（生物化学与分子生物学专业论文）膜电位对trkb受体活性的调节.pdf

：海人学硕l ：学位论文 原创性声明 本人声明：所呈交的论文是本人在导师指导下进行的研 究工作。除了文中恃别加以标注和致谢的地方外，论文中不 包含其他人已发表或撰写过的研究成果。参与同一工作的其 他同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示了谢意。 期：加鼍7 子 本论文使用授权说明 本人完全了解上海大学有关保留、使用学位论文的规 定，即：学校有权保留论文及送交论文复印件，允许论文被 查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：滥导师签名：名：煎日期：幽整：2 鼍 f ：海人学硕i j 学位论文 摘要 t r k b ( t y r o s i n er e c e p t o rk i n a s eb ) 受体是脑源性神经营养因子( b r a i n d e r i v e dn e u r o t r o p h i cf a c t o r ，b d n f ) 的主要功能受体，也是一种受体酪氨酸激酶。 b d n f 与细胞表面的t r k b 受体结合激活t r k b 受体胞内段的酪氨酸激酶，并使 t r k b 受体胞内几个特定的酪氨酸残基发生自磷酸化而激活下游信号通路。 b d n f 厂r r k b 参与了活性依赖的突触可塑性调节，即神经元活性影响b d n f 对神 经元的效应。神经元的活性可以增强b d n f 在活化神经元或突触中的合成和分 泌，也可以增强t r k b 受体在活化的神经元或突触中的上膜表达、b d n f 诱导的 内吞、转录、运输和翻译等过程，这些过程依赖于c a 2 + 信号通路。但关于膜电 位对t 曲受体活性的调节及其b d n f 对神经元活性依赖性调节的机制还有很多 未知。本论文就膜电位对t r k b 受体磷酸化水平调节的机制做了详细的研究。 ( 1 ) 免疫印记( w e s t e r nb l o t ) 检测发现大鼠海马脑片中b d n f 依赖的t r k b 受 体磷酸化( p t r k b ) 水平在高 k + 】细胞外液处理时高于正常 k q 细胞外液处理时。 高k + 处理可以增加p t r k b t r k b 的比值。 ( 2 ) 将体外转录的t r k b 受体m r n a 在非洲爪蟾卵母细胞( 没有神经元的电 压门控通道的表达) 中表达。通过w e s t e r nb l o t 检测发现高【k + 】细胞外液处理组 p t r k b t r k b 值是j 下常【k + 】细胞外液处理组的2 5 74 - 5 6 。 ( 3 ) 为了排除胞内c a 2 + 信号对t r k b 受体磷酸化水平的影响，用b a p t a 或 者b a p t a a m 阻断胞内c a 2 + 信号。w e s t e r nb l o t 检测发现高 k + 】依然可以诱导 t r k b 受体磷酸化水平的升高，与没有阻断胞内c a 2 + 信号时一致。 ( 4 ) 这些结果强烈提示高【k + 】诱导的去极化激活t r k b 受体酪氨酸激酶而升 高其磷酸化水平其机制可能是由于t r k b 受体自身可以感受膜电位。为了更加直 接说明膜电位对t r k b 受体活性调节的机制，用c u t o p e n 电压钳技术检测t r k b 受体是餐具有膜电压依赖的门控电流( g a t i n gc u r r e n t ) 。在表达t r k b 受体的爪 蟾卵母细胞中记录到一个微小的电流，此电流是否为g a t i n gc u r r e n t 还需要更深的 研究，这部分工作f 在进行。 关键词：酪氨酸激酶受体b ，活性依赖，爪蟾卵母细胞，c u t o p e n 电压钳，膜电 位，门控电流 l ：海人学硕l ：学位论文 a b s t r a c t t r k br e c e p t o ri st h ep r i m a r yf u n c t i o n a lr e c e p t o ro fb r a i nd e r i v e dn e u r o t r o p h i c f a c t o r ( b d n f ) t h eb i n d i n go fb d n ft ot h et r k br e c e p t o ri nt h ec e l lm e m b r a n e a c t i v a t e st r k br e c e p t o rt y r o s i n ek i n a s e ，a n dc a u s e st h ea u t o p h o s p h o r y l a t i o no fs e v e r a l c o n s e r v e dt y r o s i n e sp r e s e n ti nt h ec y t o p l a s m i cd o m a i n so ft r k br e c e p t o r , w h i c hi n t u r na c t i v a t e sd o w ns t r e a ms i g n a l i n gp a t h w a y s b d n fh a se m e r g e da sak e yr e g u l a t o r o fa c t i v i t y d e p e n d e n ts y n a p t i cp l a s t i c i t y ，n a m e l y ，n e u r o n a la c t i v i t ye n h a n c e sb d n f s i g n a l i n g n e u r o n a la c t i v i t yc a ne n h a n c eb d n fs y n t h e s i sa n d o rs e c r e t i o ni na c t i v e s y n a p s e g r o w i n ge v i d e n c es u g g e s t st h a tn e u r o n a la c t i v i t yf a c i l i t a t e sc e l l - s u r f a c e e x p r e s s i o no ft r k b 、b d n f - i n d u c e dt r k be n d o c y t o s i s 、t r a n s c r i p t i o n 、t r a n s l a t i o na n d t r a n s p o r ta ta c t i v en e u r o n so rs y n a p s e s b u tt h e r ei st o om u c hi g n o r a n c ea b o u tt h e d i r e c tr e g u l a t i o no ft r k ba c t i v a t i o nb ym e m b r a n ep o t e n t i a l ( m p ) a n dt h em e c h a n i s m o fa c t i v i t y d e p e n d e n tr e g u l m i o no fb d n f o u rt h e s i sm a d ead e t a i lr e s e a r c ha b o u tt h e p o t e n t i a lm e c h a n i s mb ye x a m i n i n gt h ee f f e c to fm pc h a n g eo n t r k bp h o s p h o r y l a t i o n ( p t r k b ) ( 1 ) t h ew e s t e r nb l o ti na c u t eh i p p o c a m p a ls l i c er e v e a l e dt h a tt h el e v e lo ft r k b p h o s p h o r y l a t i o nb yb d n fi nh i g h 【k 十】g r o u pw a sm u c hh i g h e r t h a nt h a to fi nn o r m a l 【k + g r o u p r a t i oo fp t r k b t r k bc a nb ei n c r e a s e db yh i g h k + 】 ( 2 ) a f t e re x p r e s s e dt h et r k br e c e p t o ri nt h ex e n o p u so o c y t e s ，w h i c hh a v ef e w e n d o g e n o u si o nc h a n n e l s ，w e s t e r nb l o te x p e r i m e n t sr e v e a l e dt h a tt h ep - t r k b t r k b r a t i ow a si n c r e a s e di nt h ep r e s e n c eo fh i g h 【k + 】e x t r a c e l l u l a rs o l u t i o n ，a b o u t2 5 7 4 - 5 6 o ft h a ti nn o r m a l 【k 十】e x t r a c e l l u l a rs o l u t i o n ( 3 ) i no r d e rt of u r t h e re x c l u d et h ee f f e c tc a 2 + s i g n a lt ot h e l e v e lo ft r k b p h o s p h o r y l a t i o nu s e db a p t a o rb a p t a a mt ob l o c kt h ei n t r a c e l l u l a rc a + s i g n a l w e s t e r nb l o tf o u n dt h a tt h ed e p o l a r i z a t i o ni n d u c e db yt h eh i g h 【k + 】s o l u t i o ns t i l lc a n e n h a n c et h el e v e lo ft r k bp h o s p h o r y l a t i o n t h er e s u l tw a sc o n s t a n tw i t hp r e v i o u s r e s u l t sw i t h o u tb a p t ao rb a p t a a m ( 4 ) t h er e s u l t ss of a ri n d i c a t et h a tt h ei n c r e a s eo ft r k bp h o s p h o r y l a t i o nb yt h e d e p o l a r i z r t i o n i n d u c e db yt h eh i g h 【k + 】s o l u t i o nr e s u l t sf r o mt h em e m b r a n e 一2一 ：海人学硕i ：学位论文 d e p o l a r i z a t i o nb yh i g h 【k + 】s o l u t i o nc a nd i r e c t l ye n h a n c et h ea c t i v i t i e s o ft r k b t y r o s i n ek i n a s e f o rt h em e c h a n i s m ，i ti sl i k e l yt h et r k br e c e p t o ri t s e l fs e n s e st h e m e m b r a n ev o l t a g e t of u r t h e rv a l i d a t et h i sm e c h a n i s m ，u s ec u t - o p e no o c y t ev o l t a g e c l a m pt or e c o r dt h eg a t i n gc u r r e n to ft r k br e c e p t o r as m a l lc u r r e n tw a s r e c o r d e db y t h ec u t o p e no o c y t ev o l t a g ec l a m pi nt r k b - i n j e c t e do o c y t e ，b u tw h e t h e rt h ec u r r e n ti s g a t i n gc u r r e n t ，i tn e e d sf u r * h e rr e s e a r c h w ea r ed o i n gt h i sp a r to f w o r k k e y w o r d s ：t y r o s i n ek i n a s er e c e p t o rb ，a c t i v i t y - d e p e n d e n t ，x e n o p u so o c y t e ， c u t o p e no o c y t ev o l t a g ec l a m p ，m e m b r a n ep o t e n t i a l ，g a t i n gc u r r e n t 3 海人学硕l ：学位论文 一绪论 1 b d n f t r l 信号通路及其在神经系统中的作用 1 9 8 7 年，l i c h t m a n 提出了神经营养因子的概念。认为在神经细胞发育过程中， 细胞的生存、生长、迁移以及与其他细胞建立功能性联系或在神经再生过程中轴 突的再生长等，均可受一类可溶性化学物质即神经营养因子( n e u r o t r o p h i cf a c t o r s ， n t f s ) 的诱导、调节和控制。神经营养因子是一类对中枢和外周神经系统均有营 养作用的活性蛋白，这些小分子蛋白质具有5 5 一6 5 相同的氨基酸顺序，统称为 神经生长因子家族，包括神经生长因( n g f ) 、脑源性神经营养因子( b d n f ) 、神 经营养因子3 ( n t 3 ) 、神经营养因子4 5 ( n t 4 5 ) 、神经营养因子6 ( n t 6 ) 和神经 营养因子7 ( n t 7 ) 。神经营养因子通过与细胞膜表面的受体结合发挥其生理功 能。n t f s 受体有两种不同的家族，一种受体是低亲和力的神经生长因子受体 ( p 7 5 ) ，另一种受体是高亲和力酪氨酸激酶家族( t r k s ) 受体t r k a 、t r k b 、t r k c ， 其中t r k b 受体是b d n f 的主要功能受体( m o u s e 矿c h a oe t a 1 ，2 0 0 3 ) 。在啮齿类 动物中，t r k b 受体基因能产生若干不同的转录物，其中有两种m r n a 编码“全长 或催化形式的t r k b 受体，分子量为1 4 0k d 左右，是介导b d n f s 三要生物学活性的 受体。其他的转录物至少可产生t r k b 的两个同形物，它们缺失胞内结构域的大 部分，不显示蛋白酪氨酸激酶活性，是“截短的 t r k b 受体，是一类分子量为 7 5 k d 的糖蛋白( d e c h a n tge t a 1 ，1 9 9 4 ) 。全长t r k b 受体的结构复杂，有一跨膜 区、结合n t 的胞外部分及具有蛋白酪氨酸激酶活性的胞内部分。胞外区包括富 含亮氨酸的结构域，其侧翼有两个富含胱氨酸簇，后接两个免疫球蛋白样结构域， 其中一个是结合n t 所必需的。通过原位杂交显示，长片段t r k b 受体在中枢及周 围神经系统大多数神经九中表达，而不在非神经元中表达( j o h n s o nde t a 1 ，1 9 8 6 ； 艨丽毕e t a 1 ，j 9 鲴) 。b d n f 通过与效应神经元细胞表面的t r k b 受体结合而起作 用。b d n f 与特异的t r k b 受体结合后，发生受体的二聚或寡聚化，导致t r k b 受体 内在的酪氨酸激酶活性激活，t r k b 受体胞内几个保守位点的酪氨酸残基被磷酸 化而激活下游信号通路。t r k b 酪氨酸磷酸化激活是b d n f 信号传导的第一关键事 件。t r k b 酪氨酸磷酸化具有两种功能。首先，t r k b 酪氨酸激酶活性结构域中的3 个高度保守的酪氨酸磷酸化位点为其它位置发生酪氦酸磷酸化所必需。t r k b 酪 氨酸磷酸化的另一个功能是为细胞内信号传递蛋白提供识别或相接位点，可以和 ：海人学硕l ：学位论义 一些信号传递蛋白的s h 2 ( s r ch o m o l o g y 2 ) 等结构域结合( e r i c h u a n ge t a 1 ， 2 d ) 。s h 2 是一种大约为1 0 0 个氨基酸残基的序列，因其与s r c 癌基因编码的蛋 白具有较高的同源性及结构相似性而得名，许多信号传递蛋白都存在s h 2 结构 域。与t r k b 信号传递密切相关的胞内信号传递有磷脂酶c 吖( p l c - 1 , ) 、接头蛋白 s h c 、p 1 3 激酶，均通过s h 2 结构域与磷酸化的t r k b 受体结合( w o l f r a mae t a 1 ， 1 9 9 9 ) ，而且这种结合是高度特异性的。磷酸化的t 曲受体与胞内蛋白形成的 复合物在信号传递过程中起重要的中介作用，复合物的形成通过多种机制有利于 信号传导。b d n f 通过t r k b 受体信号通路对神经系统具有重要的营养作用。b d n f 与t r k b 受体结合后能促进背根节、三叉神经节、节状节、岩节及三叉神经中脑 核等感觉神经元的存活和突起生长。大鼠视神经切断后，用微泵供应b d n f 可刺 激再生视网膜节细胞的轴突分支生长进入中枢靶位。b d n f 也可促进体外睫状神 经节及培养的视网膜节细胞的存活。b d n f 在维持中脑多巴胺能神经元胚胎细胞 存活并向多巴胺能表型分化，能诱导多巴胺能神经元形态分化、细胞增大、神经 元树突分枝增多等过程中起着重要作用。在体外b d n f 能支持胆碱能细胞的生存 和上调这些细胞胆碱乙酰转移酶的表达。发育及成熟的运动神经元对b d n f 也有 依赖作用，且b d n f 可防上运动神经元的自然死亡( y u a nqe t a l ，2 0 0 0 ) 。此外， b d n f 尚可增加培养胚胎大鼠运动神经元的活性，并对损伤的新生大鼠面神经元 有保护作用。切断新生大鼠坐骨神经后，局部应用b d n f 也可挽救9 2 的脊髓运 动神经元，说明b d n f 影响着发育期的运动神经元存活( e g a nm f e t a 1 ，2 0 0 3 ) 。 b d n f 对神经元损伤修复与再生起重要作用。啮齿动物切断海马伞后，b d n f 对 切断的胆碱能神经元有支持作用。甚至在黑质纹状体多巴胺能系统损伤数天后使 用b d n f 仍对其有修复作用( l i n d s a y r m e t a 1 ，1 9 9 3 ) 。在体内b d n f 对神经突起 生长和突触功能具有与体外培养观察到的相似作用。 b d n f t r k b 除了具有促进和维持神经细胞生长、存活和分化以及修复的作用 外还具有调节突触可塑性和神经递质传递等功能。b d n f 在神经可塑性中起非常 重要的作用，如它是长时程增强( l t p ) 形成和保持所必需( l ube t a 1 ，1 9 9 9 , p a n g p te t a l ，2 0 0 4 ) 。在发育中和成熟的海马，b d n f 的水平对强直毒素介导的l t p 的产生是十分重要( k o r t em e t a l ，2 0 0 0 ) 。剔除b d n f 基因的小鼠，海马神经元 l t p 严重缺陷( k o r t e 脱1 9 9 5 ；p a t t e r s o ns le t a l ，1 9 9 6 ) ，给予外源性b d n f 或转 ：海人学硕l ：学位论文 染b d n f 基因，受损的海马l t p 完全恢复( f i g u r o y ae t a 1 ，1 9 9 6 ) 。b d n f 对晚期 l t p 的维持产生影响。采用电生理方法可直接观测b d n f 对海马晚期l t p 的调控 ( p a n gp t e t a 1 ，2 0 0 4 ) 。在b d n f 基因敲除小鼠，尽管个别动物还存在低幅度早 期l t p ，早期l t p 普遍严重受损；晚期l t p 更从未诱导出，即使在那些早期l t p 尚存的小鼠也没有。在l t p 之后3 0 一7 0m i n 给予b d n f 清除剂，可逆转已形成的早 期l t p ，取消晚期l t p 。b d n f 调控海马l t p ，提示其参与学习和记忆过程 ( m u l l e ，de t a 1 ，2 0 0 0 ) 。进一步观察发现，在大鼠海马齿状回，强直毒素刺激 可促进b d n f 释放，伴有t r k b 的激活，提示l t p 伴随有b d n f 诱导的t r k b 受体激 活( g o e u e ym e t a 1 ，2 0 0 1 ) ；在出生后的海马发育过程中，随着年龄的增长， b d n f 及其受体t r k b 的表达均增加。这些都可以说明t r k b 受体参与了b d n f 的突 触可塑性调节及其l t p 的形成。b d n f 可快速增强海马神经元突触的传递和递质 释放。研究表明，b d n f 优先增强高频突触传递，b d n f 可以以活性依赖方式在 突触局部快速释放，这为b d n f 参与突触可塑性提供了有力的证据( k o j i r mm e t a 1 ，2 0 0 1 ) 。b d n f 及其受体t r k b 均存在于突触后致密带的事实，为其参与突 触可塑性的说法提供了形念学证据( a o mc e t a 1 ，2 0 0 0 ) 。 b d n f 对神经元的调节作用具有活性依赖的特点。也就是说神经元的活性影 响b d n f 的效应实现在神经元可塑性中起作用。例如当突触术端中度被去极化 时，b d n f 诱导的神经肌肉接头突触电位被明显增强( b o u l a n g e rle t a 1 ，1 9 9 9 ) ； 在海马，只有当突触前神经元受到高频刺激时( 5 0 h z ) b d n f 调节突触对相应 刺激做出反应( g o t t s c h a l kwe t a l ，j 9 粥) ；在培养的三联体系统中一个兴奋性 的神经元支配的两个突触后神经元，一个谷氨酸能，一个g a b a 能，b d n f 可以 选择性的增强谷氨酸能神经元，而不是g a b a 能神经元( s c h i n d e ra fe t a 1 ， 2 0 0 0 ) ；在视皮层发育过程中，b d n f 调节的树突突刺的发育需要提高神经元的 活性的提高和n m d a 类谷氨酸受体介导的c a 2 + 内流( m c a l l i s t e ra k e t a 1 ，1 9 9 6 ) 。 与微弱的突触前刺激相比，单独b d n f 在引导l t p 上没有作用。这些实验显示 b d n f 诱导的突触电位具有对活化的突触和神经元的选择性或偏爱性。 ， 有大量证据提示a d 病人海马组织、颞叶皮质及其它可能皮质区域有b d n f m r n a 及其蛋白降低( g a r z o nde l a l ，2 0 0 2 ) 。且b d n f 蛋白的沉积物与老年斑 有关，在a d 退行性疾病时表达b d n f 或t r k b 的神经元被破坏( s o o n t o r u n i y o m k o ：海人学硕l ：学位论文 v e t a 1 ，1 9 9 9 ) ；a d 病人海马组织、大脑皮质和基底前脑有t r k b 的表达( n u m a n se t a 1 ，1 9 9 7 ) 。有研究发现含t r k b 活性的基底前脑神经元在a d 病人中有明显 下降。a d 病人和j 下常人额叶皮质和海马组织均可表达催化型( 全长，具有酪氨 酸激酶活性) 和截断型的t r k b 受体，但a d 病人大脑皮质和海马组织中催化型 t r k b 降低( b o i s i e r efe t a 1 ，1 9 9 7 ) ，在某些情况下截断型t r k b 增加( 无酪氨酸 激酶活性) ，这可能会导致一些依赖于b d n f 的神经元死亡。学习障碍不能完 全归咎于海马或皮质功能的改变。前脑的t r k b 信号对学习是必须的( t a n gy e t a 1 ， 2 d 叩) 。有证据提示在a d 中这些内源性b d n f 的来源和通过t r k b 受体介导的 b d n f 的信号传递被损。动物内源性b d n f 信号的毁损可破坏学习和记l ：l ( m ay l 既a 1 ，1 9 9 8 ) 。应用b d n f 似乎不能转改变与年龄相关的学习记忆障碍。b d n f 在学习上的生理作用可能依赖于在空间和时间上都被精细调节的b d n f 表达和 释放的短暂变化，而这种变化是不能通过增加b d n f 表达或细胞外浓度被模仿。 一些转基因动物研究提示b d n f 的过量表达对学习也是有害的。内源性b d n f 的减少可能通过多种机制介入a d 的病理生理( m i c h a l s k ibe t a l ，2 0 0 3 ) 。b d n f 在功能和形态上调节突触可塑性这一观点已被广泛接受。在a d 病人脑的神经病 理学上重大的发现是海马和大脑皮质突触联系的缺失，最近有人提出a d 的主要 缺陷是神经元可塑性的丧失，将最终导致所有的神经病理和临床上的表现，包括 老年斑的形成、神经纤维缠结、神经元死亡、突触联系雀失等( c l i m e n tee t a 1 ， 2 0 0 0 ) 。对b d n f 的分布和作用的研究在近十年有了很大发展。b d n f 不仅对外 周和中枢神经系统的正常发育有重要作用，而且与成年中枢神经系统有密切关 系，可能涉及一些中枢神经系统疾病的发病和病理生理，特别是a d 和p a r k i n s o n s 病。今后人们更为关注了解内源性b d n f 在a d 和p a r k i n s o n s 病的发病机制 和病理生理过程中所扮演的角色，使患者通过改善b d n f 的表达或通过提高其 受体蛋白的表达得到治疗。 2 膜电位对电压敏感性蛋白功能的直接调节作用 电压门控离子通道是一类存在于兴奋性细胞中并与激发动作电位密切相关 的跨膜蛋白，是生物体电信号产生和传播的主要基础。这一类离子通道的功能受 到了细胞膜电位的影响。膜电位对离子通道功能的调节暗示在细胞膜内部有个 ：海人学顾l ：学位论文 电压感受的机制。某种形式的跨膜电荷运动( 例如膜蛋白内部偶极子或者带电氨 基酸感应电压变化而发生旋转、移动) 是感受膜电压必需的，肯定参与到所有的 电压调节的活性调节中。这些带电粒子旋转、移动就会改变蛋白的结构，因此改 变一个酶活性或者离子孔道的丌放。这样的机制被h o d g k i n 和h u x l e y 用来解释 膜电位对离子通透性的影响( h o d g k i na le t a 1 ，1 9 5 2 ) 。带电粒子的运动，必定 会在蛋白内部形成一个微小的电流即g a t i n gc u r r e n t 。s c h n e i d e r 和c h a n d l e r 在肌 肉细胞中记录到了一个和兴奋性收缩相偶联的微小电流，首次证明了蛋白内部带 电粒子运动的存在( s c h n e i d e rm f “以，1 9 7 3 ) 。后来科学家们先后在多种电压 门控性离子通道中记录到了g a t i n gc u r r e n t ，并且g a t i n gc u r r e n t 的形成和通道的开 放联系( a r m s 护o n gc me t a l ，1 9 7 3 jr a k o w s k ir fe t a 1 ，1 9 9 7 ；l o od d e 1 a 1 ，1 9 9 3 7 c l a y ma r m s r o n ge t a 1 ，1 9 8 1 ) 。 电压门控性离子通道具有非常类似的结构，它们都具有4 个独立的蛋白亚基 或者4 个高度同源的结构域( d 1 d 4 ) 组成，每个亚基或者结构域均含有6 个跨 膜螺旋片段( s 1 s 6 ) 。其中s 4 片段高度保守，富含疏水带电荷氨基酸残基。此特 征在几乎所有电压门控离子通道中都极为保守，s 4 片段被认为是电压门控离子 通道的电压感受器。当s 4 片段带电荷的氨基酸感受膜电位的变化时发生相对的 位移，引起离子通道结构的改变而使通道丌放。电压敏感性蛋白可以通过4 种方 式去感受膜电压的变化。带电荷的氨基酸残基如a s p 、g l u 、a r g 、l y s 、h i s 是可能的候选者。因为他们在电场中可以重新定位，这种电压感受机制在电压门 控离子通道已经被发现。侧链内部偶极子的运动如t y r 在电场中也许可以重新 定位。尽管还没有被证实认为是一个电压感受器，但a 螺旋和他内部的偶极子 运动代表了一个可能电压感受器结构。蛋白内部空间驻留的一些自由离子在膜 电场变化时从蛋白内部移出，移出的结果就是蛋白结构变化，这种机制在n a + k + 泵中被发现( f r a n c i s c ob e z a n i l l a , 2 0 0 8 ) 。膜蛋白通过其内部电荷的运动，位移感 受电场，但是带电荷的基团种类、排布、多少、运动方式都可能不同，然而最终 的结果都是电场的改变导致了蛋白结构和功能的改变( r i c h a r dh o r ne t a 1 ， 2 0 0 5 ) 。最近几年对于g a t i n gc u r r e n t 的研究已不再局限于电压门控的离子通道。 已有一些文献报道非离子通道的膜蛋白也可以通过这种机制直接感受电压的改 变，引起结构变化，最终使得其自身的功能发生变化。 海人学硕i ：学位论文 y a s u s h io k a m u r a 等在对a s c i d i a nc i n t e s t i n a l i s 进行系统性的基因调查中发 现一个和离子通道，磷酸酶具有高度同源性的基因，这个基因编码一个叫c i v s p 的蛋白。类似于电压门控离子通道，这个蛋白包含四个跨膜片段，其中s 4 片段 每间隔两个疏水性氨基酸就有一个带正电荷的氨基酸。胞内具有一个与p t e n 结 构很类似的磷酸酶活性结构域，其具有磷酸酶活性并且磷酸酶的活性具有电压依 赖的特点。s 4 片断可以充当一个电压感受器的作用。当s 4 片断带证电荷的几个 氨基酸突变掉，c i v s p 蛋白的g a t i n gc u r r e n t 消失。s 4 片断带正电荷的几个氨 基酸突变掉以后胞内段磷酸酶活性的电压依赖的特点也消失，这说明c i v s p 通 过s 4 片断中带正电荷的氨基酸在内部相对位移而去直接感受膜电位的变化，影 响c i v s p 的功能( y o s h i m i c h fm u r a t ae t a 1 ，2 0 0 5 ) 。h a n n ap a m a s 等一开始发现 m 2 r 与配体乙酰胆碱的结合具有电压依赖的特点，而且这种依赖性不是由于激 活的细胞内下游信号通路所引起的( y a h b e n c h a i me t a 1 ，2 0 0 3 ) 。通过c u t o p e n o o c t y ev o l t a g ec l a m p 技术记录到了m 2 r 的g a t i n gc u r r e n t ， 并且当把两个j 下电荷 氨基酸突变掉，g a t i n gc u r r e n t 消失的同时配受体结合的电压依赖的特点也消失。 所以m 2 r 这种g 蛋白偶联的受体本身就是一个电压敏感性蛋白，可以直接感受 电压的变化而调节配受体的结合，调节其功能( y a h b e n c h a i me t a 1 ，2 0 0 6 ) 。 3 c u t o p e n 电压钳技术 由于g a t i n gc u r r e n t 是一个微小且时间很短的电流，试验记录时会被离子通道 电流、电容电流掩盖。离子通道电流可以被阻断，为了减去电容电流，需要假设 一个饱和电压，在这个电压下，膜蛋白的结构已经变到最大限度，此时g a t i n g c u r r e n t 已经消失，记录到的就只有电容电流。通过电脑软件设计信息采集的 p r o t o c o l 用记录到的总电流( 包括电容电流和g a t i n gc u r r e n t ) 减去电容电流就可 以检测到g a t i n gc u r r e n t 。g a t i n gc u r r e n t 微小且时间很短，普通的电压钳很难记录， 常采用c u t o p e n 电压钳j 支术记录。c u t o p e n 电压钳制法是9 0 年代初由s t e f a n i 等研究出来的一项实验方法，经过近十年的发展已基本成熟。c u t o p e n 设计原理 是基于将卵母细胞分成三个独立部分( 附录f i g l 所示) 。最下层与细胞内相通， 被钳制到零电位，中间层和最上层则通过各自独立的电路被钳制到相同的电位， 电流通过最上层的记录电极输入到放大器。卵母细胞被特制的细胞固定槽分成三 ：海人学硕i ：学位论文 个独立部分：上槽、中槽和底槽。上槽和中槽底部各有一小圆孔，直径约为7 0 0 i n n ，四周涂以儿士林油脂使每部分之间绝缘。卵母细胞被固定于中问，但各有 一小部分胞膜通过小孔暴露于上槽和底槽。各槽中的液体可通过各自的灌流装置 进行液体灌流。c u t o p e n 的设计考虑到了细胞内及细胞外的灌流，上槽、中槽用 于细胞外灌流，底槽用于细胞内灌流。 c u t o p e n 电压钳制法主要优点有：高频响应及低噪音。可用于分析通道的 激活和失活特性。与膜片钳技术相比，具有相似的时间分辨率，但记录到的通道 电流较膜片钳技术大几十倍，可达2 0 3 0 衅。稳定记录可达数小时。相对而言， 本方法衰减现象不明显。易于控制细胞内液体成分，可用于研究细胞内药物对 通道功能的影响。也可在特殊环境下研究通道的功能( 蒋学缓e t a l ，2 0 0 0 ) 。因 此c u t o p e n 电压钳技术已经被越来越多的实验室所采用。 4 非洲爪蟾卵母细胞表达体系 非洲爪蟾卵母细胞表达体系是一种功能强大、适用范围广的表达体系，同时， 也是应用最早的基因功能表达体系之一。1 9 7 1 年，g u r d o n 等人首次将纯化的 d n a 注射到爪蟾卵母细胞获得了f 确的转录和表达出蛋白质之后( g u r d o nj b e t a 1 ，1 9 7 1 ) ，随着分子生物学的发展，其应用又有进一步的扩展。许多不同种 类、不同功能的蛋白质均可以在其中表达，并进行功能研究。其表达的适用范围 从来源上分为动物蛋白质和植物蛋白质；从功能上分类可用于离子通道、泵、受 体、酶等；从亚细胞定位上分类可用于膜蛋白、胞浆蛋白质、核蛋白质和分泌蛋 白的表达及功能研究。己被广泛应用于心血管学、药理学及神经生物学等领域。 如今，爪蟾卵母细胞表达体系已同益成为膜蛋白功能研究的一种重要手段。它具 有将从细胞或组织中提取的m r n a 、体外转录合成的c r n a 、基因组d n a 和载 有目的基因的质粒翻译成蛋白的功能，并能将蛋白整合到卵母细胞膜上，显示膜 蛋白的原有特性( 附录f i 酡所示) ，是研究膜蛋白的一种工具。爪蟾卵母细胞 具有无季节性、表达周期短、体积比较大、便于操作( 实验用的第五期卵母细胞 直径可达1 2 m m ) 、相对与其他细胞要易于培养等优点。最重要的是非洲爪蟾卵 母细胞天然不表达钠离子通道蛋白，其它一些蛋白表达也很少，其细胞内环境相 对比较简单，这可以排除细胞内一些因素的影响，更好地研究目的蛋白的功能等。 ：海人学顾i ：学位论文 1 材料 1 1 主要试剂： 二材料与方法 ( 1 ) lo x 人工脑脊液( a r t i f i c i a lc e r e b r o s p i n a lf l u i d ，a c s f ) 成分： n a c l ：11 9m m k c l ：2 5m m n a h 2 p 0 4 ：1 0m m c a c l 2 ：2 4m m m g s 0 4 ：1 3m m ( p h7 3 ) n a h c 0 3 ：2 6 2m m g l u c o s e d ：11m m 注意最后两种物质使用时按比例加入。 ( 2 ) 1 0 x 高 k + a - 1 7 脑脊液( a r t i f i c i a lc e r e b r o s p i n a lf l u i d ，a c s f ) ： n a c l ：l1 9m m k c l ：5 0m m n a h 2 p 0 4 ：1 0m m c a c l 2 ：2 4m m m g s 0 4 ：1 3m m ( p h 7 3 ) n a h c 0 3 ：2 6 2m m g l u c o s e d ：l lm m 注意最后两种物质使用时按比例加入。 ( 3 ) p r o t e a s ei n h i b i t o rc o c k t a i l ： 含有六种主要蛋白酶抑制剂、其名称、浓度与对应抑制的蛋白酶如表一 ( c a l b i o c h e m 公司) ： l ：海人学顾l ：学位论文 p r o d u c t c a t n o m 0 1 w t c o n c e n t r a t i o n t a r g e tp r o t e a s e i n t h e v i a i # a e b s fh y d r o c h l o n d e ，0 1 5 0 02 3 9 5 o om m$ e n n ep r o t e a s e s 6 5 0 9 a p r o t m m ，b o w n e ，r e c o m b i n a n t ， 6 1 6 3 7 18 0p m b r o a ds p e c t r u m ：s e n n e n j c o t l a n as p a m m a l - f r e e 6 5 1 5p r o t e a s e s b e s t a t i n2 0 0 4 8 43 0 8 45m m a m i n o p e p t i d a s eb a n d l e u o n ea m t n o p e p b d a s e e 6 4 p r o t e a s ei n h l b t t o r 3 2 4 8 9 03 5 7 41 5 m m c y s t e m ep r o t e a s e s l e u p e p t m 。h e m t s u l f a t e 1 0 8 9 7 54 7 5 62m m c y s t e i n ep r o t e a s e sa n d t r y p s i n l i k ep r o t e a s e s p e p s t a t i na 5 1 6 4 8 26 8 5 9 1m m a s p a r tj cp r o t e a s e s 表一p r o t e a s ei n h i b i t o r c o c k t a i l 中蛋白酶抑制剂名称、浓度与对应抑制的蛋白酶 ( 4 ) l y s i sb u f f e r ： n a c l ：1 0 0m m n a f ：5 0m m n a 3 p 0 4 1 0 h 2 0 ：3 0m m e d t a ：2 5m m e g t a ：2 5m m t r i s h c l ：2 0m m t r i t o n 1 0 0 ：1 o 使用时加入 1 0 s d s( 1 ：1 0 ) p n p p ：( 4 0 m m ) p r o t e a s ei n h i b i t o rc o c k t a i l ( 2 0 0 x ) ( 5 ) 5 xr u n n i n gb u f f e r ： t r i s e - b a s e ：1 5 1 9 甘氨酸：9 4 9 10 s d s ：5 0 m l 加水定容到10 0 0 m l 室温保存 ( 6 ) 10 x t r a n s f e rb u f f e r ： 甘氨酸：2 9 9 t r i s e - b a s e ：5 8 9 10 s d s ：3 7 m l 1 2 一 ：海人学硕i j 学位论文 加水定容到1 0 0 0 m l 室温保存 ( 7 ) 1 0 x t b s ： n a c i ：8 0 9 k c i ：