i n 、 l i q u i r i t i g e n i n 、l i c u r z i d 、i s o l i q u i r i t i n 和i s o l i q u i r i t i g e n i n 等。贾世山等证明甘草叶乙 醇提取物中的富黄酮成分( l f ) ，具有显著的抑制胃酸过多的作用( 贾国惠，1 9 9 8 ) 。 木犀草素( 1 u t e o l i n ) 直接作用于咳嗽中枢，有选择抑制作用，动物实验证明通 过直接刺激作用而促使分泌增加而去痰。杜鹃素( f a 玎e r 0 1 ) 能促进气管纤毛运动， 机械消除异物，多次给药后，可使呼吸道粘蛋白量减少，并减轻非特异性炎症渗 出，对慢性支气管炎者可使痰量逐渐减少，痰粘度下降，痰液变稀，易于咳出。 槲皮素也具有同样的疗效。 1 1 5 黄酮类化合物抗氧化活性构效关系的概述 自由基是指带有未成对电子的分子、原子或离子。由于未成对电子总是有成 对的趋向，因此自由基很容易发生失去或得到电子的反应而显示出较活泼的化学 性质。在生物体系中，电子转移是一个基本变化。自由基是人体正常的代谢产物， 正常情况下人体内的自由基是处于不断产生与消除的动态平衡中。人体内存在少 量的氧自由基不但对人体够不成威胁，而且还可以帮助传递维持生命力的能量， 促进细胞杀灭细胞，消除炎症，分解毒物等。但如果人体内自由基的数量过多， 就会破坏细胞结构，引起脂质过氧化，干扰人体的正常代谢活动，引起疾病，加 速人体衰老进程。 1 1 5 1 自由基的产生 自由基的形成可用无所不在来形容，日光照射，空气污染物质，辐射线，臭 氧等等，都会促成自由基的生成，在日常生活中，当你烹制美味的菜肴或当你点 燃一支香烟醉心于吞云吐雾时，自由基就悄悄地蔓延开了。在人体中氧自由基是 最多的。氧分子可以通过单电子接受反应依次转变为0 2 、o h 、h 2 0 2 等中间产 l o 天津师范大学硕上论文 物，由于这些物质都是直接或间接地由分子氧转化而来，而且具有比分子氧活泼 的化学反应性，通称为活性氧，其中0 2 、0 h 为氧自由基。如果自由基是由于 氧原子缺乏电子所致就叫“氧自由基活性氧”，广义的活性氧是指含氧丽使其反应 性高的所有化合物。机体内氧的某些代谢产物( 0 2 - 、0 h 、h 2 0 2 ) 及其衍生物的活 性物质( 如过氧化脂质) 与单线态氧等，均含有氧而且具有较高的氧反应性。机体 内氧自由基的形成因素有物理因素，化学因素和生化因素。 生物体内自由基的生成途径主要有三条( 高永贵，1 9 9 9 ) ： ( 1 ) 分子氧的单电子还原途径，这一过程产生0 2 、o h 和h 2 0 2 ： ( 2 ) 酶促催化产生自由基，机体细胞液中的一些可溶性酶，如黄嘌呤氧化酶、 醛氧化酶、脂氧化酶等都是常见的可产生自由基的酶： ( 3 ) 某些生物物质自动氧化生成自由基，一些蛋白质、脂类、低分子化合物 的自动氧化，过氧化物与某些金属离子的氧化还原均可产生自由基。 1 1 5 2 氧自由基对人体的损伤 氧自由基对细胞和组织的损伤是其致病的基础，由于人体是由各种不同功能 的细胞组成，因而自由基对不同细胞的损伤可导致表面看不出来的疾病，如：自 由基摧毁细胞膜，导致细胞膜发生变性，使得细胞不能从外部吸收营养，也排不 出细胞内的代谢产物，并丧失了对细胞和病毒的抵御能力。自由基攻击正在复制 中的基因，造成基因突变，诱发癌症( 刘莉华，2 0 0 2 ) 。 0 2 不仅具有重要的生物功能，还与多种疾病有密切关系，同时它还是生物 体生成的第一个自由基，是所有自由基的前身，因此具有重要意义。0 2 4 有多种 反应性，它即可以作为还原剂，又可以作为氧化剂，还可以作为碱，亲核物和配 体参与反应。氨基酸是构成蛋白质的基本单元，在重要的氨基酸中，除半胱氨酸、 组氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸外，0 2 与大多数氨基酸几乎不反应，由于0 2 。在非 质子性溶剂中溶解性更好，生物膜是疏水性的，因此在这种环境中产生的0 2 极 具危害性。0 2 的损伤效应主要是使核酸断裂，多糖解聚，不饱和脂肪酸过氧化 等等。0 2 的毒性小，但是存在寿命长。 1 1 5 2 羟基自由基对人体的损伤 羟基自由基是化学性质最活泼的活性氧物种，其反应特点是无专一性，反应 性极强，在机体内一旦形成可立即通过提取氢，加成或电子转移等方式与生物体 天津师范大学硕士论文 内所有物质，如糖、蛋白质、d n a 、碱基、磷脂和有机酸等发生反应，而且反 应速率快，极具破坏性，能造成多种生物分子、细胞和组织的氧化损伤。 ( 1 ) 损伤蛋白质，使蛋白质的转换增加。羟基自由基对蛋白质的进攻，主要 是通过从蛋白质多肽链的饱和碳原子上提取氢或氧化蛋白质的巯基而进行： 一c o n h c h c 0 邓h 一+ 0 h 一一c0 n h g c o n h 一+ h 2 0 li rr r 刚+ 0 h r s + h ，0 其次级反应的结果使多肽链间发生交联，形成桥键或交错键，引起蛋白质( 或 酶) 的结构改变，其生物活性受损或丧失，还可使蛋白质大分子混乱聚合成酸且 呈代谢惰性，在细胞内聚集并排挤正常成分，引起细胞退行性变化。 ( 2 ) 损害d n a 导致细胞突变。羟基自由基能从d n a 的戊糖部位提取氢形成 戊糖自由基，而碱基自由基或戊糖自由基均可发生次级反应，造成d n a 碱基降 解或缺失，氢键破坏或主链断裂，从而改变核苷酸结构或排列，破坏其携带的遗 传信息，引起细胞突变。 ( 3 ) 攻击未饱和脂肪酸，引起脂质过氧化。对于生物膜生物的重要结构 之一，包括细胞膜或亚细胞膜( 内膜系统) ，羟基自由基进攻的主要部位是膜组分中 磷脂的未饱和脂肪酸，从而引发一系列自由基链式反应，生成多种脂质过氧化物。 生物膜脂质过氧化的后果是使膜的结构和功能改变，如未饱和脂肪酸减少，磷脂 组成发生变化，膜流动性降低，通透性增加，膜上蛋白质或酶损伤失活及脂质过 氧化作用的有毒产物对细胞与亚细胞膜的毒性效应等等，最终造成整个细胞结构 与功能的损伤。 1 1 6 3n o 自由基 它的某些作用机理虽未搞清，但发现n o 自由基具有多方面的重要作用。 n o 是内皮细胞松弛因子，能够松弛血管平滑肌，防止血小板凝聚，是神经传导 的逆信使，在学习和记忆过程中发挥重要作用。研究表明细胞，特别是吞噬细胞 在吞噬异物或受到刺激时，不但产生活性氧自由基，同时还释放大量n o 自由基 来杀伤入侵的微生物和肿瘤细胞。n o 自由基也可损伤正常细胞，在心肌和脑组 织缺血再灌注损伤中起着重要作用。 1 2 天津师范大学硕士论文 1 1 5 4 氧自由基的清除 自由基对生物体既有必需的一面，又有损伤的一面，所以生物体内的氧自由 基是不断产生，不断利用又不断被消除的过程。但当氧自由基不断增值至消除不 掉时，就会损害机体，因此机体内形成了一套抗氧化防御体系，其消除机制大致 可分为酶抗氧化剂和非酶抗氧化剂( 刘莉华，2 0 0 2 ) 。 ( 1 ) 酶抗氧化剂 生物体内的酶保护系统主要包括超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶 ( c a t ) 、谷胱甘肽过氧化物酶( c s h p x ) 等。s o d 是一种具有特定生物催化功能 的蛋白质，由蛋白质和金属离子组成，主要分布于胞液如线粒体基质中。s o d 能催化0 2 发生歧化反应，从而消除体内的0 2 。 2 0 2 + 2 h + 一h 2 0 2 + 0 2 。 s o d 合成原受0 2 浓度影响，0 2 浓度高时，s o d 生物合成能力也增高。有 研究表明，人体的一些疾病反映在s o d 与0 2 - 含量的变化上，对s o d 减少或 0 2 。的增加的疾病可用s o d 药物治疗。另外，s o d 也有在护肤品中的成功应用， 目的是消除生物体氧化产生的0 2 。，起到保护细胞作用，对抗衰老及护肤养颜具 有重要的应用价值。 s o d 消除0 2 。过程中产生的h 2 0 2 ，对机体亦有损害。h 2 0 2 是一种强氧化剂， 可氧化抗坏血酸等有机物，并可直接使少数酶如c u z n s o d 失活。过氧化氢酶 ( c a t ) 可消除h 2 0 2 ： 2 h 2 0 2 _ 2 h 2 0 + 0 2 。 但在细胞中，它主要存在于过氧化体中，而在线粒体及胞浆中产生的h 2 0 2 ， 常靠谷胱甘肽过氧化物酶( g s h p x ) 消除。产生的g s s g 在谷胱甘肽还原酶作用 下又被还原为g s h ，继续参加消除活性氧的反应。 ( 2 ) 非酶抗氧化剂 生物体内用于消除活性氧的非酶抗氧化剂有脂溶性维生素e 、水溶性维生素 c 、尿酸、血浆铜蓝蛋白等。由于生物膜是疏水环境，0 2 在膜中溶解性比在水 中好，因此脂溶性维生素e 能清除0 2 和0 h ，防止脂类过氧化造成的损失。生 物体内水溶性维生素c 浓度较高时，可作o h 的消除剂。人体血浆中的尿酸，它 是o h 的有力清除剂。血浆中还含有血浆铜蓝蛋白，也能消除0 2 。，虽然其消除 天津师范人学硕士论文 能力仅为s o d 的1 3 0 0 0 0 ，但由于它在血浆中的含量高，其作用也不容忽视。 抗氧化剂是天然的自由基杀手，也是相当丰富且无处不在的，许多植物中就 富含抗氧化剂。植物体内的抗氧化剂主要有d 胡萝卜素、番红素、维生素c 、e 和黄酮类化合物等，因此人们必须从植物中获得足够的抗氧化剂，以满足自身的 需要。富含抗氧化剂的植物主要是一些“有色”的蔬菜和水果，胡萝卜、南瓜、桃、 杏、橘子等橙色植物中包含的抗氧化剂主要是d 胡萝卜素；葡萄：柚、柠檬、荞 麦等黄色植物中含的抗氧化剂主要是黄酮类化合物；菠菜、韭菜、无头甘蓝菜、 空心菜、绿花椰菜、芥兰菜等绿色植物中包含的抗氧化剂主要是维生素c 和维 生素e 。维生素c 能利用羟基自由基与细胞中的过氧化物反应，使氧化连锁反应 中止进而保护细胞的完整性。蕃茄( 含番茄红素最丰富的食物) 、葡萄柚( 红肉) 、 西瓜等红色植物中包含的抗氧化剂主要是番茄红素；大蒜、包心菜、洋葱、韭菜、 洋葱等植物中包含的抗氧化剂主要是丙烯基硫化物( 王建英，2 0 0 6 ) 。 1 1 5 5 黄酮类化合物抗氧化、清除自由基的作用机理 众多实验研究表明( y o k o z a 、at ，1 9 9 7 ) ，黄酮类物质在抗氧化反应中不仅 能清除链引发阶段的自由基，而且可以直接捕获自由基反应链中的自由基，阻断 自由基链反应，起到预防和断链双重作用。黄酮类化合物的抗氧化、清除自由基 能力与其特殊的结构密切相关( 刘莉华，2 0 0 2 ) 。 ( 1 ) 黄酮类化合物对体内酶的作用 酶是蛋白质分子的一种特殊形式，黄酮类化合物对一些酶有抑制作用也是基 于多酚与蛋白质的反应。黄酮类化合物富含酚羟基，属于多酚类物质，具有多酚 类物质的性质，而多酚与蛋白质的结合是其最重要的特征之一。2 0 世纪8 0 年代 中期h a s l 锄等人对多酚一蛋白质反应机理进行了科学的总结，提出多酚类物质的 大量酚羟基与蛋白质主链的n h c o ，侧链上的一o h 、一n h 2 以及一c o o h 以氢键 的形式多点结合，同时具有“手套一手”反应模式，对蛋白质分子具有选择性。 反应历程是植物多酚先通过疏水键向蛋白质分子表面靠近，多酚分子进入疏水 袋，然后发生多点氢键结合( s h ib ，1 9 9 4 ；h e m i n g 、a yr ，1 9 9 2 ；宋立江，2 0 0 0 ； 狄莹，1 9 9 9 ) ，这是目前最完善的多酚蛋白质反应机理，也是黄酮类化合物与体 内酶反应的基础。 ( 2 ) 黄酮类化合物与金属离子的相互作用 1 4 天津师范大学硕士论文 黄酮类化合物可络合诱导氧化的过渡金属离子，如f e 3 + 、c u 2 + 等( s e s t i l i p ，1 9 9 8 ) 。f e ”离子可催化h a b e r w d s s 反应使0 2 生成危害性更大的o h ，c u 2 + 可 催化低密度脂蛋白l d l 氧化，c a 2 + 离子是钙调蛋白和蛋白激酶的组分，是体内 的第二信使，当生物体处于逆境时，c a 2 + 浓度升高，可激活蛋白酶，促进黄嘌呤 脱氢酶转变为氧化酶。b r o w n ( b r o w nje ，1 9 9 8 ) 研究四个结构相关的黄酮类物 质：槲皮素( q u e r c e t i n ) 、山柰酚( k a e m p f e r 0 1 ) 、芦丁( m t i n ) 和木犀草素( 1 u t e o l i n ) 与c u 2 + 的相互作用，分析通过螯合作用形成复合物以及通过氧化改变其结构的 关系证明b 环邻3 ，4 二羟基的存在对c u 2 + 螯合物的形成是重要的，影响着抗氧 化活性。黄酮结构中3 一o h 的存在增强了槲皮素和山柰酚的氧化，木犀草素和芦 丁缺少3 一o h ，在c u 2 + 存在下不氧化。结果也表明黄酮类化合物保护低密度脂蛋 白抵制c u 2 + 诱导氧化存在结构的特性，取决于黄酮对c u 2 + 是螯合还是氧化、水 或脂溶性以及供氢能力。从黄酮类化合物的分子结构来看，黄酮类属于多酚羟基 化合物，因此在相邻的羟基或羰基上的氧原子可以作为配位原子同金属离子配合 形成五元或六元的螯合物。两个相邻的酚羟基能以氧负离子的形式与金属离子形 成稳定的五元环螯合物，邻苯三酚结构中的第三个酚羟基虽然没有参与络合，但 可以促进另外两个酚羟基的离解，从而促进络合物的形成及稳定。例如，e g c 、 e g c g 、e c g 和e c 与f e 3 + 的络合比分别为3 ：2 、2 ：l 、2 ：1 和3 ：l ( 沈生荣， 1 9 9 7 ) 。同时，多酚与某些高价余属离子如f e 3 + 、c ，等作用时，络合的同时把 金属离子从高价态还原至低价态。另外，植物多酚与c u 2 + 、z n 2 + 等金属离子的络 合，还会使含这些离子的金属酶活性受到抑制，这可能也是多酚抗氧化活性的原 因之一( m o r e li ，1 9 9 4 ；m i l i cbl ，1 9 9 8 ) 。 ( 3 ) 直接清除自由基作用与其结构关系 在黄酮类化合物作为抗氧化剂的作用中，通过酚羟基与自由基反应生成较稳 定的半醌式自由基，从而终止自由基链式反应是其最主要的机制。抗氧化能力与 其结构，特别是与芳香环上核失电子有关。事实上，当这些物质与自由基反应失 电子或供氢时，它们产生一种新的基团，此基团通过芳香核的自旋作用被稳定下 来，因此氧化链式反应的传导过程被中断，物质的氧化被延缓，因而黄酮类化合 物抗氧化能力的强弱与它们形成基团的稳定性正相关。 大量研究表明，b 环是黄酮类物质抗氧化、清除自由基的主要活性部位。 天津师范大学硕士论文 h u s a i nsr 等( h u s a i nsr ，1 9 8 7 ) 选取众多黄酮类物质研究它们抗氧化、清除 自由基的能力。通过各物质清除h 2 0 2 在紫外光照射下光解产生的羟自由基的结 果显示所选黄酮类化合物清除自由基能力依次为：杨梅素( m ) ，r i c e t i n ) 槲皮素 ( q u e r c e t i n ) 鼠李素( r h a m n e t i n ) 桑色素( m o r i n ) 洋羌荽黄素( d i o s m e t i n ) 柚皮素( n 撕n g e n i n ) 芹菜素( 印i g e n i n ) 儿茶素( c a t e c h i n ) 5 ，7 一二羟基 一3 ，4 5 一三甲氧基黄酮( 5 ，7 一d i h y d r o x y 一3 4 5 一t r i m e t h o x y n a v o n e ) 刺槐素 ( r o b i n i n ) 山柰酚( k a e m p f e r 0 1 ) 黄酮( n a v o n e ) 。清除自由基活性与b 环上羟 基数目直接相关，随b 环上羟基数目的增加而增加，特别是c 3 o h 尤为重要。 当羟基数目下降，清除0 h 能力迅速下降。如杨梅素羟自由基清除率为5 0 ，而 山奈酚仅为2 0 。其他众多研究也证明了这一点( m i y a k et ，1 9 9 7 ；c h e n jh ， 1 9 9 7 ) 。但当b 环酚羟基数目增加到一定的量时，抗氧化活性不再随酚羟基数目 的增