（细胞生物学专业论文）拟南芥iaa2基因启动子功能的研究及其亚细胞定位.pdf

摘要 生长素( a u x i n ) 是植物生长过程中重要的生长调节因子，在分子、细胞及整体水平 调节植物的生长发育。虽然它是最早被发现的植物激素，但对生长素作用的分子机制， 特别是生长素受体的研究只是在近年才有了长足的进展。生长素信号转导的关键因子包 括：生长素受体、s c f l l r l 、a u x i a a 、a r f 、a u x r e 等。其中a u x i a a 是一种转录抑 制因子，当其基因发生突变时，会引起生长素相关表型异常。a u x i a a 基因是由生长素 诱导表达的基因家族，拟南芥a u x i a a 基因家族有2 9 个成员，目前人们对该基因的功 能了解的还不多。本文以i a a 2 为研究对象，通过构建目的基因的启动子连接报告基因 载体转化拟南芥，分析该基因在植物组织中的表达部位；通过运用g a t e w a y 体系，构 建与e g f p 的融合蛋白载体研究i a a 2 蛋白的亚细胞定位。i a a 2 基因启动子分析表明 i a a 2 表达在微管束、能快速响应生长素；构建的i a a 2 与e g f p 融合蛋白的定位研究显 示i a a 2 是核蛋白。本文实验结果为进一步研究i a a 2 基因的功能奠定了分子生物学基 础。 关键词：拟南芥；生长素；i a a 2 基因：表达部位；细胞定位 a b s t r a c t a u x i nb i o l o g yi so n eo ft h eo l d e s tf i e l d so fe x p e r i m e n t a lp l a n tr e s e a r c h a u x i np l a ya c r i t i c a lr o l ei nn u m e r o u sa s p e c t so f p l a n tg r o w t ha n dd e v e l o p m e n to nm o l e c u l a r , c e l l u l a ra n d t h ew h o l el c v e l a l t h o u 曲a u x i nw a st h e 丘r s tp l a n th o r m o n ei d e n t i f i e d ，i n s i g h t si n t ot h e m o l e c u l a rm e c h a n i s mo fa u x i na c t i o ni so n l yr e c e n t l yb e g i n n i n gt oe m e r g e t w or e c e n t n a t u r ea r t i c l e sr e v e a lt h a tt h ef - b o xp r o t e i nt r a n s p o r t 矾h i b i t o rr e s p o n s e lf t t 1 1 i sar e c e d t o tf o ra u x i n a u x i ns i g n a l i n gi np l a n t si n c l u d e sf i v ec r i t i c a lf h c t o r s n l ea u x i n r e c e p t o r , s c f “c o m p l e x e s ，a u x i a ap r o t e i n s ，越吧a n da u x r e a u x i a ap r o t e i n sa r e a c t i v er e p r e s s o r s m u t a t i o n so fa u x i a ag e n e sl e a dt ot h ea b n o r m a lp h e n o t y p e s a u x i a a g e n e sw e r ef i r s ti s o l a t e da sm e m b e r so f af a m i l yo f g e n e st h a tw e r er a p i d l yi n d u c ei nr e s p o n s e t oa u x i n ( i n d o l e 一3 - a c e t i ca c i d ，l 气a 1 t h ea r a b i d o p s i sg e n o m eh a s2 9g e n e st h a te n c o d e p u t a t i v ea u x i a ap r o t e i n s t h ea u x i a af u n c t i o ni sp o o r l yu n d e r s t o o d p r o m o t o ro fi a a 2 g e n ew a sf u s e dt or e p o r t e rg e n et or e v e a lt h e i re x p r e s s i o np a t t e r n si nt r a n s g e n i cp l a n t s c o d i n gs e q u e n c e so fi a a 2w a sf u s e dw i t he g f pt oi n d i c a t et h e i rs u b c e l l u l a r1 0 c a t i o n s r e s u i t sa sb e l l o w s ：p r o m o t e ro fm j 址g e n ee x p r e s s e di nm i c r o t u b u l e s a n dw a si n d u c e db y a u x i nr a p i d l y a a 2p r o t e i nw a sl o c a t e di nn u c l e a r t i l ew o r ki nt h i st h e s i sw i l lb eb n e f u c i a l f o rs t u d y i n gt h ef u n c t i o no f i a a 2g e n e k e yw o r d s ：a r o b i d o p s i s ，a u x i n , i a a 2g e n e ，e x p r e s s i o np a r e r n , s u b c e l l u a rl o c a t i o n i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中 不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：鹰缢之日期：丝z ， 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复 印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它 复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名i 李邋墨 日 期：中 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名：毖 日 期：2 矽2 五7 电话： 邮编： 第一部分研究背景 引言 植物生长素生物学是植物研究中最古老的领域之一。早期，达尔文做了有关生长素 的实验，发现有一种推断性的物质调节植物茎的向光性生长【i 】。达尔文的实验是在 t h e o p h i lc i e s i e l s k i 研究发现根的重力性生长的基础上延伸的1 2 】。科学家在人类尿中检测 出调节植物生长的物质，命名为生长素a 和b 1 3 】。从真菌中分离带有生长素活性的结构 特异的复合物，被称为异( 植物) 生长素；由于异生长素具有再生产的生物活性，生长 素a 和b 被废弃，后来命名为3 吲哚乙酸( i a a ) 1 4 。在植物的整个生命周期中，生长 素起着关键作用，是控制植物生长和发育的关键物质。在整体水平，它可以促进根，芽 的发生，向光性，顶端优势等各种生理反应；在细胞水平，它可以促进细胞生长，分裂 和分化；在分子水平，它可以调节离子跨膜运输和基因表达。植物生长素在不同的组织 中起不同的作用，对不同的细胞也有不同的影响，这反映出生长素应答的不同机制，对 生长素有不同的反应或同一生长素反应体系伴有各种反应结果。这说明尽管生长素十分 重要，但它的反应机制十分复杂，尤其是其调节基因表达的机制一直倍受关注，是当前 研究的一大难题。近几年，许多实验室都在致力于生长素调节基因表达机制的研究，并 且取得了许多的进展。生长素对生长素早期反应基因的调节是通过诱导转录调节子 a u x i a a 蛋白家族降解，激活植物特异性的转录因子生长素应答因子( a r f ) 来实 现的。生长素刺激a u x i a a 降解是通过诱导泛素蛋白连接酶( e 3 ) ( 即s c f “1 和a u x i a a 蛋白) 间相互作用实现的，即s c f 兀r 泛素蛋白酶体是降解a u x i a a 的场所。2 0 0 5 年，英国约克大学和美国印地安那大学的两个实验室同时鉴定出生长素调节基因表达的 受体是一种f - b o x - - t i r l 。虽然，关于生长素调节基因表达的机制还不够深入，存在 许多问题。但是，近几年来，随着研究的深入，对基因调控机制的整体过程已经有了一 定的了解。植物生长素调节基因表达信号通路的途径为：当细胞核中的生长素浓度很低 时，a u x i a a 家族转录抑制子与a r f 蛋白结合，并抑制特异性生长素应答基因的转录； 当细胞核中生长素浓度增加后，t i r l 与生长素特异结合，引起构象变化，并介导a u x i a a 在s c f 耵r 1 的作用下发生泛素化，被泛素化标记的a u x i a a 在2 6 s 蛋白酶体的作用下被 降解。在失去a u x i a a 的抑制作用后，与a u x r e 结合的a r f 激活生长素早期反应基因 的转录活性，表达产物迅速增加，进一步调节植物的生长发育，并产生生长素相关表型。 由此可见，生长素受体，a u x i a a ，s c f t m l ，a r f ，a u x r e 及生长素早期反应基因等都 是生长素信号转导的关键因子。深入了解植物生长素对基因调节及其信号转导途径，在 生物学上具有非常重要的价值。 一、生长素信号转导的关键因子 1 生长素受体 生长素是调节植物发育各个方面的重要激素。自从生长素被发现并被确定为3 吲哚 乙酸后，对于生长素研究最基本的目标就是确定其受体。生长素受体的研究不仅有助于 揭示生长素信号转导的途径，同时也为其他激素受体的研究提供了借鉴。h e r t e l 最早开 展生长素结合蛋白研究并且成果卓著，被誉为“a b p l 鼻祖”。1 9 7 2 年，h e r t e l 等首先从 玉米幼苗胚芽鞘中检测生长素的膜结合活性，经研究发现这些膜结合位点主要存在于内 质网( e r ) 上：1 9 8 5 年，他们通过一系列的亲和层析，免疫亲和层析及凝胶过滤等方 法从玉米胚芽鞘的膜中纯化出了第一个生长素结合蛋白( a u x i n b i n d i n g p r o t e i n a b p l ) 。 a b p i 为二聚体，是一种广泛存在于维管束植物中的膜蛋白。a b p i 主要存在于e r 上， 也有小部分存在于细胞膜上。当a b p l 与生长素结合后，构象发生改变，并引起膜上 h + ，c 等离子通道状态变化和电生理反应 5 】。利用2 ，4 d 苯乙酸等作为亲和介质筛选 出数十种a b p 蛋白。这些蛋白与生长素的生化，生理功能具有密切联系。某些a b p 还 具有重要的酶活性，如依赖谷胱甘肽的甲醛脱氢酶【6 】，谷胱甘肽转氨酶【7 】等，但h e r t e l 认为生长素与a b p l 结合的特异性和亲和力与它们的生理活性不相符【8 】，a b p 与生长素 的作用与浓度不存在线性关系，未发现a b p 有涉及调节生长素转录反应的证据以及与 a b p 作用的蛋白质，因而很难确切的肯定a b p 能否行使生长素受体的功能【9 1 0 , i i o 人们长期寻找的生长素受体已经找到。最近，两篇在n a t u r e 上的文章揭示在拟南芥 中发现生长素调节基因表达信号通路的受体分子是f b o x 蛋白t 瓜1 ( tr a n s p o r t i n h i b i t o rr e s p o n s e1 ) ，并且能在动物细胞体系中异源表达。t i r i 也与植物激素相作用【1 o 1 1 】。关于t i r 在生长素反应中的作用早在十多年前就有描述。r u e g g e 等于1 9 9 7 年分离 出t i r l 蛋白，并且从t i r l 突变体中发现该蛋白通过抑制生长素极性运输而调节生长素 的作用，所以命名为运输抑制子应答蛋白( tr a n s p o r t i n h i b i t o r r e s p o n s e ) t m 。近年， 关于t i r 蛋白的结构的研究已取得较大的成果。t i r 蛋白由n 端f - b o x 结构域，4 0 个 氨基酸残基左右的短间区，富含l e u 重复区域( l r r ) ，以及c 一端7 0 个氨基酸残基走有 的片段组成”“。 利用转基因的手段，使m y c t i r i 融合基因在t i f l 4 突变株中表达，发现融合蛋白 与a u x i a a 的结合活性和生长素的浓度成正比，还表明生长素与t i r 之间的相互作用 是可逆的非共价结合。利用小麦胚提取液体外合成的t i r i ，仍可以在生长素的诱导下 与i a a 7 结合。向昆虫细胞和光滑爪蟾胚胎细胞中转入t i r l 基因，发现在异源细胞中 表达的外源t i r l 也可以在生长素的调节下，与a u x i a a 的结构域i i 相互作用。而当在 爪蟾胚胎细胞中表达敲除了f - b o x 的t i r l 时，这种a f t i r l 蛋白便不能在生长素的诱 导下与a u x f l a a 作用。利用w e s t e r n 杂交法，在生长素t i r l a u x i a a 复合物中，没有 检测到s c f 7 1 r 蛋白复合物中的其它亚基。t i r l 蛋白的f - b o x 中的保守氨基酸发生突变 时，在生长素存在时，t i r l 突变蛋白与a u x l a a 作用的能力大大降低甚至完全丧失。 这些结果都表明f b o x 是生长素的受体 1 0 , 1 1 1 。最近，对拟南芥t i r l 一a s k l 复合物的晶体 结构分析，揭示了通过t i r l 对生长素感应的机制和t i r l 与a u x i a a 短肽的结合模型， 2 文中，获得了t i r l 一a s k l 复合物的晶体结构，其中包含3 个不同生长素的复合物，和有 或无i a a 7 的蛋白短肽【1 3 】。从这些结构中，发现t i r l 亮氨酸富集重复区包含有肌醇六磷 酸酶( i n s p 6 ) 共因子，而且这一区域可以通过一个单表面槽识别生长素和短肽。生长 素锚定在t i r l 槽的底部，可以结合到部分兼容的位点，而短肽则定位在生长素的顶部 占据t i r l 槽的其余部分，完全封闭住生长素的结合位点，这样就填充成蛋白界面的疏 水室，生长素成为t i r l 与底物的“分子胶水”。这是从结构生物学上又一次直接地证明 了t i r l 是生长素受体。 当然，生长素受体不仅仅只有t i r l ，t i r l 只不过是很多生长素受体中的一种。比 如，在体外，生长素信号f - b o x 蛋白与依赖于生长素的a u x i a a 的结合与t i r l 十分相 似：在体内，此类蛋白还参与生长素应答【l 川；这表明一系列的a f b 蛋白也具有生长素 受体的功能。t i r l 是属于f - b o x 蛋白家族的，该家族由7 个蛋白构成，其中a f b l 、2 和3 与t i r l 相似性高，也同样编码f - b o x 组成s c f 蛋白复合体】。遗传分析表明t i r l 与a f b 在调节生长素反应上具有部分功能的冗余性：1 启动予和t m l p c r 分析t i r l 与a f b 表达部位具有很大的重叠性；2 t i r l 与a f b 单突变体没有什么表型缺陷，但t f f l a f b 2 、t i r la f b 2a f b 3 、t f f la f b la f b 2a f b 3 的表型由明显缺陷，在莲座叶的大小、株高等 发生变化；3 t i r l 与a f b 蛋白调节b d l i a a l 2 在胚胎发育过程中的降解，三突变体 胚胎发育存在有很大比例的缺陷。 虽然，生长素受体己经找到，但是很多关键性问题仍有待解决。首先，生长素分子 是怎样结合的? 结合的细节是如何，即结合位点到底在哪里? 与a u 】，i a a 相互作用结合 时，结构是如何改变的? 此外，t i r l 与a f b 蛋白是怎样区分于各种a u r d l a a 以及在不 同组织中结合于不同的生长素? 这些生长素受体是怎样被转录以后是怎样被调节的? 2 s c f n 砌 泛素蛋白酶体降解途径对于细胞的调控作用在近几年越来越被人们认识到它的重 要性。2 0 0 4 年诺贝尔化学奖授予以色列科学家阿龙切哈诺沃、阿夫拉姆，赫什科和美 国科学家欧文罗斯，以表彰他们发现了泛素调节的蛋白质降解。泛素是一种由7 6 个 氨基酸组成的蛋白质，存在于所有真核细胞中。与泛素结合的蛋白质会作为某些蛋白酶 的底物被降解【“，所以泛素化能够控制蛋白质的累积，该途径包括三个步骤。首先，泛 素在a t p 供能的情况下被泛素活化酶( e 1 ) 活化，然后将其转移到泛素结合酶e 2 上通 过硫脂键与e 2 酶的半胱氨酸相连；泛素连接酶复合体( e 3 ) 将活化的泛素从e 2 转移 到靶蛋白处1 1 6 1 。根据e 3 与底物的相对比例可以将底物单泛素化修饰和多聚泛素化修饰。 多聚泛素化修饰的靶蛋白一般被2 6 s 的蛋白酶体所降解，此途径被称为泛素蛋白酶体途 径。多聚泛素化修饰的靶蛋白( 如变性、过量表达的蛋白质、错误折叠蛋白) 可以通过 泛素化途径被降解。 泛素连接酶e 3 根据结构域不同主要分为两类：h e c t 结构域家族和r i n g u - b o x 结构域家族【锕。h e c te 3 s 是个大蛋白，有1 0 0 k d ，h e c t 结构域有3 5 0 个氨基酸组成， 含有泛素结合位点和u be 2 结合位点1 1 。 r i n g 结构域家族分为两类：一类是单亚基，如c o p l 、s i n a t 5 和a r c i ；另一类 为多亚基，包括s c f 、a p c 和c u l 3 b t b 1s 】。s c f 由于f - b o x 的不同又可以分为很多类。 s c f 在植物发育中的作用很广泛，它影响激素的反应，生长周期，花的发育，衰老。s c f 7 m 是最早一个被鉴定的s c f 复合物。然而，在拟南芥中，有上百个具有r i n g 结构域的家 族，h e c t 家族却非常少。经研究，在拟南芥中，约有1 2 6 0 多种基因( 约占蛋白质组 的4 5 ) 参与编码e 3 的各亚基。 s c f 兀2 现在被认为它对生长素反应起到重要作用，其证据主要来源于对生长素抗性 突变体t i r l 的研究，相应的t 瓜1 编码一种f b o x 蛋白，t i r l 突变体表现出对生长素的响 应异常，侧根少且有着高温条件下的胚轴伸长缺陷【1 9 1 。t i r l 可以与s k p l 同源基因a s k l 及a t c u l l ( c u l l i n l ) 形成s c f 复合物【2 0 】。a x r l 是生长素抗性突变体，a x r l 蛋白与泛 素活化酶( e 1 ) 的n 端有很高的同源性【2 ”。但是，由于缺少活性所必须的一个重要残 基，a x r l 并不具有e 1 的功能性 2 2 1 。拟南芥的e c r 与泛素活化酶( e 1 ) 的c 端有同 源性1 2 2 。e c r l 和a x r l 能够形成异源二聚体，该二聚体能激活与泛素类似的蛋白r u b l ， 被激活的r u b l 与拟南芥中相对于泛素降解途径中e 2 的r c e l 相互作用。 近来对泛素降解途径的关键基因的突变体研究，更加证明了s c f t m 在生长素反应中 的作用。a x r 6 编码a t c u l l ，揭示了s c fe 3 连接酶在生长素调控胚胎发育中的作用【2 3 1 。 3 a u r j i a a 蛋白的研究 a u x i a a 在生长素响应过程中表现出强而快速的转录诱导作用1 2 4 】。在拟南芥中， a u x i a a 家族有2 9 个成员，不同发育阶段的a u x i a a 基因转录水平不同，所以生长素 诱导性也随之变化 2 5 1 。 不仅仅是生长素，环己酰亚胺( c h x ) 也能快速的诱导a u x i a a 基因的表达，表 明a u x i a a 的转录并不稳定，或者易受短生命周期蛋白的抑制( s h o r t - l i v e dp r o t e i n s ) 。 a b e l 等于1 9 9 4 年发现a u x i a a 在体内的生命周期极短，说明a u x i a a 蛋白自身能够对 响应生长素的a u x i a a 转录进行调节。 a u x i a a 蛋白有四个保守区，并被划分为四个不同的埘2 6 ，2 1 。d o m a i ni i i 和负 责二聚化，存在于a u x i a a 蛋白和生长素反应因子( a r f ) 中( 2 8 2 9 1 。a u x i a a 蛋白并 不与d n a 结合，但是它们能够与a r f s 通过二者共享的c 末端d o m a i n s 发生聚合 2 8 , 3 0 。 a r f s 含有一个d n a 结合斟”】，并能与一些a u x i a a 基因和生长素响应基因启动子的 生长素反应元件( a u x r e s ) 结合 3 2 1 。a u x i a a s 蛋白和a - r f $ 蛋白都能够调节融合了包 含a u x r e 启动子的报告基因的表达【3 0 3 1 】。a u x i a a 蛋白与a r f s 结合后影响了a r f 的 转录调节活力。因此，a r f s 与a r f s ，a r f s 与a u x i a a 蛋白，或a u x i a a 与a u x i a a 蛋白间的交互作用能够调节生长素响应的转录【”，3 4 1 。d o m a i ni 具有转录抑制功能，对 a r f 蛋白的转录激活有明显的上位作用【3 5 1 ，同时对a u x i a a 蛋白和不同植物的转录抑制 因子进行对比分析，发现在a u x i a a 结构域i 中存在一段保守的l c u 序列k l x 3 6 1 。 d o m a i n i i 含有依赖于生长素降解蛋白的决定子 3 7 , 3 8 j 9 1 。对t i r l 、a u x i n 和i a a 7 蛋白短 肽g w p l p 2 v 结合时的晶体分析，可以清楚看到g w p l p 2 v 的每个氨基酸对于短肽能固 定在t i r 槽里都非常重要 ”】。保守域i i 突变增加蛋白质的稳定性，减少对生长素响应， 造成了植物在生长和发育的缺附3 5 ，3 8 ，加，4 1 ，4 2 ，4 3 1 。 4 目前，我们已经获得1 0 个a u x i a a 基因功能突变体，具体表型见表l 。拟南芥 a u x i a a 基因功能的突变体有着多种表型，生长素敏感性或升高或降低。如i a a 7 a x r 2 1 m 和i a a 3 s h y 2 2 4 5 】突变体顶端优势减少，反映了生长素响应能力的降低。相反的， i a a l 7 a x r 3 1 突变体顶端优势增加，生长素响应能力升高h q 。i a a l 4 s l r l 没有侧根、根毛 少h _ 7 】。i a a 2 8 1 无侧根【4 8 1 。i a a l a x r 5 1 莲座叶小、株高比正常矮【4 0 1 。 然而，a u x i a a 基因功能缺失型突变体的缺陷表型并不明显，证明a u x i a a 蛋白 具有冗余性。2 0 0 5 年o v e r v o o r d e 等鉴定a u x i a a 家族基因成员2 9 个中的1 2 个t - d n a 插入突变体，发现与野生型比较这些插入株系并没有可见表型。基因保守性较近的双突 变和三突变体同样表现出野生型表型，例如：i a a 8 1i a a 9 1 或者i a a 5 1i a a 6 - 1i a a l 9 1 。对 i a a 5 1i a a 6 1 i a a l 9 1 三突变体的全部基因表达分析发现生长素相关的基因表达没有发生 改变。 表1 - 1 ：不同a u x i a a 基因结构域i i 的突变 n l u l l l m l 部r ，0lss h o r lh y p c , c o t y l k & 嚣i n 2 8 3 0 5 4 5 5 d a r k w a v yl e a v e s 。n ot 0 0 1 + h 聪。黟a v m p m 讲t 艇 s 蛔 ， 订3 拍3 6 s l 置l | l 走啦4 d r ， 酗a 2 嚣 葩擘j 朋鼢a a 9 m s 2 ”1 v v g w i p v 壬t s l 弱州h y p c y 1 i , e a v e sm2 9 3 1 d a r k 。u 嘲d o dl 始懈1 1 0 l 舯t h a u s + - 删船o p r o 哪 g i v g w p p v r s ss t i o 时h y 删y 1 1 e a 煅i n2 6 4 0 4 3 4 4 _ 幽矗埘x 孵j 碰k a # e i ， v 、，g w p i n 然 sn oh 把嫩lr 挂。f e w 阳雕 h 舢摊a g r a w l w l x c “，谢a n d h n x r , 哟d v v g w 阼v l 坞 lf 电辫i 尊l 蝴l i t 枷s d e c t e 拈e d6 & h a o 薯神缸d o 哪u 业n v v g w 撬q c s s a g m 娜 a n d 4 a p h o l o c r a l x cb 挣o t y 0 l j e wh l lr 8 r 乙 l 、，v g w p p i g l s w g g , 钟v 髂 a v g w p p v c s r n oe m 搬y i ct t 。砷5 6 j q 蒯：a s l o n g b y p o 。一y l f u s e d l c m y l e d s 小o n t 0 0 1 u p 耐酣k a v 。s s h o r th y l 目c c 叼d ，e p c k d4 2 j 胖鼢 ，_3覃2讥 球蚶呼m 一 潞 嚣 4 生长素反应因子( a r f ) 的研究 生长素反应因子能与生长素早期反应基因启动子中的生长素反应元件 ( a u x r e ) t g t c t c 特异性地结合，调节这类基因的转录活性【2 9 4 9 。a r f 蛋白的分子量在7 0 到1 3 0 k d 之间，包含3 个保守序列：n 一端d n a 结合结构域( d b d ) 、与a u x i 从的i 和 结构域高度同源的c 一末端二聚体化结构域( c t d ) 和在d b d 和c t d 之间保守性很差的中 间区域( 胍) 4 9 1 。d b d 和c t d 的序列长度和氨基酸组成比较保守，懈区域的长度和氨 基酸组成是决定a r f 分子量和转录调节活性的主要因素【3 l ，4 9 。当m r 中富含谷氨酰胺 ( g l n ) 时，如：a r f 5 、a r f 6 、a r f 7 、a r f 8 ，都为转录激活因子；而当谷氨酰胺的含量 较低时，通常具有转录抑制活性，如a r f i 、a r f 2 、a r f 3 。 a r f 3 e t t i n 突变体存在花发育缺科5 0 ，5 1 】，而a r f s m o n o p t e r o s ( m p ) 突变体维管束的发育 受到阻碍，表现为生长素的极性运输下降5 2 】。功能缺失型突变体a r f t n p h 4 m s g l 和功能 获得型突变体i a a l 9 m s 9 2 在外源生长素处理下下胚轴表型一致【5 3 1 ，表明a r f 和a u x i a a 基因编码的蛋白可能参与了下胚轴生长素响应相关基因转录调控过程。a r f 8 敲除突变 株中，下胚轴的长度增加，3 种g h 3 基因的表达量下降；a r 岔突变体的叶片呈黑绿色， 开花延迟，并且部分不割蚓；当a r f i o 和a r f l 6 基因双突变时，会导致根尖生长缺陷， 形成瘤状树5 5 】。a r f t a f f l 9 双突变体侧根形成破坏和减少向地性。a r f 具体突变体表型 见表2 0 1 ，删 表1 2 ：a r f 基因单突变或双突变的表型 g e n e $ m u t a n t ( s )p h e n o t y p e s r e f s e m b r y o g e n e s i s a r f 5 a r f 7d 羁| 缸昏 s i n g l ec o t y l e d e n h a r d t k e e ta 1 2 0 0 4 a r f 5 n a p s e v e r ed e f e c t si nt h eh a r d t k ea n d f o r m a t i o no f v a s c u l a rs 仃a n d s b e r l e t h ，1 9 9 8 t r o p i s m s a r f la n d a r f 2a r f l a r t 2m o r es e v e r e l y s u p p r e s s e d l ie ta 1 2 0 0 4 h o o l d e s sp h o t y p e a r f 2h s s l s u p p r e s s e d h o o k l e s sl ic t a l 2 0 0 4 p h e n o t y p e 船1 u p h 4 m s g li m p a i r e dh y p o e n t y l s h a r p e r e t a 1 ， p h o t o 仃o p i 2 0 0 0 f l o r a l d e v e l o p m e n t a r f 3e t ta b n o r m a l a p i c a l - b a s a l s e s s i o n se t a 1 ， g y n o e e i u md e v e l o p m e n t 1 9 9 7 r o o ta n d h y p o c o t y lg r o w t h a r f 2l a s s ll i t t l el ie t a l 2 0 0 4 a r f 7 n p h 4 m s g l i m p a i r e d h y p o e o t y l r u e g g e r e t a 1 ， p h o t o t r o p i s m 1 9 9 7 6 r 5 f r f ia r f s 们 n or o o th a r d t k ec t a 1 ， 2 0 0 4 a r f 8a r f 8 1 l o n g e rh y p o c o t y l s t i a ne ta 1 ，2 0 0 4 a r f lo a r f l 6a r f l 0 a r f l 6r o o tc ad e f e c t c h e ne ta 1 ，2 0 0 5 a r f 7 ，a r f l 9毓n | 跬n 9 i m p a i r e dl a t e r a lf o r m a t i o n o k u s h i m ae ta 1 ， 2 0 0 5 5 生长素早期反应基因与a u x r e 生长素早期反应基因是指可以在几分钟内就被有活性的生长素特异性诱导表达的 基因。利用示差杂交筛选法已从不同植物中分离鉴定出3 类主要的生长素早期反应基因： a u x i a a ，s a u r 和g h 3 。a u x i a a 基因编码一种半衰期较短的转录抑制因子，即 a u r d l a a 蛋白。其结构特点在前文已做介绍，在此不再赘述。a u x i a a 基因一般在胚轴 或分生组织中选择性表达，并被生长素特异性诱导表达。当在无生长素的培养基中培养 时，a u x i a am r n a 水平很低，而加入外源生长素几分钟后，其m r n a 水平会迅速增 加。环己亚胺也会诱导a u x i a a 转录物的积累 5 7 , 5 8 。s a u r 基因( 即：m es m a l la u x i n u p r n a ) 最早是在经生长素处理的大豆胚轴中分离出来的。目前已经在拟南芥中分离出 7 0 多种s a u r 基因。该基因通常不包含内含子序列，经生长素诱导，迅速产生一种不 稳定的m r n a ，在其3 端非翻译区含有一段不稳定序列。s a u r 蛋白的分子量大约 9 1 0 k d ，丰度较低，半衰期较短。一般在分生组织中表达较强，经生长素处理后2 5 m i n 内，s a u r 转录物就开始积累。放线菌酮对生长素诱导的s a u r 转录活性没有影响，但 s a u r 转录产物丰度提高，这可能是由于放线菌酮抑制5 a u r m r n a 降解所需的蛋白因子 的合成【5 8 1 。s a u r 蛋白有一个碱性n 两亲性螺旋区，可能是钙调素结合位点，因此该 蛋白可能在涉及钙和钙调蛋白的生长素信号转导途径中起作用【5 9 】，但还缺少直接的实验 证据。g h 3 基因最早也是在大豆苗中分离获得的，在生长素处理5 m i n 后转录活性增加， 环己亚胺对生长素的诱导作用也没有影响。在拟南芥、烟草等植物中也发现多种g h 3 基因。g h 3 基因一般包括3 个外显子，其蛋白产物分子量大约为6 5 n 7 0 k d ，目前对该蛋 白结构的了解还比较岁蚓。研究表明：g h 3 蛋白具有生长素氨基酸合成酶活性，可以 使生长素与一些氨基酸连结，减少游离生长素的浓度，而维持生长素的平衡。如：g h 3 过量表达时， i a a a s p 浓度升高【6 0 。生长素反应基因还编码一些其它蛋白质，如：1 氨基环丙烷1 羧酸合成酶( a c s ) 、谷胱甘肽转氨酶( g s t ) 、c r l l 蛋白、黄素单核苷酸 醌还原酶( f q r l ) 等巾l “j 。 生长素早期反应基因的表达受a r f 蛋白的调控。a r f 通过n - 端d b d 与反应基因 启动子区的a u x r e 序列结合。利用消除分析、接头分区诱变、定点诱变、功能获得性 分析等手段， 分析g h 3 、s a u r l 5 a 和p s i a a 4 5 等基因的启动子区域，鉴定出最基 本的a u x r e 元件t g t c t c ，它广泛存在于复合型和简单型a u x r e 中。复合型a u x r e 在启动子中含有两个协同作用的核苷酸序列，如：g h 3 启动子的d 1 、i m 区域。其中一 个为t g t c t c 序列，是生长素诱导表达的顺式作用元件，在该元件上游还有一个序列 可变的偶联元件，是一种组成型表达的顺式作用元件，不同的组成型元件调节不同反应 基因在组织和器官中选择性表达。只有t g t c t c 元件和组成型元件同时存在时，复合 型a u x r e 基因才具有生长素诱导表达的性质。简单型a u x r e 中只含t g t c t c 或其反 向元件g a g a c a 以正向重复或反向重复的形式存在，重复间通常含有适当长度的序列 间隔，它可以独立启动生长素的诱导作用【5 ”。人工合成的简单型a u x r e 可以使报告基 因被生长素诱导表达。此外，人工合成的a u x r e 已经成为研究生长素反应突变体和鉴 定a r f 蛋白的重要工具。如：a r f l 就是利用p 3 ( 4 ) 为诱饵，从拟南芥的e d n a 表 达文库中筛选出来的【m 。 二、生长素调节基因表达的机理 a u x i a a 的i 、结构域和a r f 的c t d 高度同源。与游离的a r f 或d n a - a r f 形成二聚体，并抑制其d n a 结合能力或转录激活作用【3 0 3 1 ，4 2 ，4 9 】。当生长素浓度升高时， a u x i a a 与a r f 分离，并在泛素蛋白酶降解系统的作用下被降解【1 2 。随着a u x i a a 的降解，a u x i a a 和a r f - a u x i a a 异源二聚体的浓度逐渐降低，a r f 启动生长素反应 基因的表达。通过c t d 结构域形成a r f - a r f 同源二聚体可能会增加a r f 的转录激活 能力，实验发现某些a r f 蛋白的同源二聚体为与a u x r e 结合所必需【3 ”。有实验证明不 含d b d 结构域的a r f 可以通过c t d 与已经结合在a u x r e 上的其它a r f 形成二聚体， 并调节报告基因的表达。但也有实验表明：a r f l 不能形成同源二聚体和异源二聚体， 其与a u x r e 结合的能力并不受影响【3 ”。a u x i a a 蛋白的i 结构域具有转录抑制活性【4 9 1 ， a u x i a a 蛋白对转录活性的抑制作用，可能通过与结合在a u x r e 上的a r f 蛋白结合， 被募集a u x r e 区域，从而在结构域i 的作用下抑制生长素反应基因的转录。 由生长素诱导的泛素蛋白酶体降解系统对a u x i a a 的特异性降解是生长素信号转 导的关键步骤【3 3 ，6 3 ，删。最近发现s c f 7 m 复合体中的f - b o x 蛋白t i r l 是生长素受体，从 而对a u x i a a 的降解机制有了进一步的认识。 当生长素浓度升高时，生长素与t i r i 蛋白结合，引起t i r l 的构象改变，暴露 a u x i a ai i 结构域的识别为点，并与a u x i a a 特异性结合，将a u x i a a 连结到s c f “ 复合体上。a u x i a a 在s c f o m l 的作用下，接受来自e 2 的泛素分子，形成泛素标记，可 以被2 6 s 的蛋白酶特异性识别和降解，导致细胞内的游离a u x 1 分子减少。当游离 的a t m s a a 分子减少时，原有平衡被破坏，a u x i a a - a r f 异源二聚体解离，形成游离 的a u x i a a 和a r f ，而a u x i在s c f r m l 的作用下继续被泛素蛋白酶体系统降解。 生长素信号转导模型如图1 1 。 生长素浓度较低时，a u x i a a 与a r f 形成异源二聚体，抑制基因表达。当生长素 浓度升高时，t 1 r 1 与配体结合，促进a u x i a a 与s c f0 1 r 1 结合，并发生泛素化，然后在 2 6 s 的蛋白酶体作用下被降解。a r f a l a 异源二聚体解体，a r f 激活生长素早期反 应基因转录。 其它一些蛋白因子可能也参与a u x i a a 的降解，但它们在降解过程中的作用尚不十 分清楚。s g t i 蛋白失活时，会增加a u x i a a 的稳定性，生长素反应表型降低。蛋白质 序列分析表明，s g t l b 蛋白与人类的c a n d l 蛋白同源，c a n d l 可以抑制s c f 的组装， r 但s g t i b 对s c f m l 复合体有正调控作用，可以促进a u x a a 蛋白的降解。当s g t i b 蛋白过量表达时，还可以在一定程度上缓解由t i r l 突变引起的生长素反应缺陷【6 5 ，删。 此外，植物中的一种r a cg t p a s e 可以被生长素激活，并促进a u x i a a 的降解。当r a c g t p a s e 活性降低时，生长素诱导的a u x i a a 降解反应减弱。这说明，r a c 在a u x i a a 降解过程中也是一种重要的正调节因子【6 - r 。 图1 1 ：生长素调节基因表达的作用机制 目前的生长素信号转导调控模型实在总结了大量实验结果的基础上提出的，但生长 素信号转导过程中的许多细节还没有阐述清楚，仍需大量的工作来丰富和完善。a r f a r f 二聚体在激活生长素反应基因中的作用；抑制型和激活型a r f 因子的