（园林植物与观赏园艺专业论文）菝葜组织培养及植株再生体系的建立.pdf

摘要 本研究对菝葜组织培养快速繁殖技术进行了探索。以菝葜的带芽茎段、茎段及叶 片为材料，系统地研究了菝葜组织培养直接和间接器官发生途径的各个培养阶段中基 本培养基、生长调节剂和活性炭等因素的影响，筛选出了各阶段的适宜培养基，成功 地获得了菝葜再生植株，建立了系统的菝葜植株再生体系。试验结果如下： 菝葜外植体最佳取材时间是4 月初，启动率高，污染率和褐化率相对其他月份 较低。带芽茎段、茎段和叶片的启动率分别是：9 3 3 3 、7 5 0 0 、5 3 3 3 ；污染率分 别是：1 3 3 3 、1 6 6 7 9 ( , 、2 1 6 7 ；褐化率分别是：3 5 0 0 、4 3 3 3 、5 1 6 7 。 菝葜带芽茎段和茎段的最佳灭菌时间是0 1 h g c l ：处理5 m i n ，叶片最佳灭菌时 间是0 1 h g c l ：处理3 m i n 。 防褐化处理：叶片切割成1 o x1 0c m 大小有利于减轻褐化，褐化率为3 5 0 0 ； 外植体进行暗培养1 0 天后，带芽茎段、茎段和叶片三种外植体的褐化率都降到最低， 分别为2 0 0 0 、2 6 6 7 、3 0 0 0 。 带芽茎段腋芽的诱导：以当年生枝条上的带芽茎段为外植体，最适合带芽茎段 腋芽诱导的培养基配方是：m s + 6 一b a l o o m g l + n a a o 0 1m g l + i b h0 0 5m g l ，诱导率 为7 5 0 0 ，褐化率为1 6 6 7 。 愈伤组织的诱导：当年生枝条上的茎段和叶片诱导愈伤组织失败，而以无菌苗 的茎段和叶片作外植体成功地诱导出了愈伤组织。适合无菌苗茎段和叶片愈伤组织诱 导的最佳培养基配方分别是：m s + 6 一b a 2 o o m g l + n a a o 0 5 m g l + 2 ，4 一d 2 o o m g l 和 m s + 6 一b a 2 o o m g l + n a a o 1 0 m g l + 2 ，4 一d 2 o o m g l ，出愈率分别为3 6 6 7 和4 3 3 3 。 腋芽的增殖培养：适合腋芽增殖的最佳培养基配方是：m s + 6 - b a 2 0 0m g l + n a a 0 1 0m g l ，增殖倍数4 3 0 ，有效苗数2 4 0 。 愈伤组织的增殖与分化：适合愈伤组织增殖培养的最佳培养基配方是： m s + 6 一b a 2 o o m g l + n a a o 1 0 m g l + 2 ，4 一d 3 o o m g l ，增殖率是6 0 o o ；适合愈伤组织分 化的最佳培养基配方是：m s + 6 一b a i o o m g l + n a a o 1 0 m g l ，分化率是4 8 8 9 。 壮苗与生根培养：适宜菝葜生根的最佳培养基配方是：1 4 m s + n a a 3 o o m g l + a c 1 o o g l ，生根率为8 0 0 0 ，平均生根数为4 o o 。添加活性碳的培养基对生根诱导的 效果更好。 炼苗与移栽：适合菝葜炼苗的最佳基质为珍珠岩、蛭石、河沙= 3 ：2 ：1 的方 案，移栽苗成活率达到最高，为8 6 6 7 。 关键词：菝葜组织培养植株再生 s t u d i e so nt i s s u ec u l t u r ea n dp l a n tr e g e n e r a t i o no f s m i l a xc h i n al l iq i n g ( o r n a m e n t a lp l a n t sa n dh o r t i c u l t u r e ) d i r e c t e db yp r o s h id a - x i n g a b s t r a c t t h es t u d yw a sm a i n l yt op r o b ea ne f f i c i e n tw a yt h r o u g ht i s s u e sc u l t u r ea n dr a p i d p r o p a g a t i o no f s m i l a xc h i n al t h es t e m sw i t ha x i l l a r yb u d s ，s t e m sa n d l e a v e sw e r et a k e n a se x p l a n t s t h ef a c t o r st h a ta f f e c te v e r ys t e pi n c l u d i n gb a s i cm e d i u m ，h o r m o n ea n da c t i v e c a r b o nw e r ed e t a i l e di n v e s t i g a t e dt h r o u g ht h ed i r e c ta sw e l la si n d i r e c tw a y a sar e s u l t ，t h e o p t i m u mm e d i u m so fe v e r ys t e pw e r es c r e e n e d ap l a n tr e g e n e r a t i o ns y s t e mo fs m i l a x c h i n al w a se s t a b l i s h e di nt h i sr e s e a r c h t h em a i nr e s u l t sa r eb e l o w ： ( ! ) a p r i lw a st h eb e s ts e a s o nt od r a we x p l a n t s i na p r i l ，t h eg e r m i n a t i o nr a t ew e r e 9 3 3 3 ，7 5 0 0 a n d5 3 3 3 b ys t e m sw i t ha x i l l a r yb u d s ，s t e m s ，a n dl e a v e sr e s p e c t i v e l y ， t h ec o n t a m i n a t e dr a t ew e r e1 3 3 3 、1 6 6 7 、2 1 6 7 b ys t e m 、 ，i t l la x i l l a r yb u d s ，s t e m s a n dl e a v e sr e s p e c t i v e l y ，t h eb r o w n i n gr a t ew e r e3 5 0 0 、4 3 3 3 、51 6 7 b ys t e m s 、7 l ，i t l l a x i l l a r yb u d s ，s t e m s ，a n dl e a v e sr e s p e c t i v e l y 5m i n u t e sw a sg o o dt ot r e a tt h es t e m sw i t ha x i l l a r yb u d sa n ds t e m sb yo 1 h g c l 2 3m i n u t e sw a sg o o dt ot r e a tl e a v e sb y0 1 h g c l 2 d i f f e r e n tt r e a t m e n t so fc o n t r o l l i n gb r o w n i n g ：c u t t i n gt h el e a v e si n t o1 0 c m 2w a sa l l a p p r o p r i a t ew a y d a r kt r e a t m e n tf o r10d a y sw a st h eb e s tw a yf o rd e c r e a s i n gb r o w n i n g r a t e t h eb r o w n i n gr a t e sw e r e2 0 0 0 ，2 6 6 7 a n d3 0 0 0 a n db ys t e mw i t ha x i l l a r yb u d s ， s t e m ，a n dl e a v e sr e s p e c t i v e l y i n d u c t i o no fa x i l l a r yb u d so ns t e m s ：t h es t e m sw i t ha x i l l a r yb u d s o fy o u n g b r a n c h e sw e r et a k e na se x p l a n t s t h eo p t i m u mc u l t u r em e d i u mf o ra x i l l a r yb u d si n d u c t i o n w a sm s + 6 一b a i 0 0 m g l + n a a 0 0 1m g l + i b a 0 0 5 m g l ，t h ei n d u c t i o nr a t ew a s7 5 0 0 ，t h e b r o w n i n gr a t ew a s16 6 7 ( 亘) i n d u c t i o no fc a l l u s ：t h es t e m sa n dl e a v e so fy o u n gb r a n c h e sf r o mo p e na i rc a nn o t u s e df o ri n d u c i n gc a l l u s h o w e v e r , t h ea s e p t i cs t e m sa n dl e a v e si nv i t r oc a nb eu s e df o r i n d u c i n gc a l l u s ，a n dt h eo p t i m u mm e d i u mw a sm s + 6 一b a 2 0 0 m g l + n a a 0 0 5 m g l + 2 ， 4 - d 2 0 0 m g la n dm s + 6 - b a 2 0 0 m g l + n a a 0 10 m g l + 2 ，4 - d 2 0 0 m g lr e s p e c t i v e l y t h e i n d u c t i o nr a t e sw e r e3 6 6 7 a n d4 3 3 3 r e s p e c t i v e l y ( g ) p r o l i f e r a t i n gc u l t i v a t i o no fa x i l l a r yb u d s ：t h eo p t i m u mc u l t u r em e d i u m o fp r o l i f e r a t i n ga x i l l a r yb u d sw a sm s + 6 一b a 2 0 0 m g l + n a a 0 10 m g l t h em u l t i p l i c a t i o nr a t ew a s 4 30 t h ee f f i c i e n c ys h o o t si s2 4 0 ( i ) p r o l i f e r a t i n ga n dd i f f e r e n t i a t i n gc u l t i v a t i o no fc a l l u s ：t h eo p t i m u mc u l t u r em e d i u m o fp r o l i f e r a t i n gc a l l u sw a sm s + 6 一b a 2 0 0 m g l + n a a 0 10 m g l + 2 ，4 一d 3 0 0 m g l ，p r o l i f e r - a t i n g r a t ew a s6 0 0 0 t h eo p t i m u mc u l t u r em e d i u mo fd i f f e r e n t i a t i n gc a l l u sw a s m s + 6 一b a l 0 0 m g l + n a a 0 1 0 m g l ，d i f f e r e n t i a t i n gr a t ei s4 8 8 9 。( 查) r o o t i n gc u l t u r e ：t h eo p t i m u mc u l t u r em e d i u mf o rr o o t i n gw a s1 4 m s + n a a 3 o o m g l + a c1 0 0 9 l t h er o o t i n gr a t ew a s8 0 0 0 ，a n di tw a sh i g h e ri nc u l t u r em e d i u m w h i c hw a sa d d e da c t r a n s p l a n t i n g ：t h et r a n s p l a n tm e d i u mi nv e r m i c u l i t e ，p e r l i t ea n dr i v e r s a n db y3 - 2 ： 1i st h eo p t i m a lf o rs m i l a xc h i n al i nw h i c hs u r v i v a lr a t ew a s8 6 6 7 k e yw o r d ：s m i l a xc h i n al t i s s u ec u l t u r ep l a n tr e g e n e r a t i o n j v 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取 得的成果。尽我所知，除了文中特要l , j j n 以标注和致谢的地方外，学位论文中不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学 或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研名：鹰戊 椰 关于论文使用授权的声明 衫月司日 i 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四j i i 农业 大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 一始痞式 导师签辐：嬲场， y p 阳形年月af 日 乃形莎年钐月罗日 1 前言 菝葜( s m i l a xc h i n al ) 是百合科( l i l i a c e a e ) 菝葜属( s m i l a xl ) 的多年生攀援 灌木。菝葜的根、茎、叶均可入药，尤以根茎入药最为常见。菝葜根茎主要包含皂苷 类、黄酮类等各种化学成分，具有消肿解毒、祛风利湿、抗炎镇痛、抗肿瘤等药理活 性。除此以外，菝葜的果色红艳，嫩芽鲜红，树形优美，叶形奇特。而且菝葜具有攀 援习性，可用其攀附岩石、假山，可作地面覆盖物，也可用于路边、林缘，增加自然 野趣。随着工业和经济的发展，城市化进程的加快，在城市中越来越多的建筑出现使 得人口密度加大，人们拥有的绿色空间越来越少，渐渐地，人们开始关注起攀援植物。 攀援植物作为城市绿化的重要材料，以其占地少，投资小，绿化效益高等优点，成为 扩大绿化面积的有效途径之一，对形成优美的园林景观和改善城市生态环境有着其它 植物不可替代的作用，可谓一枝独秀。难怪，攀援植物堪称真正的园艺师，所以攀援 植物资源的开发利用是一研究热点。 由于很多攀援植物处于野生状态，未被人们大量开发利用，所以用于城市立体绿 化的植物种类不多，加上我国气候多样，有的地方夏季干旱酷热、冬季严寒多风，限 制了许多攀援植物在城市中的生长和应用。因此，利用现代生物技术手段培养适应各 种环境生长的新品种，对于解决观赏攀援植物在城市应用中出现的各种问题具有十分 重要的意义。植物离体培养再生体系的建立既可以将自然或人工选择的遗传优良个体 实现快速繁殖，迅速拓展野生资源，满足市场要求，同时也为体细胞克隆与基因工程 育种奠定一定的经验工作。 2 文献综述 2 1 菝葜的研究概况 2 1 1 菝葜的生物学特性 菝葜是菝葜属的一个种，菝葜属植物主要分布在全球热带地区，东亚和北美的温 暖地区及地中海一带亦有少量分布，共3 0 0 种左右，我国有6 4 个种和一些变种n 1 。 菝葜是攀援灌木，植株具粗大、坚硬和不规则的块状根茎。生于海拔2 1 5 0 米下的 灌丛中、林下、溪旁、山谷或山坡上。茎长1 5 m ，散生皮刺。叶坚纸质至薄革质， 幼时常带红色，干后呈红褐色，卵状椭圆形，卵圆形或圆形，长2 5 1 0 c m ，宽1 5 - - 8 5 c m ，先端突然收狭或短尖，干后常对褶，基部圆形或宽的钝楔形状，上面绿色， 下面淡绿色，无毛；叶柄长卜1 5 咖，1 2 2 3 具叶鞘，所有叶柄具卷须，脱落点位 于叶鞘上端。单性花，雌雄异株，伞形花序从当年长出的幼枝叶腋发出，具数朵或更 多；花序托在果期稍膨大，有时略伸长，具果期常宿存的三角形小苞片；花淡绿至黄 绿色。雄花：外轮花被片矩圆状椭圆形至卵状椭圆形，长4 5 2 m m ，宽1 5 _ 2 姗，内 轮花被片卵状披针形，长4 _ - 4 8 m m ，宽o 卜1 2 舢；雄蕊短于花被片，花药椭圆状， 长约l m m ，花期常反曲，花丝长2 - 3 姗；雌花：外轮花被片椭圆形，长2 5 咖，宽1 2 咖，内轮花被片椭圆形，长2 4 姗，宽1 一1 4 咖；退化雄蕊3 6 枚。浆果球状， 直径6 一1 5 姗，成熟时深红色至朱红色，被粉霜。花期3 5 月；果实1 卜1 2 月乜1 。 分布于我国华东、中南、及西南各省，大别山区非常多见。在日本、朝鲜、缅 甸、越南、泰国、和菲律宾也有分布口1 。 2 1 2 菝葜的开发利用价值 2 1 2 1 园林应用价值 菝葜是多年生攀援灌木，常生于灌丛中、林下、溪旁、山谷或山坡上，目前仍 处在野生状态，有待开发应用于城市绿化中。它是一种少见的单子叶攀援植物，匍 匐性好，耐寒性强，果色红艳，嫩芽鲜红，树形优美，叶形奇特，可用其攀附岩石、 假山，可作地面覆盖物，也可用于路边、林缘，增加自然野趣，观赏价值高，是值 得开发的园林立体绿化好材料。攀援植物因其独特的生长习性，目前在城市立体绿 化中的应用越来越广泛h t 5 6 1 。 2 1 2 2 化学成分及药用价值 菝葜又名金刚藤，传统医学认为其根茎具有药用价值，有抗锥虫口1 、利尿解毒、 祛风利湿、解毒散瘀陋9 1 0 1 的功效。经现代药理学的初步研究，证明其有一定能力的抗 炎镇痛及抗肿瘤作用1 2 1 。菝葜属植物是重要的中药来源，其天然药用成分，近年来 也倍受关注。菝葜属( s m i l a xl ) 植物很多，包括菝葜( s m i l a xc h i n al ) 、光叶菝葜 ( 土茯苓) ( s m i l a xg l a b r ar o x b ) 、黑果菝葜( s m i l a xg l a u c o c h i n aw a r b ) 、粗糙菝 2 葜( s m i a xl e b r u n i il e v i ) 、鞘柄菝葜( s m i l a x s t a n s ) 等，其化学成分n 3 h j 5 1 6 1 均有报道， 因多种皂甙的发现被受国外学者的关注。日本学者n 刀发现金刚藤内含菝葜皂甙a 、b 、 c ，其中菝葜皂甙b 水解生成薯蓣皂甙及糖，薯蓣皂甙水解得到薯蓣皂甙元及糖；k l r n s u n gw h 砌n 硝从中提取得到薯蓣皂甙元的五种糖；巢琪等n 鲫从金刚藤的丙酮提取物中 得到一种新的c 6 一c 3 一c 6 型化合物，命名为菝葜素，并对其合成作了初步尝试。y u t a k a s a s h i d a l 位等人从金刚藤中分离出四种皂甙；6 种从菝葜属植物中分离提取的甾体皂甙 化合物经m t t 法，选三种不同癌细胞，以长春新碱作为阳性对照研究其抑瘤活性，其 中皂甙的抑瘤活性最强，并且强于已知抗癌药长春新碱瞳。 菝葜的根茎是入药的主要部位，内主要含有薯蓣皂甙元构成的皂甙、黄酮、生 物碱、氨基酸、多元酚类、有机酸及含量丰富的糖类( 主要是淀粉) 等多类成分口2 朋1 。 可治疗癌肿：适用于胃癌、食道癌、直肠癌、乳腺癌、宫颈癌、鼻咽癌，其中以胃 癌和食道癌效果较好。具有增进食欲、减少呕吐、疏通狭窄食管以及利尿消肿、增 强体力、提高红细胞及血红蛋白和一定的止痛安眠作用 2 4 o 由菝葜提取物制备的系 列产品金刚藤糖浆、金刚藤颗粒和胶囊等是临床上常用的中成药品乜5 1 。 2 1 2 3 食用价值 菝葜可以作为食物食用，因为它是一种有营养价值野菜。菝葜属野菜资源很丰 富，包括：菝葜( s m i l a xc h i n al ) 、土茯苓( s m i l a xg l a b r ar o x b ) 、马甲菝葜( s m i l a x l a n c e i f o l i ar o x b ) 、圆锥菝葜( s m i l a xb r a c s t e a t ap r e s l ) 、牛尾菜( s m l i a xr i p a r i a ) 嘲等。菝葜的果还可提取红色素，故菝葜红色素作为食用天然色素具有良好的开发 前景咖。 2 1 2 4 其他方面的利用价值 、 菝葜的种子还可以榨油，根茎富含有鞣质和淀粉，可以酿酒或做工业原料使用 【船 2 1 3 菝葜的常规繁殖 刘世旺3 等2 0 0 2 年研究发现，菝葜既可用分株、扦插、压条等方法无性繁殖，也 可用种子进行有性繁殖。无性繁殖时，应特别注意季节和繁殖部位的正确选择。如： 分株植栽时应待地下茎长出分蘖条后，截取部分块茎及其所生的分蘖条进行栽植；扦 插时最好选择地下茎切块做插条，并于春或秋季置埋土中；压条时则应选择在雨季进 3 行，可弧形压条或水平压条等等。但有研究啪一h3 2 3 1 发现，百合科植物的种子不易发 芽，种子比较坚硬且休眠期长。目前对该植物繁殖方法的系统研究很少。菝葜人工栽 培技术的提高将为进一步综合开发利用该植物创造条件。 2 2 植物组织培养研究进展 2 2 1 植物组织培养的起源及发展 植物组织培养技术是在2 0 世纪初，以植物生理学为理论基础发展起来的一项 生物技术，它是指在无菌条件下，主要以植物器官嘲、胚汹1 、组织蚓、细胞口7 矧以 及原生质体“阳，培养在人工配制的培养基上，给予适当的条件，使其长成完整植 株。 植物组织培养的历史可以追溯到2 0 世纪初，当时德国著名植物学家h a b e r l a n d t 根 据细胞学理论提出“植物细胞具有全能性 ，并首次用叶肉细胞和髓细胞进行离体细 胞培养的实验，但所选材料是已高度分化了的细胞，且培养基过于简单，特别是尚未 发现诱导成熟细胞分裂所必需的生长激素，他的离体培养细胞未能分裂。不久之后， h a n n i n g 成功地在含有无机盐和高浓度糖的溶液中培育出能正常发育的萝卜( r a p h o n u ss a t & u sl ) 和辣根菜( c o c h l e a r i ao f f i c i n a l i sl ) 的胚，开创植物组织培养的先河。 到了2 0 世纪3 0 年代，植物组织培养取得了长足的进展。我国植物生理学创始人之一李 继侗和罗宗洛、罗士伟相继发现银杏( g i n k g ob i l o b al ) 胚乳和幼嫩桑叶( m o r u sa l b al ) 提取液能分别促进离体银杏胚和玉米( z e am a y sl ) 根的生长，为把维生素和其他有 机物作为培养基中不可缺少的成分提供了重要依据h 。1 9 3 4 年美国人w h i t e 以番茄 ( c y p h o m a n d r ab e t a c e a ) 根为材料，建立了第一个能无限生长的植物组织，又称“克隆 ( c l o n e ) ，至此有关离体根的培养试验才获得真正成功。由于w h i t e ( 1 9 3 7 ) 发现b 族维 生素对培养离体根的生长具有重要意义，以及i a a 在控制植物生长中的作用的不断认 识，使g a u t h e r e t ( 1 9 3 7 ，1 9 3 8 ) 在他所用的培养基中加入这些生长因子，结果使培养 的柳树形成层的生长大为增加，但总的看来仍很有限。与此同时，n o b o c o u r t ( 1 9 3 7 ， 1 9 3 8 ) 培养了胡萝卜根的外植体并使细胞增殖获得了某些成功h 别。至此，植物组织培 养的基本营养成分体系也基本建立，主要包括无机盐、碳水化合物、维生素、植物生 长激素、有机氮化合物和有机酸等。19 5 7 年m i l l e r “3 3 等发现了激动素( k i n e t i n ) ，并指 4 出激动素能强有力地诱导组织培养中愈伤组织分化出幼芽，这是植物组织培养中的一 项重要进展。激动素被发现两年后，s t e w a r d h 2 1 和r e o n e r t n 铂几乎同时在胡萝卜根组织 单细胞悬浮培养( s i n g l ec e l ls u s p e n s i o nc u l t u r e ) 中发现某些体细胞在形态上转变为 与合子胚( z y g o t i ce m b r y o ) 相似的结构，其发育过程也与合子胚类似，但由于它是从 体细胞分化而来，因而称之为体细胞胚( s o m a t i ce m b r y o ) 或胚状体( e m b r y o i d ) ，并由 此形成了再生植株，直到开花结果。这一重大突破进一步证实了植物细胞的全能性， 为细胞离体培养中研究形态发生机制开拓了一个新的领域。c u h a 等1 9 6 4 年利用曼陀罗 ( d a t u r am e t e ll ) 花药培养首次获得了单倍体植株，由此证明性细胞也具有全能性， 之后人们先后在烟草( n t a b a c u ml ) 、水稻( o r y z as a t i v al ) 、小麦( t r i t i c u ma e s t i v u m l ) 等重要作物上取得成功，组织培养为作物的改良开辟了广阔的前景h 射。 2 2 2 植物组织培养的应用 近几十年来，利用不同离体培养方式离体再生的植物种类已有1 3 0 个科、1 5 0 0 种 以上“叼。据不完全统计，其中得到完整植株的木本植物( 包括果树在内) 就有4 0 0 多种 h 钉。由于植物组织培养技术的不断突破，植物组织培养得到了广泛的应用，主要有以 下几个方面。 、 2 2 2 1 苗木的快速繁殖与脱毒培育 目前用于快速繁殖的植物有上千种，并且还不断有新的报道。据不完全统计，仅 观赏花卉而言，一般认为重要的就包括6 0 余科，近1 0 0 0 种，月季h 8 1 ( r o s ac h i n e n s i s ) 、 菊花5 1 1 ( d e n d r a n t h e m am o r i f o 疗“聊) 、牡丹哑1 ( p a e o n i as 矿u t i c o s a ) 、花叶芋( c a l a d i u m b i c o l o r ) ，龟背竹跏( m o n s t e r sd e l i c i o s a ) 、各类兰花眠嘲( c y m b i d i u ms p p ) 等。其 它植物如柑桔属( c i t r u s ) ，桉树( e u c a l y p t u sr o b u s t a ) 、和珍贵的针叶树佑力等也都应用组 织培养快速繁殖。长期无性繁殖的植物在繁殖过程中病毒可通过营养体进行传递，逐 代累积，使病毒的危害更为严重。2 0 世纪8 0 年代人们就广泛采用了茎尖组培脱毒的方 法。茎尖生长点通常没有或只有很少病毒，以茎尖为材料或加以适当的热处理，在无 菌条件下培养即可获得脱毒植株。脱毒后的植株生长势强，品质升高，产量增加，且 能够保持品种的优良特性。 2 2 2 2 新品种培育 通过组织培养产生的体细胞无性系变异，为植物的品种改良和新品种的选育提供 5 了新的途径。8 0 年代以来，我国在作物无性系变异育种方面取得了令人鼓舞的进展， 已培育出了一大批优良新品种呻1 。利用胚培养技术是育种研究中克服胚败育或发育不 良，提高萌发率以及提早萌发的有效手段，女l l r a n u n i n g 呻1 等1 9 9 0 年提出把葡萄( 所出 v i n i f e r a ) 种子播在培养基上，置于1 下冷藏4 5 d ，比切割胚更能促进发芽；李世诚删 提出了从未熟胚诱导产生胚状体的葡萄胚培养新途径。多倍体育种方面，如王锦秀1 1 研究证明：利用愈伤组织进行枸杞( l y c i u mc h i n e n s i s ) 同源四倍体的诱导方法简便可 靠、诱变频率高、效果好，是创造枸杞新种质、培育枸杞( l y c i u mc h i n e n s em i l l ) 新品 种的有效途径。曹孜义魄1 等1 9 9 3 年将葡萄二倍体欧亚种c r e n a c h 的花药接种在b 5 附加激素的培养基上，通过提高糖浓度和加倍盐浓度，首次从葡萄组培中获得三倍体 葡萄。原生质体培养在体细胞遗传研究及育种上的应用都十分有意义的，如连勇嘲 等( 2 0 0 3 ) 应用原生质体融合技术获得了茄子( s o l a n u mm e l o n g e n al ) 种间体细胞杂种 脑 岢o 2 2 2 3 种质资源保存 传统的种子保存，随着时间的推移，生活力下降，常常受到病虫害的侵染；实地 保存不但成本高，且受到天灾毁灭的危险。植物组织培养可以将少量的芽、胚或茎尖 保存在试管中，很小的空间就能安全地保存大量的物种基因，可大量繁殖；由于不带 病毒和病原菌，可以将其在国际间进行交换，达到资源共享。如陈维伦旧3 等1 9 9 8 年研 究了猴桃属( a c t i n i d i a ) 植物通过茎尖离体培养方法保存1 0 多个种，4 0 多个猕猴桃品种 的离体种质资源；刘翠云胡等1 9 8 8 年用山梨醇( 5 - 3 0 m g l ) ，甘露醉( 5 - 3 0 m g l ) 和矮壮 素( 0 0 1 - 0 1 m g l ) 3 种生长延缓剂加入到1 2 8 5 + i a a o 2 m g l 培养基中，进行葡萄种质 离体保存，一年继代2 - 3 次即可。马锋旺将杏( p r u n u sa r m e n i a c a ) 的茎段在附 j n l 0 m g l 2 ，4 - d 和0 1 m g l b a 的改良m s 培养基中诱导出愈伤组织，放入1 0 d m s 0 + 0 5 m o l l 山梨醇或葡萄糖的冰冻保护剂中，以1 0 * c m i n 的降温速度降- 4 0 0 。c ，停留2 h 后可以长 期地保存在- 1 8 6 o 的液态氮中。现在国内外正在研究冷冻贮藏植物细胞、组织、器官 在堂 号宇o 2 2 2 4 次生代谢物的生产 高等植物中含有的药物、调味品及香料等天然成分，一直是人类生活不可缺少的， 但很多无法人工合成。随着生活水平的提高和疾病的复杂化，人们对这一类生物产品 的需求越来越多。由于野生资源的减少，环境的恶化，来自于高等植物的一些药物越 来越不能满足需求，而组织培养的过程中可产生这些有用的次生物。利用这一特点， 6 就可以利用组织培养，用工厂化生产的方式，不受季节和地区限制进行生产。如银杏 是原产我国的重要药用植物，主要含黄酮类和银杏内酯类等药用成分。由叶片提取药 用成分受到含量低、提取工艺复杂、成本高等问题的限制，通过离体培养生产黄酮和 银杏内酯近年取得了一定进展旧翩1 。刺果番荔枝( a n n o n am u r i c a t a ) 中含有抗肿瘤活性 的番荔素，赵沛基删等进行了刺果番荔枝的组织培养，为解决其快速繁殖及次生代谢 产物生物合成的研究提供了基础性资料。丹参m 1 ( s a l v i am i l t i o r r h i z a ) 、天山雪莲订订 ( s a u s s u r ei n b o l u c r a t ak a r e tk i t ) 等及其它植物的次生代谢物的研究工作也正在开展。 2 3 百合科植物组织培养研究进展 百合科是单子叶植物的一个大科，它拥有众多的观赏植物，我国有6 0 属，约3 0 0 多种，分布在全国各地。百合科植物中有许多是重要的蔬菜，如大蒜( a l l i u ms a t i v u m l ) 、石刁柏( a s p a r a g u so f j i c i n a l i s ) 等，观赏花卉如百合( l i l i u ms p p ) 、郁金香( t u l i p a g e s n e r i a n a ) 等和药材如贝母( f r i t i l l a r i at h n b e r g i ) 。从六十年代起人们就应用组织培 养方法进行百合科植物的快速繁殖和品种改良。大多数百合科植物利用鳞茎、球茎或 鳞片进行无性繁殖。在无性繁殖过程中，由于植物病毒也可通过营养体进行传递，在 母株内逐代积累，危害日趋严重。所以，这类植物的脱毒已成为近年研究的焦点。其 次，百合科还有很多野生植物资源口2 3 1 可开发利用作为室内、室外的观赏植物，但许 多未被人们了解，还处于资源调查阶段。常年来很多野生资源遭到严重的破坏，这就 为科研工作者在百合科野生资源的保存和繁殖方面提出了严峻挑战。 2 3 1 菝葜属植物组织培养研究进展 目前，对于菝葜属植物组培快繁技术的系统研究很少。刘提明口们2 0 0 6 年对菝葜属 的托柄菝葜( s m i l a xd i s c o t i sw a r d ) 以带芽茎段为外植体得到再生植株；邵美妮n 目 等2 0 0 6 年成功对菝葜属的牛尾菜( s m i l a xr i p a r i aa d c ) 进行了组织培养。除此以外， 关于菝葜属其他植物的组织培养尚未见报道，本文是首次对菝葜属的菝葜进行组织培 养及植株再生的研究。因此大力开展菝葜属植物离体培养的研究工作，有利于其价值 的进一步开发利用。 7 2 3 2 百合科其他植物组织培养研究进展 当前，人们对百合科植物的组织培养研究得最多的是百合属( l i l i u m ) 的植物，百 合( l i l i u ms p p ) 以其花朵大型、色彩丰富、气味芳香而为世界各国人民所青睐，成为 国际花卉市场的主流产品。生产上百合常采用鳞茎繁殖，但是繁殖系数低、速度慢且 百合容易感染病毒，病虫害日益严重。用组织培养的方法进行规模化繁殖，可在短时 间内获得大量的优质神苗。杨薇红2 0 0 7 年口们对亚洲百合( l i l i u ma s i a t i ch y b r i d s ) 一个 新品种西农一号的花器官进行了组培快繁研究，比较了花器官不同组织作为外植 体时诱导分化不定芽的能力，其顺序为花托 花柱 花瓣。常立口7 1 2 0 0 4 年以岷江百合 ( l i l i u mr e g a l ew i l s o n ) 鳞片和花丝为外植体成功地诱导出了不定芽。周艳萍m 1 2 0 0 7 年 以大百合( c a r d i o c r i n u mg i g a n t e u m ( w a l l ) m a k i n o ) 的鳞茎内层鳞片及包裹的心叶叶柄 为外植体均成功诱导出芽并增殖，得到再生植株。薛寒青m 1 2 0 0 7 年研究了p 氏。在百合 组织培养中的作用，发现p p 。能促进鳞片的分化和增殖，抑制试管苗的生长，促进组 培苗根系发达等。赵强脚1 等对自身繁殖力弱的青岛百合( l i l i u mt s i n g t a u e n s eg i l f l i l i a - c e a e ) 进行了组织培养技术研究，成功建立了青岛百合的植株再生体系。薛晓娜妇等 以秦岭野生的宜昌百合( l l e u c a n t h u m ( b a k e r ) b a k e r ) 为材料，研究了鳞片和叶片不 同部位以及不同激素配比对不定芽诱导、增殖及生根的影响，为有效果地保存、扩繁 秦岭野生宜昌百合资源奠定工作经验。方华舟眦1 对百合组培苗、扦插苗、种子苗的生 产性状进行了比较研究，结果发现百合组培苗生长健壮、抗病能力强、产量高，具有 较强的生产优势。 除百合属外，人们还研究了其它属的植物的离体培养。曾宋君1 1 9 9 9 年对芦荟 属( a l o el ) 木立芦荟( a l o e ar b o r e s c e n s ) 进行了离体培养，结果表明：茎尖、腋芽、 叶片、吸芽在合适的培养基上均能产生愈伤组织与丛生芽。组织培养方法筛选高抗性 植物是现代生物技术之一，大花萱草是较耐盐的百合科植物，为了满足盐碱地区绿化 的需要，王汉海钔等2 0 0 3 年利用萱草属( h e m e r o c a l l i s ) 大花萱草( h m i d d e n d o r j i i ) 无性系，在不同盐浓度梯度下进行了筛选试验，获得了较满意的抗性植株并初步确定 了其适宜的耐盐浓度。路光m 础2 0 0 6 年对大花萱草一金娃( s t e l l a d a o r o ) 组培苗继代增 殖的因素作了研究，成功的建立了金娃娃的植株再生体系。史清云嘲1 2 0 0 7 年对沿阶草 属( o p h i o p o g o n ) 日本矮生沿阶草( o p h i o p o g o n j a p o n i c u s n a n u s ) 进行了组织培养， 以新抽叶片为外植体，成功地建立的植株再生体系，为日本矮生沿阶草的工厂化育苗 8 奠定了基础。刘辉田1 2 0 0 7 年对天门冬属( a s p a r a g u s ) 的石刁柏全雄株( 系) 组培快 繁技术的研究，以刚发出的幼笋顶端为试材通过离体培养获得再生植株，选用生产性 状好、产量高、无病虫害全雄株，用组织培养的方法将它进行高倍率的快速繁殖，在 短时间内迅速获得数量极大( 一年内可获得1 0 6 1 0 8 倍) 、性状高度一致、优质的全雄株 ( 系) i 生产上应用价值极高。康玉庆1 9 9 2 年对百合科植物组织培养中的体细胞胚发 生进行了研究，探索了百合科植物体细胞胚发生的特点，方式及影响因素，为其深入 研究奠定了一定基础。 3 目的与意义 攀援植物多是野生，适应环境的能力强，人们可以将其引入城市栽培种植，丰 富城市的绿化种类，是值得开发的一类植物。菝葜除了有很好的药用价值外，还有 很强的观赏性，花黄绿色，嫩枝深红色，果小鲜红，冬季耐寒性强，可以开发其作 为立体绿化的材料。但是该植物多为野生，生长周期长，花小且为单性，雌雄异株， 难以采收到种子；分株繁殖系数低，一年仅有1 3 个分蘖；分枝少，取材比较困 难，且扦插成活率低。加之长期以来人们大量挖掘，该植物资源得不到保护，面临 枯竭。 本研究以野生菝葜的带芽茎段、茎段和叶片为试材，探索该种植物离体培养激 素体系及主要培养环节的方法与技术参数，为菝葜的快速繁殖、资源拓展提供理论 与技术参考。 9 4 试验材料与方法 4 1 试验材料 试验材料为菝葜( s m i l a xc h i n al ) ，从雅安周边山上采回定植于四川农业大学 林木育种实验苗圃。选取健壮的植株进行组培试验。 4 2 技术路线 厂 i 健壮l i 植株l i 一j 圈 困一回一圉一困一回 4 3 试验方法 4 3 1 初代培养 4 3 1 1 取材季节的试验 由于在不同生长季节，植株的生理特性有所不同。在植株抽枝条的4 月初，7 e 初， 1 1 月初进行取材，以带芽茎段、茎段和叶片为外植体，将其接种到m s 培养基上进行试 验。每个处理2 0 个外植体，重复3 次。通过试验结果确定最佳取材时间。 4 3 1 2 外植体表面灭菌方式的试验 植株各部分的表面都携带着各种污染微生物，为了消灭这种污染源，在把植物 l o 曰 曰 一 组织接种到培养基前必须进行彻底表面消毒。 在4 月初进行灭菌方案的筛选。以当年生幼嫩的带芽茎段、茎段和叶片为外植体， 消毒药品0 1 的h g c l 。的使用按照表l 的方法使用，分别接种至i j m s 培养基上，每个处理 2 0 个外植体，重复3 次。培养3 0 天后，分别统计带芽茎段、茎段和叶片的污染率、成 活率，筛选出外植体消毒的最佳方案。( 见表1 ) 表l 菝葜外植体的消毒方案 t a b l e1 e x p e r i m e n ts c h e m eo f e x p l a n t sd i s i n f e ! c t i o no f s m i l a xc h i n al 试验号 c o d e 处理方法 d i s i n f e c t i o nm e t h o d s 1 7 0 7 , 醇处理1 5 s + 无菌水冲洗5 次+ o 1 h g c l 2 处理3 m i n + 无菌水冲洗5 次 2 7 0 乙醇处理1 5 s + 无菌水冲洗5 次