（遗传学专业论文）小鼠卵子突变基因修饰基因的qtls定位.pdf

河南农业大学2 0 1 0 届硕上研究生学位论文 摘要 自2 0 世纪初，小鼠的遗传学研究从宠物农场进入哈佛大学的实验室只有短短一百年的历 史；但是，由于小鼠基因组与人类基因组高度同源、小鼠基因组改造手段非常成熟以及小鼠 近交系、突变系和工具小鼠品系种类繁多，小鼠遗传学已成为发育生物学、功能基因组学和 疾病机理研究的核心研究领域，小鼠也成为最重要的模式生物之一。 d d k 近交系小鼠，是日本学者从一种属于m m d o m e s t i c u s 亚种起源的德国小鼠培育而 成，其表现出一种被称为“d d k 综合症”( d d ks y n d r o m e ) f f j 奇特繁殖现象：如同品系内交配 一样，d d k 雄鼠能够使其它近交系雌鼠正常受孕。但是，当d d k 雌鼠与同亚种内其它近 交系雄鼠交配时，f l 受精卵在妊娠3 5 日因胚泡形成障碍而死亡，使得d d k 雌鼠几乎不孕。 后经研究证明这种极性不育的特性是由d d k 卵子细胞质物质和其它品系精子因子之间存在 不亲和性引起的，它们二者均受到位于小鼠第l i 条染色体上的卵子突变( o v u mm u t a n t 或o m ) 位点的一对等位基冈所控制。 近年来，赵卫东等发现b 6 遗传背景中存在着卵子突变基因的修饰基因，这些修饰基因使 o m 位点杂合型的雌鼠胚胎死亡率随着其b 6 背景基因频率的增加而升高。同时，也有学者采 用不同的方法和手段先后发现和报道了o m 修饰基冈的存在，但在修饰基因的数目多少和表 达方式上，存在着不同的认识。 本实验旨在探明b 6 小鼠品系中存在的o m 基冈修饰基因的数目及其在染色体上的位置， 从而为研究修饰基因的作用机理打下基础。在赵卫东前期收集1 6 4 个样本的基础上，通过三 年来的努力，顺利获得1 2 5 个样本的表型数据，并完成其中8 6 个样本的全基因组扫描工作。 运用w i n q t l c a r t 软件对8 6 个样本数据进行复合区间作图分析，发现在第4 条染色体上可能 存在胚胎着床数的q t l ，其l o d 值为3 0 ：另外，在第l 、9 、1 4 和1 7 条染色体上也可能 存在q t l s ，它们的l o d 值均达到1 5 以上，此结果与赵卫东的定位结果基本吻合。 本实验还揭示了小鼠胚泡形成过程中多基因调控的事实，初步了解和认识到卵子突变基 因的影响作用及作用规律，为以后开展卵子突变基因的修饰基因( o m m f ) 的功能表达研究 提供了必要的准各。 关键词：小鼠卵子突变基因d d k 综合症修饰基因q t l s 河南农业人学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 l o c a t i n g o fo v u mm u t a n tm o d i f l e rg e n e ( o m m f ) b yq t l si nm i c e s u p e r v i s o r ：p r o f z h a ow e i d o n g m a s t e rc a n d i d a t e ：h u ax i n x i n a b s t r a c tt h eh i s t o r yo fm o u s e g e n e t i c ss t a r t e dw h e nm i c es t r a i n sw e r e i m p o r t e df r o mp e tf a r mt oc a s t l e sl a b o r a t o r yi nh a r v a r du n i v e r s i t ya b o u to n e h u n d r e dy e a r sa g o m o u s eg e n o m ei sh i g h l yh o m o l o g o u st oh u m a na n dc a l lb e m o d i f i e db yv a r i o u sa p p r o a c h e s m o r e o v e r ，t h o u s a n d so fi n b r e ds t r a i n s ，m u t a n ts t r a i n s a n di m p l e m e n t a ls t r a i n sh a v eb e e nd e v e l o p e d t h e r e f o r e ，m o u s eh a sb e c o m et h ek e y m o d e la n i m a lf o rt h er e s e a r c ho fd e v e l o p m e n tb i o l o g y ，f u n c t i o n a lg e n o m i c sa n d d i s e a s em e c h a n i s m t h ei n b r e ds t r a i no fd d km i c ew e r eb r e e d e db yj a p a n e s ef r o mak i n do fg e r m a n i c m i c ew h i c ha t t r i b u t et h em 历d o m e s t i c u ss u b s p e c i f i c a n di ts h o w sa u n i q u ep r o p e r t y k n o w na s “d d ks y n d r o m e ：t h ed d km a l e sc a l ln o r m a l l yf e r t i l i z et h ef e m a l e so f o t h e rs t r a i n sl i k ei nt h es a m es t r a i n ，w h i l et h ef e m a l e so fd d ks t r a i na r en e a r l y i n f e r t i l ew h e nc r o s s e dt om a l e so fo t h e rs t r a i n s ，o w i n gt ot h ef ie m b r y o sf a i l u r eo f b l a s t o c y s tf o r m a t i o nb e t w e e n3 - 5d a y sa f t e rp r e g n a n c y s t u d i e ss u p p o r t e dt h a tt h e p o l a ri n f e r t i l ec h a r a c t e r i s t i ci sc a u s e db ya l li n c o m p a t i b i l i t yb e t w e e nt h ec y t o p l a m i c m a t e r i a l si nd d k o o c y t ea n ds p e r mf a c t o r si no t h e rs t r a i n s ，t h e yw e r ea l lc o n t r o l l e db y a na l l e l eo fo ml o c u sw h i c hh a sb e e nm a p p e do r nm o u s ec h r o m o s o m e11 r e c e n t l yy e a r s ，p r o f e s s o rz h a of o u n dt h e r ew e r et h eo v l l l im u t a n tm o d i f i e r s ( o m m y ) i nb 6b a c k g r o u n d ，w h i c hm a d et h em o r t a l i t yo fe m b r y oa d v a n c e dw i t ht h ea l t e r a t i o n o ft h eg e n e t i cb a c k g r o u n d m e a n w h i l e ，t h e r ew e r es o m es c h o l a r sf o u n dt h em o d i f i e r s t h r o u g hd i f f e r e n tw a y sa n dm e t h o d s ，b u td i f f e r e n tc o n c l u s i o n sw e r ee x i s t e da b o u tt h e n u m b e ro ft h em o d i f i e ra n dt h ew a yi te x p r e s s e d i nt h ep r e s e n ts t u d y ，w em a i n l yt of i n do u tt h en u m b e ro ft h eo v u mm u t a n t m o d i f i e r s ( o m m j ) ，i tw o u l db et h ef o u n d a t i o no fl a u n c h i n gt h ew a y so fm o d i f i e r s s t u d y a f t e r3y e a r s h a r dw o r k i n g ，w ea d dt h ea m o u n to fs a m p l e sa tt h eb a s i co f16 4 d a t aw h i c hp r o f e s s o rz h a oc o l l e c t e da n dh a v eo b t a i n e dt h ep h e n o t y p ed a t ao fa l lt h e 13 7s a m p l e s ，a n da c c o m p l i s h e dt h eg e n o m es c a n n i n go f8 9s a m p l e s a p p l y i n gt h e s o f t w a r eo fw i n q t l c a r ，w ea n a l y z e dt h e8 9s a m p l e sw i t hc o m p o s i t ei n t e r v a lm a p p i n g i ti ss h o w e dt h a tt h e r em a y b ee x i s t e dt h eq t l so fi m p l a n t a t i o ni nt h ef o u r t h 河南农业大学2 0 1 0 届硕j j 研究生学位论文 c h r o m o s o m ew i t ht h el o ds c o r eo f3 o ；i na d d i t i o n ，t h e r em a yb eq t l si nt h e f i r s t ，t h en i n t h ，t h ef o u r t e e n t ha n dt h es e v e n t e e n t hc h r o m o s o m ea n dt h e i rl o ds c o r e s a r ea l la b o v e1 5 t h er e s u l t sw e r ei na c c o r d a n c ew i t hp r o f e s s o rz h a o s b e s i d e s ，t h ep o l y g e n er e g u l a t i o ni nt h ep r o c e s so fm o u s e sb l a s t o c y s tf o r m a t i o ni s c o n f i r m e di nt h i se x p e r i m e n t w h i c hc a nh e l pt of i l a do u tt h ee f f e c ta n da c t i o nl a wo f m o u s e so v u mm u t a n t ，a n dm a k en e c e s s a r yp r e p a r a t i o n sf o rt h ef u r t h e rs t u d yo f o m m f sf u n c t i o ne x p r e s s i n go fo v u mm u t a n t k e yw o r d s ：m o u s e ；o v u mm u t a n tg e n e ；d d ks y n d r o m e ；m o d i f i e rg e n e ；q t l s ； 3 7 致谢 感谢导师赵卫东老师三年来对我学习、研究和生活等方面给予的教导和关 心。在导师的悉心指导下，我顺利的完成了硕士学位论文，在理论知识和科研能 力上都有了很大提高。导师进取的精神、创新的意识、执着的追求和严谨的工作 态度永远是我学习的榜样，高尚的人格魅力将永远激励着我前进。 感谢导师组郑振宇、李春丽老师三年来对我学习、实验以及生活等方面给予 的大力帮助和热心照顾。感谢河南农业大学生命科学学院吴建宇副院长、邱立友 老师、王明道老师等在我研究生学习、论文开题及实验中所提供的宝贵建议和指 导。 感谢河南农业大学动物遗传工程实验室的师兄弟武刚、张天星、郭杰、宋根 娣、雷建、柴保国、宋佳晟、周鑫、王栋、王善强，师姐妹徐雪丽、王婷婷、赵 炎葱、韩露、黄仙仙、张晶在我们朝夕相处的日子里给予我的友爱和帮助。 感谢家人和朋友多年来对我的鼓励和支持，再次感谢所有关心和帮助过我 的老师、同学、朋友和亲人们。 华欣欣 2 0 1 0 年6 月 河南农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 1 文献综述 小鼠( m i c e ) ，学名：m u s m u s c u l u s ，俗名：鼷鼠。从动物分类学的角度讲，它属于动 物界( k i n g d o m ) 、脊椎动物f - l ( p h y l u m ) 、哺乳纲( c l a s s ) 、啮齿( o r d e r ) 、鼠科( s e c t i o no rf a m i l y ) 、 小鼠属( g e n u s ) 、小家鼠种( s p e c i e s ) l l 】。小鼠具有喜欢群居、体型较小、性情温顺、易 于饲养管理等生活习性，以及发育迅速、性成熟早、性周期短、繁殖力强等生殖特征，尤其 是它们还与人类同属于哺乳类物种，因而被作为常用的实验动物，应用于动物的生理学、解 剖学、遗传学，以及医学、兽医学等领域的教学和科研之中1 2 d 1 。 由于小鼠基因组与人类基因组高度同源、小鼠基因组改造手段非常成熟以及小鼠近交 系、突变系和工具小鼠品系种类繁多，小鼠遗传学已成为发育生物学、功能基因组学和疾病 机理研究的核心研究领域，小鼠也成为最重要的模式生物之一1 4 】。近年来，随着小鼠基因组 序列测序的完成【5 1 ，不同小鼠近交系品系特异的微卫星标记或单核苷酸多态性不断被发现 降引，小鼠生理生化表型分析手段和数据也越来越完善，这些前期工作导致了目前大规模的 基冈剔除计划、基因突变计划及构建和分析重组近交系计划的实施。这些计划可能构成未来 1 0 - - 2 0 年中生命科学和医学研究领域最重要的内容之一。 1 1 小鼠的研究历史及现状 目前生物医学研究领域通常所研究的是小家鼠( m u s c u l u s ) ，是一类和人类共居的小型啮 齿动物，在地球上分布广泛，种类繁多。小鼠作为实验材料的最早记载是在1 6 6 4 年，r o b e r t h o o k e 在空中观察了小鼠的反应，这也是小鼠做为科学研究的第一个报告。然后在1 9 0 0 年， 退休的中学教师a b b i el a t h r o p 在其位于马萨诸塞州g 啪b y 的农场里开始饲养一种名为 “f a n c y ”的小鼠，最初这种小鼠作为一种宠物，后来它成了研究中的重要材料。直至1 j 1 9 0 2 年， 哈佛大学的c a s t l e 才在当时孟德尔遗传学研究的影响下开始了小鼠遗传学研究，并在其学生 的帮助下对小鼠的遗传和基冈变化进行系统的分析【9 l 。1 9 0 8 年，w i l l i a mc a s t l e 开设t h a r v l o p b u s s e y 研究所，许多早期的小鼠遗传学家都源于那里。后来为了更好的进行科学研究，人们 开始培育近交系小鼠。1 9 0 9 年c a s t l e 实验室的l i t t l e 得到了第一个近交系小鼠d b a 品系 后，在c o l ds p r i n gh a r b o fl a b o r a t o r y 和t h ej a c k s o nl a b o r a t o r y l 作中陆续得到了c 5 7 b l 6 、 c 3 h 、c b a 和b a l b c 等多种近交系小鼠，这些近交系构成了目前世界上使用最广泛的几种 品系。在这一百年里人们已经建立了近4 0 0 个近交系1 1 0 1 。 近交系是指通过同窝交配保持2 0 代以上，且除自发性突变外，基本上保证全部基因位 点同种性的一种品系。它是在血缘关系极为相近的个体之间或遗传组成相似的个体之间进行 交配繁殖。通过近交使一个种群达到接近完全纯合，即所有同源染色体的相对位置都具有相 同基因的状态。因此，通过同胞兄妹或亲子交配可以较快获得近交系动物。近交可以降低杂 合性，并将群体分离为不同的品系。近交系繁殖是小鼠遗传学研究史中的重要阶段之一，它 彻底改变了发育生物学、癌症研究、组织移植以及免疫学等多领域的研究状况。使用近交系 小鼠的主要优点有【l u ：1 具有相同的基因型，表现型也一致，所以其反应是一致的，实验 2 河南农业大学2 0 1 0 届硕七研究生学位论文 结果上e 确、可靠。由于连续近交繁殖，同一近交系的各个体具有相同的基因型，在相同的环 境条件下又具有相同的表现型，故其性状即其各种生物学特性比较一致，对外来刺激反应也 一致。2 各品系均有其独特的特性，根据实验目的可选用不同品系来作实验，实验重复性 好，所用动物少，实验周期短，节省人力、物力和时间。3 国际上分布广泛，不同国家的 科研单位由于使用同一近交系动物所得结果是相似的，便于国内和国际问学术交流和实验重 复。4 可以作为有价值的病理学模型，如有致癌品系、抗癌品系、致白血病品系，嗜酒性 品系、易抽搐品系等，是研究人类疾病的重要实验材料。5 它是标准的实验材料，动物生 长发育到一定时间就有一定的规格。6 有大量的历史资料可查，每个品系均有其详细的遗 传学资料，遗传背景明确，其生物学特性、生理生化特点、常见疾病( 包括自发性疾病) 等 都有过系统的研究，便于研究者查阅和选择应用。因此，近交系小鼠倍受遗传学、医学、兽 医学等领域科研工作者的青睐。 小鼠作为模式生物相对于其他物种有自身优势。首先，从进化的角度上看小鼠作为哺乳 动物的代表有其不可动摇的地位。除了小鼠以外的四种模式动物至少在2 7 亿年前就在进化 上与人类走到了不同的分支，而小鼠在6 千万年前还和人类共同拥有一个祖先。在2 0 0 2 年 小鼠基因组的测序工作初步完成时，研究者们分析了9 6 小鼠基因组序列。在这其中有9 9 的基冈能在人的基因组序列中找到同源序列，证实了小鼠与人类在基因水平上的高度同源。 同样，小鼠的生理生化指标及其调控机制和人类相同或相似，因此小鼠的研究成果就可以推 演到人类，所以对小鼠进行研究有很大的应用价值。其次，和狗、猴等大型哺乳动物相比， 小鼠的繁殖能力强，生殖周期短。通常实验用的近交系小鼠一胎生育5 1 0 只幼鼠，而远交 群的小鼠的生殖能力更强。这些幼鼠在6 - - - 8 周之后就能达到性成熟的状态，开始繁殖下一 代。同时小鼠没有亲子相残的习性，这样生产后的雌鼠和幼鼠仍可以和雄鼠同笼。这样不但 确保了幼鼠的成活率，同时也能提高交配的频率，确保了繁殖的高效率。小鼠饲养也相对简 单，由于小鼠体积小( 通常成年鼠的体重在2 0 - - 4 0 9 之间) ，所以可以在有限的空间内进行大 规模饲养，因而十分利于进行大规模的实验。再次，小鼠交配时会形成阴栓，这有助于判断 交配的时间，对研究中判断不同发育阶段十分重要。因为其他动物的受精时间通常要通过观 察交配行为来确定，而小鼠的这种特性就使研究人员不必时刻注意实验动物的行为，为工作 提供了便利。小鼠的大多数品系比较温顺，容易抓取和进行实验操作。最后，由于小鼠的这 些特点使其在世界范围内广泛使用，而且形成了各种实验用近交系，使用有基本一致遗传背 景的近交系小鼠所做出的实验结果容易在不同的实验室重复，这就使实验结果更容易被接 受。这也是小鼠作为模式生物的主要优势之一。 小鼠的分子生物学研究进展为揭秘小鼠全部生命遗传奥秘提供了可能。由于不同的小鼠 近交系在生长、发育、代谢、行为等指标上存在着明显的差异，因此，通过这些近交系基因 组的多态性连锁分析，可以建立特定功能表型在基因组上的定位，发现和确定表型与基因型 之间的关系。从最早的简单分析不同近交系的分子多态性，进而采用微卫星标记，最新发展 3 河南农业大学2 0 10 届硕士研究生学位论文 到单核苷酸多态性，使在基因组中将一个表达特定功能或表型的基因定位到l k b 将不再是梦 想【l 玉1 4 】。近年来，在基因组计划完成的基础上，通过化学诱变、d n a “基因陷阱”或转座 子转座作用建立新的突变小鼠品系成为一种时尚，这种以新突变品系的病理表型为出发点， 然后通过突变的染色体定位，最终克隆突变基冈的方法已经大大推动了疾病模型的研究，并 在短期内提供了大量的新的小鼠品系i ”d 7 l 。经典的小鼠遗传学家也找到了新的思路，他们正 在建立上百种通过现有近交系杂交而形成的新的重组近交系t 1 8 1 。通过对这些新的近交系与 母本近交系在生理生化表型和基因型的连锁比较，我们有望对一些复杂性状( 如代谢过程) 的 调控作深入的遗传学分析，从而发现复杂疾病( 包括糖尿病、肥胖症、高血压、免疫失调、 及神经性疾病等) 的发病机理机制。从2 0 0 5 年起，大规模开展基因剔除的研究计划分别在美 国、欧盟和加拿大实施，第一期总投资达l 亿多美元。该计划的最终目标是要将小鼠的3 万多 个基因逐一进行基因剔除，建立基因剔除小鼠品系，从而分析基因的功能i 悖l 。可以预见， 小鼠的突变品系，将在不远的将来达- 至l j 4 5 万个品系。 1 2d d k 小鼠的研究历史及现状 d d k 近交系小鼠，是日本学者从一种属于m 研d o m e s t i c u s 亚种起源的德国小鼠培育而 成1 2 0 】，其携带有卵子突变基因( o v u mm u t a n t 或o m ) ，并表现出一种被称为“d d k 综合症”( d d k s y n d r o m e ) 的奇特繁殖现象：如同品系内交配一样，d d k 雄鼠能够使其它近交系雌鼠正常受 孕。但是，当d d k 雌鼠与其它近交系雄鼠交配时，f l 受精卵在妊娠3 5 日冈胚泡形成障碍而 死亡，使得d d k 雌鼠几乎不孕【2 1 2 3 1 。 有关“d d k 综合症”及o m 基因的研究，国外主要集中在3 个国家：美国、法国和日本【2 啦6 1 。 美国小组的研究方向主要是o m 位点的基冈传递率扭曲和锄基因在小鼠克隆胚胎中的表达 等方面【2 7 。2 9 j ；法国小组的研究集中在对o m 基因碱基序列的解析方面1 3 0 , 3 1 】；日本研究小组则 主要集中于d d k 综合症的组织胚胎学和o m 修饰基因的研究 3 2 , 2 5 1 ；国内除河南农业大学赵卫 东研究小组外，尚未见相关研究报道。赵卫东曾在日本参与相关研究，回国后主要致力于 o m 修饰基冈和精卵亲和性研究1 3 3 - 3 5 l 。 1 2 1o m 基因的发现 1 9 6 0 年，日本学者t o m i t a j l 匝过d d k 品系与k k 品系的正反交实验发现：当d d k 品系雌鼠 与k k 品系雄鼠交配时，平均胎仔数为2 24 - 0 5 ，但是当k k 品系雌鼠与d d k 品系雄鼠交配时， 平均胎仔数为6 74 - 0 8 。同时，他在d d k 品系与k s a 品系的交配实验中也发现了类似的情况 【2 们。1 9 9 0 年，b a b i n e t 等以d d k 品系和b a l b c 品系作为实验动物，得到了与t o m i t a l 9 6 0 年研 究相类似的结果，并把这种奇特的繁殖现象命名为“d d k 综合症”p 6 1 。1 9 6 7 年，w a k a s u g i 在 t o m i t a l 9 6 0 年研究的基础上，采用d d k 品系、k k 品系与n c 品系作为实验动物，通过采集 d d k 早x k k 3 和d d k 2 n c 3 不同时期的受精卵，研究发现2 细胞期、4 细胞期、8 细胞期与 桑葚胚胚胎发育正常，但当胚胎发育从桑葚胚到胚泡的过程中( 妊娠3 5 日) ，胚泡形成障 碍，胚胎因不能着床而死亡1 2 。七十年代，基于交配实验结果的遗传分析，w a k a s u g i 提出 4 河南农业大学2 0 1 0 局顶一七研究生学位论文 了解释这一现象的遗传假谢”j ，其要点如图1 所示i ”】： ( 1 ) ( d d k 早x 其它品系d ) fz 代胚 胎死亡的原因，是由于卵子细胞质因子( c y t o p l a s m i cf a c t o ro f e g g s ) 与精子冈子( s p e r mf a c t o r ) 的不亲和性造成的，而这些不亲和性因子的产生均受到位于染色体同一位点上的一对等位基 冈控制；( 2 ) d d k 占i ! n 系染色体上存在的是卵子突变基因( 锄) ，它分别控制着0 卵子细胞 质因子和s 精子因子的合成：而其它品系的相同位点上存在的是正常基因“+ ”，它分别控 制着“o ”卵子细胞质冈子和“s ”精子因子的合成；( 3 ) 在这些因子形成的四种组合中，只有 当带有“o ”的卵子和带有“s ”的精子相遇( o s ) 时，才形成卵子细胞质冈子与精子因子的不 亲和型，导致胚胎正常发育受阻并最终死亡；而其余三种组合( o s 、o s 、o s ) ，则 全部为亲和型，从而使胚胎能够正常发育并最终产仔。后来，这一假说得到了卵子细胞质移 植和受精卵原核移植实验的证明1 36 1 ，d d k f i ；j 子细胞质冈子作为一种r n a 分子的存在也已被 确认( 改称为卵子细胞质物质) p8 1 。 c o m p a t i b l ec o m p a t i b l ei n c o m p a t i b l ec o m p a t i b l e a l i e ne 9 8 ( o ) a n d d d ks p e r m ( s ) a l i e n e g g ( o ) a n d a l i e ns p e r m ( s ) d d k e g g ( o ) a n d a l i e ns p e r m ( s ) d d ke g g ( o ) a n d d d k s p e r m ( s ) 图i小鼠1l 号染色体上卵子突变基因控制的卵子细胞质物质与精子因子相互作用 注：实验室大多数小鼠的正常卵子突变位点产生的卵子细胞质物质和精子因子分别表示为“0 s ”，d d k 小鼠卵子突变位点产生的卵子细胞质物质和精子因子分别表示为“o ”“s ”，在卵子细胞质物质与精子因子 的组合中，只有在“o ”和“s ”的组合中是不亲和的，其它三种组合( o s ，o s 手l l o s ) 均为亲和的。 f i g i i n t e r a c t i o n sb e t w e e nc y t o p l a s m i cf a c t o r so fe g g sa n ds p e r mf a c t o r sc o n t r o l l e db yt h ea l l e l e sa to v u m m u t a n tc o r n ) l o c u so nm o u s ec h r1i n o t e ：t h en o r m a la l l e l ea tt h eo ml o c u sp o s s e s s e db yt h em a j o r i t yo fl a b o r a t o r ym o u s es t r a i n sp r o d u c e sa c y t o p l a s m i cf a c t o r ( o ) i nt h eo o c y t ea n das p e r mf a c t o r ( s ) t h ea l l e l eo fd d k s t r a i nm a k e sac y t o p l a s m i cf a c t o r ( o ) a n das p e r mf a c t o r ( s ) t h ec o m b i n a t i o nb e t w e e nt h ec y t o p l a s m i cf a c t o r ( o ) a n dt h es p e r mf a c t o r ( s ) i s i n c o m p a t i b l e ，a n do t h e rt h r e ec o m b i n a t i o n s ( o - s ，o - sa n do s ) a r ec o m p a t i b l e 1 2 2o m 基因的定位 九十年代，许多学者分别通过微卫星分子标记等方法，对o m 基因定位展开了研究：1 9 9 2 年，b a l d a c c i 等采用d d k 品系3 1 1 b a l b c 品系作为实验动物，将o m 基因定位在第1 1 条染色体 上，且与酒p 位点紧密连锁；1 9 9 2 年，s a p i e n z 等采用d d k 品系和c 5 7 b l 6 品系作为实验 动物，将o m 基因定位在第1 l 条染色体上接近) c m v 4 2 位点的位置【4 0 】：1 9 9 6 年，b a l d a c c i 等采 河南农业大学2 0 1 0 届硕士研究生学位论文 用d d k 品系和b a l b c 品系作为实验动物，将o m 基因定位在第1 1 条染色体上引物s e y a 2 和 d l l m i t 3 6 之间2 c m 的位置【4 l l ：1 9 9 6 年，p a r d o - m a n u e ld ev i l l e n a 采用d d k 品系和c 5 7 b l 6 品系 作为实验动物，将o m 基因定位在第l l 条染色体_ l d l l m i t 3 8 和d 1 1 m i t 6 6 芝l 剐4 2 1 ；1 9 9 7 年， p a r d o m a n u e ld ev i l l e n a 采：用d d k 品系和c 5 7 b l 6 品系作为实验动物，将o m 基因定位在第1 l 条染色体上接近瑚，位点的位置 4 3 1 ；2 0 0 0 年，p a r d o - m a n u e ld ev i l l e n a 采用d d k 品系和 c 5 7 b l 6 品系作为实验动物，将o m 基因定位在第ll 条染色体j _ d l l m i t 3 5 4 和d j n 衙配之间大 约4 7 c m 的位置l ( 图2 ) ，从此，“d d k 综合症”也已作为研究小鼠早期胚胎发育中双亲基 因型与卵子细胞质相互作用机理的很好模式而被应用。 7 10c mi l 陋1 7 l l m i t 2 0 1 m i t 6 7 i m 诬6 l j m i l l 6 8 图2 第l l 条染色体上o m 位点的连锁图 f i g 2 m e i o t i cm a po f t h eo mr e g i o no nm o u $ ec h r o m o s o m e ，j 1 2 3o m 基因的其他相关研究 d d k 综合症的胚胎死亡发生在8 细胞到1 6 细胞期的过渡期，细胞学观察发现，这个时 期的胚胎自发的发生了去聚缩化，胚胎细胞因无法正常形成内细胞团和滋养外胚层而死亡， m i a b u e h r 等在细胞培养实验中发现，用甲胺处理培养基提高细胞内p h 值可以明显提高 d d k c 3 h 型胚胎在1 6 细胞期的存活率，但是一旦去聚缩化发生，这种处理已经没有效果。 6 硒强 一一一|萋 巧 绾腮巧o i 室 脚嬲删枷 ， d d d d d d d d d d 河南农业大学2 0 1 0 届硕上研究生学位论文 用间隙连接抗体处理胚胎细胞d d k d d k 型合子细胞和d d k c 3 h 型胚胎，一样发生了凋亡 1 4 列。据此推测，d d k 综合症影响了细胞的间隙连接，造成细胞间通讯或物质交流异常，导 致胚胎发育阻断。最新研究证实，f l ( d d k 早b 6 古) 的胚胎在发育中和细胞内有机酸和羧 酸代谢相关的基因与对照组胚胎表达量相比显著升耐4 6 1 ，这便可以解释f l ( d d k 早x b 6 8 ) 胚胎在发育过程中细胞p h 值偏低以及细胞间隙连接弱化的现象：这些基因的高表达导致细 胞内p h 值下降，而细胞间p h 的下降正是导致间隙连接渗透率下降的主要原因1 4 卯。 o m 基因已经精细定位在小鼠第l l 号染色体上远端4 7 e m 处大约2 c m 的范围内， c o h e n t a n n o u d j i 4 7 1 以及s t e 7 p h a n i el eb r a s 等使用外显子捕获等技术筛选了若干候选基因 【4 3 l ，这为o m 基因的图位克隆或定位候选克隆提供了重要依据。r e n a r d 等发现所谓的卵子 细胞质物质是以r n a 分子的形式存在的1 3 引，并且通过二维变性聚丙烯酰胺蛋白电泳，c h a r l e s b a b i n e t 等在d d k 胚胎中发现并分离到了一个特异表达的蛋白d 1 4 ，这种蛋白在胚胎发育的 一细胞期( 生发泡破裂后几个小时) 开始合成，在2 细胞期的合成停止，继而稳定存在到8 细 胞期，这种蛋白合成的停止与合子基因组的活动并无直接的关系，并且在其它供试的7 种纯 系小鼠中未检测到d 1 4 的表达。但r i c h o u x l 4 4 1 等人在w m p ( d o m e s t i c s ) 、m b t 、m a i 和p w k 这几种小鼠的胚胎发育过程中发现有特异蛋白的合成，其中w m p 的特异蛋白为d 1 4 ，在 p w k 中检出的蛋白和d 1 4 极为相似，并且细胞学定位发现，d 1 4 在小鼠早期胚胎的胞质和 细胞核内均有表达，对在合子基因转录激活前的蛋白质功能的研究将有助于揭示母源冈子对 合子发育的影响【4 9 1 。 1 3 基因定位方法 基因定位( g e n el o c a t i o n ) 是用一定的方法将基因确定到染色体的实际位置。这是现代 遗传学的重要研究内容之一。将不同的基冈确定于染色体的具体位置之后，即可绘制出基因 图( g e n em a p ) 。基因定位可从家系分析、细胞、染色体和分子水平进行研究，同时由于使 用手段的不同派生出多种方法，不同方法又可联合使用，互为补充。现仅就几个主要方法加 以说明。 1 3 1 体细胞杂交法 体细胞是生物体除生殖细胞外的所有细胞，将从身体分离的体细胞做组织培养进行遗传 学研究的学科称为体细胞遗传学( s o m a t i cg e n e t i c s ) 。体外培养细胞可人为控制或改变环境 条件，并可建立细胞株，长期保存，进行各种正常和病理研究。与基因定位有关的是体细胞 杂交( s o m a t i cc e l lh y b r i d i z a t i o n ) 。细胞杂交又称细胞融合( c e l lf u s i o n ) ，是将来源不同的 两种细胞融合成一个新细胞。大多数体细胞杂交是用人的细胞与小鼠、大鼠或仓鼠的体细胞 ( h y b r i dc e l l ) 进行杂交。这种新产生的融合细胞称为杂种细胞( h y b r i dc e l l ) ，含有双亲不同 的染色体。杂种细胞有一个重要的特点是在其繁殖传代过程中出现保留啮齿类一方染色体而 人类染色体则逐渐丢失，最后只剩一条或几条，其原因至今不明。这种仅保留少数甚至一条 人染色体的杂种细胞正是进行基因连锁分析和基因定位的有用材料。 7 河南农业大学2 0 1 0 届硕 ：研究生学位论文 1 3 2 克隆嵌板法 克隆嵌板法( c l o n ep a n e lm e t h o d ) 是应用杂种细胞保留或丢失人染色体有时有重叠现象 而设计的一种简便有用的基因定位方法。如表l 所示，选择3 个都保留有4 条人染色体的杂 种细胞克隆，但染色体各不相同。如果某一表型特征只出现于克隆a 、c 而不见于b ，就可 决定该特征的基因只能在3 号染色体上，因为a 、c 克隆都有3 号染色体，而b 克隆则无， 其它亦可同理判断。这样3 个克隆可对8 条( 2 3 = 8 ) 染色体作出判断：如果是5 个克隆( 2 5 = 3 2 ) 就可对人类2 2 条常染色体和2 条性染色体作出判断。例如半乳糖激酶( g k ) 、尿苷磷酸 激酶( u m k ) 和氨基已糖菅酶a ( h e x a ) 的基因就是用此法分别定位于人的1 7 号、1 号 和1 5 号染色体上的。此外，还可对杂种细胞进行特殊染色，来识别杂种细胞中人和鼠染色 体，以助基冈定位。 表l 克隆嵌板法示意 t a b l e1t h ec l o n ep a n e lm e t h o d 1 3 3 原位杂交和荧光原位杂交 原位杂交( i ns i t uh y b r i d i z a t i o n ) 是分子杂交技术在基因定位中的应用，也是一种直接 进行基因定位的方法。其基本原理是碱基的互补配对，同源的d n a d n a 双链或d n a r n a 链在一定条件下能结合成双链，用放射性或非放射性物质标记的d n a 或r n a 分子作为探 针，可探测到细胞基因组中的同源部分。原位杂交的特点是杂交在显微镜载玻片上中期染色 体标本上进行。所谓原位即指标本上d n a 原位变性，在利用放射性或非放射性标记的已知 核酸探针杂交后，通过放射自显影或非放射性检测体系来检测染色体上特异d n a 或r n a 顺序，可用放射性颗粒在某条染色体的区带出现的最高频率或荧光的强弱来确定探针的位 置，从而进行准确的基冈定位。但原位杂交必须在已知探针的情况下方可进行，而在未知致 病基因时，则无法进行基因定位。放射性同位素标记核酸探针与染色体显带结合进行原位杂 交仍有不少缺点和局限性。例如需要使用放射性同位素的特殊实验室，自显影曝光时间长， 同位素标记的探针不易保存，放射污染不利健康，特别是高质量的中期染色体标本在细胞培 养基础上难以得到，观察费时，对间期核的研究难以进行等。 荧光原位杂交( f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ，f i s h ) 是一种非放射性原位杂交方 法。用特殊荧光素标记核酸( d n a ) 探针，可在染色体、细胞和组织切片标本上进行d n a 杂交，对检测细胞内d n a 或r n a 的特定序列存在与否最为有效。探针不是放射性的而是 将荧光染料与抗体蛋白结合进行检测。它们具有高度亲和力，有与放射性探针相同或更高的 8 河南农业大学2 0 1 0 届硕十研究生学位论文 分辩率。现已可用不同的荧光染料同时进行多重原位杂交，显示出不同的荧光色泽。这种多 色f i s h 技术近年来发展迅速，已成为基因定位作图和医学诊断的重要手段。 1 3 4 连锁分析 基因定位的连锁分析是根据基因在染色体上呈直线排列，不同基因相互连锁成连锁群的 原理，即应用被定位的基因与同一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的特点进行定位。生 殖细胞在减数分裂时发生交换，一对同源染色体上存在着两个相邻的基因座位，距离较远， 发生交换的机会较多，则出现基因重组；若两者较近，则重组机会较少。重组d n a 和分子 克隆技术的出现，发现了许多遗传标记位点，利用某个拟定位的基因是否与某个遗传存在连 锁关系，以及连锁的紧密程度就能将该基因定位到染色体的一定部位，使经典连锁方法获得 新的广阔用途，成为人类基因定位的重要手段。 从分子水平进行基因定位，还有不少有效的新技术，它们相互配合使用，使基因定位得 到迅速发展。例如，利用染色体自身结构及染色体畸变法进行缺失作图和基因剂量法等。总 之，人们已不只是用单一技术进行基因定位，而是将细胞、染色体和分子水平技术结合起来， 综合分析，互相印证，以达到快速、准确基因定位的目的。 1 4 分子标记技术 1 4 1 分子标记的概念 分子标记是以个体间遗传物质内核营酸序列变异为基础的遗传标记，是d n a 水平遗传 多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相 比，d n a 分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分 便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量儿乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同 组织的d n a 都可用于标记分析；分子标记揭示来自d n a 的变异；表现为中性，不影响目 标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现 在d n a 分子标记技术已有数十种，