土壤微生物的分离纯化及理化质的研究.doc

从土壤中分离和纯化细菌、放线菌 (华南师范大学 生命科学学院 10生物技术与工程2班 第3组)摘要: 土壤是微生物生活的大本营，是寻找有重要应用潜力的微生物的主要菌源。通过采用无菌操作技术，先用稀释法制备土壤的菌悬液，然后结合选择培养基用平板划线法分离出纯菌株，最后用斜面接种的方法对菌株进行保存。通过观察和描述培养特征对菌株所属类群进行初步鉴定，对放线菌进行镜检，对细菌进行革兰氏染色方法观察，以及进行细菌最适合pH生长的初步研究。观察到放线菌的孢子结构；得知该细菌为革兰氏阴性菌，且研究得知该细菌最适合生长的pH是7.48。关键词：土壤；分离；纯化；放线菌；细菌；pHSeparate and purify the bacteria and actinomycetes from the soilLiu GuoXing，Lin Qiongfen, Mo Dan(Biological technology and engineering， College of Biological Science , South China Normal University )Abstract: The soil is the microorganism life supreme headquarters, and is the main fungus source to seek the important application potential microorganism. Through the aseptic technique, uses the dilution method preparation soil the fungus to hang the fluid first, then the union choice culture medium separates the pure strain with the plate streaking law, finally uses the incline vaccination the method to carry on the preservation to the strain. Through the observation and describe training characteristics on the preliminary appraisal belongs strains groups, actinomyces on anti-bma bacteria to gram stain method observation, and the most suitable for the growth of bacteria pH preliminary study. We have observed the actinomycetes spore structure and known this bacterium is a kind of the Gram-negative bacteria. Besides, through the research we have known that the most suitable pH for the bacterium to grow is 7.48.Key words: soil; separation; purification; actinomycetes; bacteria; pH引言土壤是微生物生活的大本营，不同土壤中各类微生物的数量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次是放线菌和霉菌。其中，大多数细菌的最适宜pH为6.5-7.5，放线菌一般生活在较干燥、偏碱性、有机质丰富的土壤中。要想从土壤中获得某种微生物的纯培养，可以采用平板划线法进行分离纯化，借助沾有菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散成为由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。利用选择培养基抑制其他菌的生长而使某种菌充分生长的特点，结合牛肉膏蛋白胨培养基和高氏1号培养基可分别选择出细菌和放线菌。通过该实验学习从样品中分离不同微生物的方法，掌握梯度稀释法、平板划线法和斜面接种等方面的无菌操作技术，熟悉对微生物观察与研究的方法，如影印法观察放线菌，革兰氏染色法观察细菌，分光光度计计数法研究细菌的理化性质（pH）等。微生物与人类息息相关，它对人类的假定贡献和无法估量的开发潜力。为我们展开了广阔的应用前景，所以研究微生物的生命活动有着重要意义，其中 pH与微生物的生命活动有密切联系1。为了更好地为人类的生活和健康做出更大的贡献，将进一步探究 p H 对微生物的影响。为了更好地为人类的生活和健康做出更大的贡献，将进一步探究pH对微生物的影响。1.材料与方法1.1材料研究材料：土壤（于实验前采集后马上进行稀释，制备菌悬液）1.2方法1.2.1梯度稀释法（稀释）A.称取土样2.00g，在火焰旁加到一个盛有48ml无菌水并装有玻璃珠的100ml锥形瓶中。振荡20-30min，使样品中的菌体、芽孢或孢子均匀分散。静止20-30s，标记为编号1。B.按照一定的梯度进行稀释（该实验采用20倍梯度）取3个各装有9.5ml无菌水的25ml锥形瓶，分别按照顺序标记好2、3、4.在无菌操作台上，用微量移液器从1号锥形瓶中移取0.5ml土壤悬液加到2号锥形瓶中，摇匀后，再用微量移液器从2号锥形瓶中移取0.5ml土壤悬液加到3号锥形瓶中，依此类推，分别将土壤悬液稀释20、400、8000倍然后将4个锥形瓶的悬液分别涂布在已经制备好的牛肉膏蛋白胨平板和高氏1号平板上（分别编号1-4），置于28度培养箱中培养（细菌培养2d，放线菌培养3d）1.2.2 平板划线法（纯化）采用平板划线法的分区划线法。将平板分四个区域，其中第四区是单菌落的主要分布区域。先将接种环沾取少量菌在平板第一区划若干平行线，将接种环上多余菌体烧死。平板转动60-70后，再以第一区划线的菌体为菌源，由第一区向第二区作第二次的平行划线，依次在第三区和第四区划线。1.2.3斜面接种技术（保存）取接种环接种环冷却、取菌接种培养 1.2.4影印法（观察）在最后划线的培养基用小刀小心地铲一个单菌落，翻过压印在载玻片中央，小心地移开菌落，载玻片中央就留下了菌落印痕。在火焰下固定，滴一滴石炭酸复红染色液染1分钟，水洗晾干，至于高倍镜或油镜下观察。1.2.5革兰氏染色法（观察）1.2.5.1制片细菌涂片固定结晶紫初染碘液媒染乙醇脱色番红复染观察1.2.5.2镜检将染色后的载玻片，先用低倍镜找到目的物，在用高倍镜观察，最后滴加一小滴液体石蜡油与涂片处，用油镜进行观察，观察细菌的形状和排列方式，以及记录颜色结果。1.2.6分光光度计计数法，浊度法（测量）不同pH的菌液的培养 在已经培养好的PH为7的锥形瓶中分别吸取0.5ml的菌液于其他各PH梯度的液体培养基（已标记为pH6、pH6.5、pH7、pH7.5、pH8）中，置于37的摇床中培养32h,转速为180r/min。测量光密度值（OD） 先从摇床中取出观察各菌的生长情况，并分别置于比色杯中测定600nm的OD值。分别用各个浓度所对应的试管中的空白培养基做对照记录数据后，以光密度（OD）值为纵坐标，pH值为横坐标，绘制标准曲线。1. 结果与分析 2.1平板划线法纯化结果 2.1.1放线菌平板图1：放线菌第二次划线（正面）图2：放线菌第二次划线（反面）第二次划线后基本可以纯化出较高纯度的放线菌单菌落，从图中可以看出，培养基上的放线菌纯度较高，大小形状也较相近，基本没有杂菌的存在。放线菌的菌落较小，质地不均匀，中间厚边缘薄，表面呈粉末状（覆盖有灰色的孢子），干燥、较厚，不透明，与培养基结合紧密，菌落正反面、中心与边缘颜色不一致，具有泥腥味。镜检时看到的大多为散落的放线菌孢子，较难看到放线菌的细胞结构。2.1.2细菌平板图3：细菌第二次划线（正面）图4：细菌第二次划线（反面）第二次划线后基本可以纯化出较高纯度的细菌单菌落，从图中可以看出，单菌落普遍都较小，表面较光滑、湿润、粘稠，质地均匀，透明，正反面颜色一致，菌落与培养基结合不紧密，具有臭味。2.1.3最终斜面保存图5：分离纯化后最终获得的细菌斜面（左）及放线菌斜面（右） 最后将于培养箱28恒温培养的斜面取出，进行保存。如图细菌无杂色，放线菌培养至孢子成熟。2.2影印法观察放线菌图6:放线菌影印法观察(1040)视野中主要看到的是孢子结构，基本上看不到完整的气生菌丝结构，孢子形状为圆形，成熟的分生孢子呈现黑色。2.3革兰氏染色法观察细菌图7:细菌的革兰氏染色(1040)革兰氏染色后镜检发现该细菌被染成了红色，说明该细菌为革兰氏阴性菌。革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多的脂类物质，而肽聚糖含量较少，交联度又低，故用脱色剂脱色时，溶解了脂类物质，增加了细胞壁的通透性，使初染后的结晶紫和碘的复合物容易渗出，结晶紫细菌细胞被脱色，经复染后，就染上复染液的颜色，呈红色。而革兰氏阳性细菌细胞壁中肽聚糖的含量高且交联度高，脂类含量少，经酒精或丙酮脱色时，肽聚糖层的孔径变小，通透性变低，因此细胞仍保留初染时的紫颜色。2.4分光光度计计数法测量细菌最适宜生长pH2.4.1预实验（波长600nm）：图8：预实验OD值随pH变化折线图从预实验可以推测该细菌的最适生长pH介于7与8之间，因此可在pH7、8之间取几个梯度做进一步的实验，寻找该细菌生长的最适pH。2.4.2实验(波长600nm)：图9：实验OD值随pH变化折线图在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与光吸收值(OD)成正比，菌数越多，OD越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的OD，就可反应出菌液的浓度。菌液浓度越大,说明该菌在这个pH值中生长的越好,则越接近该菌的最适pH值。本实验测定细胞培养物在600nm光吸收，从预实验中得出pH在7.00左右的时候该菌生长得最好。再把pH的梯度范围缩小，同样得到pH值为7.48（接近7.50）时，OD值最高，即在该实验中pH值7.48是细菌的最适pH值，因此可以知道该细菌的最适pH值在7.48左右。 3.讨论 3.1实验的结论 3.1.1土壤是微生物生活的大本营，是寻找有重要应用潜力的微生物的主要菌源，能够分离出细菌，放线菌等常见微生物。 3.1.2分离纯化得到的放线菌具有分生孢子结构。 3.1.3通过革兰氏染色法观察分离得到的细菌，得知该细菌为革兰氏阴性菌，且通过分光光度法研究得知该细菌最适合生长的pH是7.48。 3.2讨论与分析 3.2.1 土壤富含微生物的原因土壤具有绝大多数微生物生活所需的各种条件，是自然界微生物生长繁殖的良好基地。其原因在于土壤含有丰富的动植物和微生物残体，可供微生物作为碳源、氮源和能源。土壤含有大量而全面的矿质元素，供微生物生命活动所需。土壤中的水分都可满足微生物对水分的需求。不论通气条件如何，都可适宜某些微生物类群的生长。通气条件好可为好氧性微生物创造生活条件；通气条件差，处于厌氧状态时又成了厌氧性微生物发育的理想环境。土壤中的通气状况变化时，生活其间的微生物各类群之间的相对数量也起变化。土壤的 pH 值范围在 3.510.0 之 间，多数在 5.58.5 之间。而大多数微生物的适宜生长 pH 也在这一范围。即使在较酸或较碱性的土壤中，也有较耐酸、喜酸或较耐碱、喜碱的微生物发育繁殖，各得其所地生活着。土壤温度变化幅度小而缓慢，这一特性极为有利于微生物的生长。如土壤温度夏季比空气温度低，而冬季又比空气温度高。土壤的温度范围恰是中温性和低温性微生物生长的适宜范围。2因此，土壤是微生物资源的巨大宝库，事实上，许多对人类有重大影响的微生物种大多是从土壤中分离获得的，如大多数产生抗生素的放线菌分离自土壤。 3.2.2 土壤微生物中不同菌种的数量土壤中的微生物不仅种类繁多，而且数量也是惊人的。不同类型的土壤由于其有机质含量酸度水分及土壤母质的不同，其中的微生物种类和数量也相应不同，但每克土壤的微生物含量大体上有一个10 倍系列的递减规律：细菌(108) 放线菌(107) 霉菌(106) 酵母菌(105) 藻类(104) 原生动物(103)。细菌的数量是最多的，据估计每亩耕作层土壤中细菌湿重约有90225kg; 以土壤有机质含量为2计算则所含细菌干重约为土壤有机质的1左右。3正因为此，实验在进行时细菌、放线菌和霉菌才比较容易分离出来，而酵母菌则相对比较难分离出来。 3.2.3 配制培养基的原则通过整个综合实验，结合无菌操作技术以及细菌最适合pH生长的初步研究，我们总结出配制培养基的原则：3.2.3.1选择适宜的营养物质总体而言，所有微生物生长繁殖均需要培养基含有碳源、氮源、无机盐、生长因子、水及能源，但由于微生物营养类型复杂，不同微生物对营养物质的需求是不一样的。因此首先要根据不同微生物的营养需求配制针对性强的培养基。3.2.3.2营养物质浓度及配比合适培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好，营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需，浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用，例如高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，反而起到抑制或杀菌作用。另外，培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和(或)代谢产物的形成和积累，其中碳氮比(C/N)的影响较大。3.2.3.3 控制pH条件培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。各类微生物生长繁殖或产生代谢产物的最适pH条件各不相同。一般来讲,细菌与放线菌适于在pH77.5范围内生长，酵母菌和霉菌通常在pH4.56范围内生长。值得注意的是，在微生物生长繁殖和代谢过程中，由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成与积累，会导致培养基pH发生变化，若不对培养基pH条件进行控制，往往导致微生物生长速度或(和)代谢产物产量降低。3.2.3.4 灭菌处理要获得微生物纯培养，必须避免杂菌污染，因此对所用器材及工作场所进行消毒与灭菌。对培养基而言，更是要进行严格的灭菌。对培养基一般采取高压蒸汽灭菌，一般培养基用 1.05kg/cm2，121.3条件下维持1530min可达到灭菌目的。 3.2.4 微生物的分离和培养的方法和条件样品来源分离对象分离方法培养基名称培养温度/培养时间/d土样细菌稀释分离牛肉膏蛋白胨30-371-2土样放线菌稀释分离高氏合成1号285-7土样霉菌稀释分离马丁28-303-5面肥酵母菌稀释分离豆芽汁葡萄糖28-302-3细菌分离平板细菌单菌落划线分离牛肉膏蛋白胨30-371-2表1：四大类微生物的分离和培养4 3.2.5 选择培养基的选择作用选择培养基是根据某种或某一类群微生物的特殊营养需要，或对某种化合物的敏感性不同而设计出来的一类培养基，其作用原理就是利用营养元素的种类及含量对微生物生长的影响，而将微生物进行分离。常用的细菌培养基有营养肉汤和营养琼脂培养基，如牛肉膏蛋白胨培养基；常用的放线菌培养基为高氏1号培养基。（1）牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用广泛和最普通的细菌基础培养基，又称普通培养基。它含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，可供微生物生长繁殖之用。基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCI。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCI提提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量的琼脂作为凝固剂。由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其PH调至碱性，以利于细菌的生长繁殖。（2）高氏1号培养基高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO43H2O 、MgSO47H2O 作为无机盐，FeSO47H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。 3.2.6 细菌革兰氏染色机理革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，象简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。而且，菌龄、细菌密集程度、媒染时间、酒精脱色程度等会影响革兰氏染色的正确性。因此在进行革兰氏染色实验教学和科研工作中 , 一定要按操作规范，控制好菌龄和脱色时间，这样才能保证染色结果的典型性和准确性。5 3.2.7 pH对细菌生长的影响溶液的酸碱度通常