Western-blot实验操作步骤.docx

Western blot实验步骤一、 制备蛋白样品（单层贴壁细胞总蛋白提取）1.倒掉细胞培养液,加3ml预冷的PBS洗涤细胞，重复两次，弃掉PBS后将细胞培养瓶置于冰上。2.裂解液RIPA(强)1ml +PMSF10ul(100:1),两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞，冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。3.裂解完后，用细胞刮将细胞刮于一侧（动作要快），转移至ep管中.4.4度，12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中，用于后续实验（-80保存） 常用蛋白收样：倒掉细胞培养基后，预冷PBS洗涤细胞2次，弃去，再加入1ml PBS，用细胞刮轻轻刮取细胞，转移至1.5ml ep管中，12000rpm，离心5min，尽量吸净上清，沉淀于-80保存，用于后续实验。 融化蛋白样品，加入RIPA+PMSF细胞裂解液（200ul/ep管），充分混匀，冰上裂解20min，4度离心，5min ，12000rpm，小心吸取上清至新的ep管中。二、蛋白浓度测定(BCA法)BCA(碧云天)蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul。 在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。标准蛋白BSA浓度：5mg/ml (-20保存) ,完全溶解蛋白标准品，取10ul稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml(ug/ul)。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。1. 配置BCA工作液 A液 ： B液= 50 : 1 ，混匀 A液+B液=200ul (每个样本)样本数量： 7个标准品 + N 个待测蛋白样本2. 先将每孔加入200ul BCA工作液，再加入蛋白样本。（96孔板）,总体积为10ul.待测蛋白样本先10倍稀释。96孔编号#1#2#3#4#5#6#7BSA标准蛋白0ul1ul2ul4ul6ul8ul10ulddH2O10ul9ul8ul6ul4ul2ul0ul96孔待测蛋白样本1待测蛋白样本2待测蛋白样本3待测蛋白样本N10ul/well3.37度，温箱中孵育30min。562nm波长，测OD值。待测蛋白样品浓度在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。4.根据所测样品的OD值，绘制标准曲线。根据标准曲线即可计算样本相应的蛋白含量，除以样本稀释液总体积（10ul）,再乘以样本稀释倍数，即为样本的实际浓度（ug/ul）5.蛋白定量后，以最小蛋白浓度为标准，将各组蛋白样本调至相同浓度（ddH2O补齐）绘制标准曲线：X轴为蛋白质量，Y为OD值 插入XY散点图,选中图上一点，右键，添加趋势线选项（显示公式，显示R2，R20.99有意义）三、蛋白变性1.室温融解SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（溴酚蓝染料）（2x 或 5x）2.将适量蛋白样本与SDS-PAGE上样缓冲液混合，使其终浓度为1x3.100度或沸水煮3-5min，充分变性蛋白。冷却至室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。或冷却后-80保存用于后续实验。四、蛋白电泳1配胶：根据配胶试剂盒操作步骤,按照目的蛋白分子量大小，选择相应浓度的分离胶。配胶时最后加10%过硫酸铵和TEMED.每板分离胶5ml，浓缩胶3ml.短板在内侧。配好后如暂时不用，可将胶板取下，电泳液中浸泡，4度保存。2.配电泳液 1x 甘氨酸-Tris电泳缓冲液1L Tris 3.03g 甘氨酸 14.4g SDS 1g3.蛋白上样： 样本10-30ul(保证蛋白质量最少为30ug) 20-25ul 蛋白Marker 5ul 选择较好的孔加样，并记录加样位置4.连接电极，跑电泳：电泳条件 80V,30min(蓝色条带到达浓缩胶底部)-110V,90min(参考Marker的位置，蓝色条带跑到胶底部即可)五、转膜1.配转膜液：1L Tris 3.03g 甘氨酸14.4g,加水至800ml，最后加甲醇200ml，调至总体积为1L.2.切胶： 起胶时将胶留在长玻璃板上，将裁减好的膜做好标记后浸泡在转膜液中。确定目的蛋白的位置（根据Marker条带），切胶，保留目的蛋白位置，将膜置于胶上，膜数字面在上，背面与胶相贴，数字标记端贴在Marker上。3. 准备转膜：按如下顺序阳极（红）滤纸膜胶_滤纸阴极（黑）4. 连接电极，转膜： 90V,90min六、封闭1.配封闭液：0.5g 脱脂奶粉 + 10ml PBS2.取下膜，注意蛋白在膜与胶贴合的一面，取下后将膜有蛋白面朝下，封闭1小时七、抗体孵育配抗体稀释液：0.5g 脱脂奶粉，10ul Tween, 10ml PBS配洗膜液：100ul Tween + 100ml PBS一抗孵育，4度过夜次日，洗膜液洗4