（微生物学专业论文）抗植物病原真菌海洋黄杆菌及其活性物质研究.pdf

抗植物病原真菌海洋赞杆菌及 e 活性物质研究 摘要 对危害严重并难以控制的农作物病原菌 急需寻找高效新靶标活性物质 在陆 地寻找机率低的情况下 本研究从丰富而新颖的深海微生物资源中筛选出对农作物 病原菌具有稳定拮抗作用的海洋黄杆菌w w p 3 7 m c c c1 a 0 1 3 6 8 对其抗作物病 原菌谱 抗菌物质的分离 纯化及初步鉴定 及其发酵条件进行了研究 结果如下 1 以水稻纹枯病 棉花枯萎病和油菜菌核病三类病原菌为指示菌株 对来自深 海 2 0 0 0 6 0 0 0m 及台湾海峡表面水的1 7 6 株微生物进行了筛选 获得了1 1 株具 有稳定抗茵活性的细菌 其中黄杆菌属w w p 3 7 对1 0 种作物病原真菌抗菌能力最 强 该菌株连续转接1 0 代抗菌活性稳定 2 理化性质的研究表明 抗菌活性物质能抵抗1 0 0 0 c 的高温 且在p h 4 1 0 和 紫外照射等环境中稳定 正丁醇萃取的粗提物 经薄层层析纯化 以抑制尖孢镰刀 菌生长为指示对薄层层析板进行了生物显影 获得了研 o 3 5 尺r o 5 6 两条抑菌带 表明抗菌物质至少有两种活性组分 经d o s k o c h i l o v a 溶剂系统纸层析验证 该物质 与硫藤黄菌素的纸层析图谱极为相近 3 抗菌物质经有机溶剂萃取 凝胶层析 s e p h a d e xl h 2 0 固相萃取 c 1 8s p e 纯化 再经高效液相色谱 h p l c 分离 收集沈脱峰 检测其抑菌活性 证明组 分b f 1 活性较强 l c m s 测得其分子量为6 9 9d a 紫外扫描显示 b f 1 特征峰与 硫藤黄菌素和金丝菌素特征吸收峰基本相同 初步确定b f 1 为金丝菌素类抗生素 但b f 1 只对病原真菌有抑制效果且分子量达到6 9 9d a 却与现有金丝菌素类抗生 素不同 因此 该物质极有可能是一种新抗生素 其结构鉴定正在进行中 4 对菌株w w p 3 7 的发酵j 下交试验证明 产抗菌活性物质的优化发酵培养基配 方为 蔗糖0 6 酵母粉1 2 n a c l1 4 m g s 0 40 8 优化培养条件为 5 0 0 m l 三角瓶装量10 0m l p h8 0 培养温度为2 8 0 c 摇床转速2 0 0r m i n 种子发酵 液菌龄8h 接种量为7 0 培养时间为2 4h 将发酵上清液稀释6 0 倍后的的灌根 处理接种油菜菌核病原菌的4 5 片真叶的油菜幼苗2 1 天后 防治效果可达7 6 7 扫描电镜观察发现 对农作物病原菌 尖孢镰刀菌 的抑制作用表现为菌丝生长减 慢 粗细不均且分支少 壁破裂 原生质泄漏 海洋黄杆菌群未见有产抗农作物病原真菌抗生素的研究 本文做了此方面的报 道 b f 1 初步确定为金丝菌素类抗生素 但其只对病原真菌有抑制效果且分子量达 到6 9 9d a 却与现有金丝菌素类抗生素不同 极有可能是一种新抗生素 到目前为 止 还没有从海洋黄杆菌中筛选到的吡咯环类抗生素功能物质的相关报道 关键词 海洋黄杆菌 金丝菌素 植物病原真菌 结构鉴定 发酵 2 0 0 8 届华中农业人学硕 1 学位论文 a b s t r a c t t oc o n t r o lc r o pp a t h o g e n i cf u n g u s i ti se x i g e n to fs c r e e n i n gn e wn a t u r a la n t i f u n g a l c o m p o u n d s b u ta l o n gw i t hr e s e a r c hu n c e a s i n g l yt h o r o u g h t h ep r o b a b i l i t yo fo b t a i n i n g n e w a n t i f u n g a lc o m p o u n d sf r o mt e r r e s t r i a lm i c r o o r g a n i s mh a sr e d u c e dg r a d u a l l y u n d e r t h i ss i t u a t i o n f o rt h ef i r s tt i m e i nt h i sp a p e r w es t u d i e do nm a r i n ef l a v o b a c t e r i u ms p s t r a i nw w p 3 7a g a i n s t p h y t o p a t h o g e n s a n db r o a d s p e c t r u ma n t i f u n g a la c t i v i t y c o m p o u n d s t h ea n t i f u n g a lc o m p o u n d sw e r ep u r i f i e da n di d e n t i f i e d i t sf e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n sf o rp r o d u c i n gt h ea n t i f u n g a lc o m p o u n d sw e r es t u d i e d s u p p r e s s i o ne f f e c to f s t r a i nw w p 3 7o ns r sw a sa l s od e t e r m i n e d t h er e s u l t sw e r ef o l l o w e da s 1 i n0 1 1 1 s t u d y t h r e ep l a n tp a t h o g e n i cf u s a r i u mo x y s p o r u m b i o t r y t i sc i n e r e aa n d s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u mw e r eu s e da si n d i c a t i n gs t r a i n s a n d17 6m a r i n ei s o l a t e sw e r e u s e dt os c r e e na n t i f u n g a ls u b s t a n c e p r o d u c i n gb a c t e r i a t h er e s u l t ss h o w e d 也a t1 1 m a r i n es t r a i n sw h i c hh a dh i g ha n t i f u n g a le f f e c t i v ew e r ep i c k e du p f i n a l l y s t r a i n w w p 3 7 m c c c 1a 013 6 8 w a sc o n f i r m e do ft h i sa c t i v i t y 2 t h ea c t i v ec o m p o u n d sc o u l dm a i n t a i nm o s ta n t i f u n g a la c t i v i t i e sw h e nh e a t e da t 10 0 0 cf o r2 0m i n o rt r e a t e d i mu vr a d i a t i o nf o r9 0m i n f u r t h e r m o r e a n t i f u n g a l c o m p o u n d sr e m a i n e ds t r o n ga c t i v i t yo v e raw i d ep hr a n g ef r o m4 0t o10 0 t h ea c t i v e c o m p o u n d sc o u l db ee x t r a c t e dw i t hn b u t a n 0 1 t l c b i o a u t o g r a p h yr e s u l t ss h o w e dt h a t t h es t r a i nw w p 37p r o d u c e da tl e a s tt w oa c t i v ec o m p o u n d s c o m p a r e dw i t ht h ep a p e r c h r o m a t o g r a m so fe i g h t s o l v e n ts y s t e m f r o md i f f e r e n ts t a n d a r d s t h e a n t i f u n g a l c o m p o u n dw a ss i m i l a ra sa u r e o t h r i c i na n dt h i o l u t i n 3 c o m p o u n db f 1w a sp u r i f i e db ym e a n so fg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y s o l i d p h a s ee x t r a c t i o na n dh p l c t h e nb f 一1w a sa n a l y s e db yu va b s o r p t i o ns p e c t r u ma n d l c m s t h eu l t r a v i o l e tc h a r a c t e r i s t i ca b s o r p t i o n so fb f 1w e r es i m i l a ra sc h a r a c t e r i s t i c a b s o r p t i o n so fa u r e o t h r i c i n i t sm o l e c u l a rw e i g h tw a s6 9 9d aa r e rs y s t e m a t i ca n a l y s i so f t h ef r a g m e n t a t i o np e a k sa p p e a r i n gi nt h em a s ss p e c t r u m w i t ht h es a m ep a r e n tr i n ga s a u r c o t h r i c i n t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tb f 1w a sam e m b e ro ft h ea u r e o t h r i c i nf a m i l y 4 i tw a sp r o v e dt h r o u g h o r t h o g o n a le x p e r i m e n t st h a tt h eo p t i m u mm e d i u mf o r p r o d u c i n gt h ea n t i f u n g a lc o m p o u n d sw a s0 6 c a n es u g a r 1 2 y e a s te x t r a c tp o w d e r 1 4 n a c la n d0 8 0 m g s 0 4 t h eo p t i m u mc u l t u r i n gc o n d i t i o n sw e r ei n o c u l a t e dw i n l8 h o u r s s e e d a g ea n d7 o o fi n o c u l a a n dc u l t u r e df o r2 4h o u r sa tp h8 0 e f f e c to fc u l t u r e s u p e m a t a n to fs t r a i nw w p 3 7a g a i n s ts r sw a sm e a s u r e di ng r e e n h o u s ea n dt h er e s u l t s h o w e dt h a t7 6 7 o ft h ep l a n t sw e r es t i l l h e a l t h ya f t e r2 1dw i t ht h es t e r i l i z e d s u p e m a t a n tt r e a t m e n t f r o ms c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o g r a p ho fw w p 3 7 a n t i f u n g a le f f e c t s r e v e a l e dt h a tt h ec e l l so ft h eh y p h ao ff u s a r i u mo x y s p o r u mb e g a nt os h o r t e n t h ec e l l i i w a l l sw e r eb r o k e na n dt h ep r o t o p l a s ml e a k e do u ta f t e rt r e a t m e n t w i t hf e r m e n t a t i o no f 哪3 7 p r e l i m i n a r ya n a l y s i s o na n t i b i o t i c p r o p e r t i e s s h o w e db f 1w a san o v e l p y r r o l e a n t i b i o t i ca n dh a das i g n i f i c a n ta n t i f u n g a la c t i v i t yo ns c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m t h i si st h ef i r s tr e p o r to i lt h ea n t i f u n g a la c t i v i t yo fan o v e lp y r r o l e a n t i b i o t i cf r o mm a r i n e f l a v o b a c t e r i u ma n di tm a yb eap r o m i s i n ga g r i c u l t u r a la n t i b i o t i c s k e y w o r d s m a r i n ef l a v o b a c t e r i u m a u r e o t h f i e i n a n t i f u n g a ls u b s t a n c e p h y t o p a t h o g e n s 2 0 0 8 届华中农业人学硕l 学位论文 e i h p l c i s c l c m s l d 5 0 m b m c c c m i c n i c o d p b s r i s p e s r s t l c u v 缩略语 a b b r e v i a t i o n s l i q u i de x t r a c t i o n 萃取相 1 l i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 高效液相色谱 i n f e s t e ds o i l sc o n t r o l感染土样处理 l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y m a s ss p e c t r o m e t r y 液相质谱联用 m e d i a nl e t h a ld o s e半数致死剂量 m a r i n eb a c t e r i a lm e d i u m海洋细菌培养基 m a r i n ec u l t u r ec o l l e c t i o nc e n t e ro fc h i n a中国海洋菌种保臧中心 m i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n最小抑制浓度 n 0 1 1 i n f e s t e ds o i l sc o n t r o l未感染土样处理 a b s o r p t i v ed e n s i t y 吸光度值 p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e 磷酸缓冲液 r a f f i n a t el i q u i de x t r a c t i o n萃余相 s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n固相萃取 s c l e r o t i n i as t e mr o to f r a p e油菜菌核病 t h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y 薄层层析色谱 u l t r a v i o l e t紫外线 i v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 砷如需保密 解密时间年 月 日 是否保密7 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导炳指导下进行的研究工作及取得的研 究成果 尽我所知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果 也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料 指导教师对此进行了审定 与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明 并表示了谢意 研究蚴 乏越 帆洲年多月1 日 学位论文使用授权书 本人完全了解 华中农业大学关于保存 使用学位论文的规定 即学生必 须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本 学校有权保存提交论文的印 刷版和电子版 并提供目录检索和阅览服务 可以采用影印 缩印或扫描等复制 手段保存 汇编学位论文 本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表 传播学位论文的全部或部分内容 注 保密学位论文在解密后适用于本授权书 学雠文储鲐恕醴导师张驭芝 签名日期 d 加昭年钿f 日签名日期 秘年6 月ff 日 注 请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 抗植物病原真菌海洋黄杆菌及 e 活件物质研究 第一章文献综述 1 1 前言 水稻 棉花 油菜等是重要的农作物 在生产中由于受稻瘟病 纹枯病 白叶 枯病 枯萎病和菌核病等的危害 严重影响了农作物的高产稳产 b o l a n da n dh a l l 1 9 9 4 m a k o w s k ie t a l 2 0 0 5 当前 对这些病害的控制多使用化学农药 频繁大 量使用化学农药会破坏生态平衡 化学农药的残毒造成农产品的污染 同时引发病 原菌增强耐药性 令防治效果减弱或难度加大 y a n ge ta 1 2 0 0 7 因而 迫切需 要采用农用抗生素或生物防治方法来逐渐减少对化学农药的使用量 生物防治由于 具有与生态环境保护相融合 与可持续农业一致的优点受到广泛关注 l i u 2 0 0 6 农用抗生素是细菌 真菌和放线菌等微生物在发酵过程中所产生的次生代谢产 物 这些物质在低浓度下能有选择地抑制或影响农作物病原菌 害虫 害螨和杂草 的生长和发育等 如放线酮 灭瘟素 阿维菌素等 农用抗生素的主要来源是土壤 微生物 如井冈霉素 阿维菌素和春雷霉素等的产生菌 周启和王道本 1 9 9 5 我国农用抗生素的研究起步于2 0 世纪5 0 年代 经过几十年的研究 开发了防治 水稻纹枯病的井冈霉素 防治植物白粉病的武夷霉素 防治多种真菌病害的农抗 1 2 0 多抗霉素 防治细菌病害的农霉素 叶枯散 中生霉素 制黄杆菌素 新植 霉素 防治植物病毒病的宁南霉素等1 0 多种产品 朱昌雄和季明东 1 9 9 3 1 2 重要农作物病害生物防治的简况 目前 对于农作物病原菌的生物防治取得了一定进展 但对于某些危害严重又 难以防治的病害如水稻纹枯病 棉花枯萎病和油菜菌核病等的病原尚无有效的生物 防治方法 急需寻找对其有高效防治效果的新微生物资源和新活性物质 j i a n g 2 0 0 0 j i a n ge ta 1 2 0 0 7 经过多年的研究 已经获取了许多具有抗作物病害的微 生物 例如 f a l t i n 等对莴苣和甜菜的立枯丝核菌的生防菌进行了筛选 筛选出的 假单胞菌 p s e u d o m o n a sr e a c t a n s 有较好的防治效果 对于油菜菌核病研究较多的 是拮抗菌盾壳霉 c o n i o t h y r i u mm i n i t a n s 木霉等 j i a n ge ta 1 2 0 0 0 m c q u i l k e ne t a 1 1 9 9 5 s h ie ta 1 2 0 0 4 虽然在陆源性的抗作物病原菌的筛选方面取得了一些进展 但远远满足不了当 前对水稻 棉花 油菜 小麦重要作物病害生物防治的要求 尤其是对水稻三大病 害 棉花枯萎病和油菜菌核病等防治需要 迫切寻求更加有效的生物防治剂 随着 对土壤微生物的逐年深入广泛研究 从土壤中分离出产新抗生素的菌株的几率越来 越低 从陆地上发现对这些病原有抗菌活性的新天然产物也变得更加困难 这就迫 使人们把研究目标转向其它微生物生态系统 因此 人们将注意力转向约占地球资 源8 0 的海洋来寻找和发现新型抗菌生物 尤其是微生物 骆祝华等 2 0 0 5 近 2 0 0 8 屙华中农业人学硕 i 学位论文 年的研究表明 海洋环境独特 其高压 高盐 低营养 低温的特点 被认为是生 命活动的极端环境 这种环境造就了微生物种类及代谢途径特异性 即使是与陆地 相似的属种 由于其特殊的生存环境 也会产生与陆栖微生物不同的新颖生物活性 物质 f f l 黎等 2 0 0 3 从采自近海海洋微生物得到的化合物中新结构物质比例远远高于陆生微生物 研究人员已从海洋细菌 放线菌和真菌中分离出众多的具有新分子结构的抗菌 抗 病毒和抗肿瘤化合物 胡艳红等 2 0 0 4 对深海微生物活性物质的研究显示 深 海微生物将是新活性物质的重要来源 因此从深海微生物中发现抗重要作物病原菌 新活性物质是一种有效途径 对于解决目前困扰我们的几种重要作物病害问题具有 十分重要意义 有关专家预测 海洋微生物将是今后获得新的农用抗生素的重要资 源 1 3 海洋微生物活性物质的研究进展 1 3 1 海洋微生物抗菌活性物质 早在1 8 8 9 年d eg i a x a 就首次报道了海水中存在潜在的抑制炭疽 霍乱病原菌 的微生物 1 9 4 5 年b r o t z 对意大利地中海撒丁岛海岸污水口附近的海洋细菌进行研 究 曾推断海水的杀菌机制可能是由于某些海洋微生物所产生的抗菌物质在起作 用 2 0 世纪5 0 一6 0 年代有关报道逐渐增加 g r e i n 等调查了1 6 6 株从海水分离的放 线菌 其中7 0 株对革兰氏阳性菌和阴性菌有拮抗作用 k r a s i l 报道了全世界各大洋 深度0 3 5 0 0m 的水中分离的3 2 6 种细菌 其中1 2 4 种对金黄葡萄球菌 分支杆菌等 病原细菌有拮抗作用 k r a s i l 1 9 6 2 一株来自加勒比海海域的含溴假单胞菌 p s e u d o m o n a sb r o m o u t i l i s 产生的抗菌物质 经证实此化合物为2 3 4 三溴 5 1 羟一2 4 二溴苯基 吡咯 到了8 0 9 0 年代随着各国对海洋生物资源开发力度的加 强及研究水平的提高 海洋微生物各种活性物质的丌发研究进展迅速 1 9 8 8 1 9 9 2 年就报道了近4 0 0 个新的化合物 胡艳红等 2 0 0 4 m a k t o o b 等证实了海洋真菌 k a l l i c h r o m at e t h y s 产生的抑菌物质对动物病原真菌有很强的抑制作用 海洋真菌木 素色子囊菌l e p t o s p h a e r i ao r a e m a r i s 产生的抗菌物质对多种病原真菌和细菌具有抑 制作用 m a k t o o be ta 1 1 9 9 6 海洋微生物活性物质的研究在2 1 世纪得到迅猛发展 据美国s c r i p p s 研究所的 f e n i c a l 教授报道 于l 9 9 5 1 9 9 9 年间全世界发现的新化合物有2 7 0 多种 而仅 2 0 0 0 2 0 0 1 两年间 所报道的新化合物就已经接近这个数字 郝树站和王素英 2 0 0 5 这些活性物质包括生物碱类 大环内酯类 肽类 萜类 吡喃酮类 醌类 醚类和有机酸类等 而每一类化合物又包含有许多结构相异的化合物 其中很多在 陆地生物中从未发现过 周世水和姚汝华 2 0 0 2 2 抗植物瘸原真菌海洋黄杆菌及j e 活性物质研究 不少海洋微生物都能产生抗菌物质 国内外有关专家利用这一特性 开展了医 用抗生素的研究 并取得了成功 而农用抗生素的筛选国外尚未见有报道 而我国 在这一研究方向上起步较晚 尤其利用海洋微生物代谢产物研制农用抗生素 但国 内已丌始对近海海洋微生物进行了这方面的研究 从东海大陆架 渤海 珠江口等地海水中分离培养 纯化得到3 6 1 株细菌菌株 从中筛选出具有抗菌活性的芽胞杆菌4 株 产生的粗蛋白对病原菌尤其是病原真菌 如尖孢镰刀菌 f u s a r i u mo x y s p o r u m 具有较强的抑制作用 并对其中活性最强的 芽胞杆菌h 9 9 8 7 进行了发酵条件的优化及胞外抑菌物质的理化特性的研究 但未 见对其结构鉴定的研究 田黎等 2 0 0 3 在海洋生态系统中 放线菌不是主要的微生物区系 但海洋放线菌是抗生素的 重要来源 廖文彬等 2 0 0 5 从渤海海水中分离筛选得到一株具有防病 由镰刀 菌引起的根腐病 减毒 土壤紫青霉菌分泌毒素引起连作大豆全生长发育过程的 中毒 作用的海洋放线菌m b 9 7 经鉴定该菌为细黄链霉菌 s t r o t o m y c e s m i c r o f l a v u s 有学者研究了潮间带海洋动植物共附生抗菌微生物的情况发现 虽然 放线菌数量低于细菌 但却有相当高的抗菌活性和更广的抗菌谱 尤其是抑制丝状 真菌生长的活性 程沁园等 2 0 0 7 海洋真菌的抗菌研究工作进行得比较缓慢 中山大学生命科学学院从大亚湾海 底沉积物中分离出一株海洋霉菌 编号为1 7 9 该菌株对多种酵母类真菌 皮肤感 染真菌及植物病原真菌均具有强烈的抑制作用 李淑彬等 2 0 0 3 该霉菌产一种 醌类化合物t e r r e i c a c i d 国内外虽然对海洋微生物抗菌活性进行了筛选研究 但仍处于初级阶段 海洋 微生物资源丰富 尤其是深海微生物种类和数量之多超乎人们的想象 在深海海水 中存在着各种微型浮游微生物 海底沉积物中微生物的种类更为广泛 包括放线菌 真菌 非极端菌和各种极端菌如嗜碱菌 嗜热菌 嗜压菌 嗜冷菌等 c h r i s t o p h e r s e n e ta 1 1 9 9 9 r a v i le ta 1 2 0 0 7 目前的研究工作 只涉及到海洋微生物的极小一 部分 大量的海洋微生物 尤其是从深海微生物中筛选新的抗作物病原菌和新活性 物质尚未丌展 因此具有巨大潜力 肖春 2 0 0 3 1 3 2 海洋微生物抗菌物质的种类 由于海洋环境的特殊性 海洋微生物具有独特的代谢方式 产生许多具有新颖 化学结构的化合物 代谢物化学结构具有极大的复杂性和多样性 众多海洋微生物 产生各种各样的抗菌物质 根据其化学结构可分为氨基糖苷类 大环内酯类 小环 内酯类 醌类 多肽类 萜类 杂环类等 m a r w i c ke ta 1 1 9 9 9 m o h a p a 仃ae ta 1 2 0 0 2 下面就对近年来已报道的从海洋微生物中分离鉴定得到的具有一定生物活 性的化合物作一简述 1 3 2 1 氨基糖苷类 3 2 0 0 8 屙华中农业人学硕 学位论义 冈见吉郎 o k a m ie ta 1 1 9 7 9 从日本t e n j i n 岛近海海泥中分离到一株链霉菌 s t r e p t o m y c e st e n j i m a r i e n s i s 产生一种氨基糖苷类化合物天神霉素 i s t a m y c i n s 主要组分为i s t a m y d na b 具有强烈的抑制革兰氏阳性菌和阴性菌的作用 包括 那些对原有氨基糖苷类抗生素有抗性的菌种 其组份b 的抗菌活力是a 的2 至4 倍 1 3 2 2 大环内酯类化合物 大环内酯类化合物是形成环状结构的内酯类化合物 其环通常是大于1 2 元环 的大环 大环内酯类化合物在陆地微生物活性物质的研究丌发中常见 在海洋微生 物的代谢产物中也较为常见且一般具有较强的活性 从一株海洋链霉菌b 一6 0 0 7 菌株中分离到两个己内酯类化合物 r 1 0 m e t h y l 6 u n d e e a n o l i d e 和 6 r 1 0 s 1 0 m e t h y l 6 d o d e c a n o l i d e 该两个化合物是 通过对发酵液的乙酸乙酯萃取浓缩液进行g c m s 跟踪分离获得 k a t j ae ta 1 2 0 0 4 它们具有较好的抗真菌活性 同时也发现它们还具有较强的抗肿瘤活性 其中对肝 癌和乳腺癌的i c 5 0 值都在2 5i t g m l 左右 且处于g 1 期的细胞最为敏感 为细胞 周期分裂的抑制剂 因此具有潜在的市场丌发前景 1 3 2 3 小环内酯类 d i a n e 等从加利福尼亚海峡软珊瑚 p a c i f i g o r g i as p 表面上获得的一株链霉菌 提取到o e t a l a c t i na 和b 为8 元环内酯 具有抑菌活性 海洋沉积物中的海洋芽 孢杆菌 b a c i l l ss p 产生一种新的异构香豆素p m 9 1 2 8 这种碱基被取代的异构香 豆素 i s o c o u m a r i n s 具有抗真菌和抗癌活性 张宁波 2 0 0 6 1 3 2 4 醌类化合物 海洋微生物产生的醌类化合物主要是以萘醌 葸醌类化合物及其衍生物的形式 存在 葸醌类化合物多具有抗氧化和抗肿瘤活性 o k a z a k i t 等在沙漠湾浅海泥分离 的钦氏菌 c h a i n i a p u r p u ro g e n a 其产生的s s 2 2 8 y 是一种新型的苯并葸醌类 b e n z a n t h r a q u i n o n e 抗生素 具有抗革兰氏阳性菌活性 同时也是一种多巴胺 b 羟化酶抑制剂 o k a z a l de ta 1 2 0 0 5 从河口一株海洋放线菌c n h 3 7 0 分离获得 芳香类化合物l u i s o l sa 和b 其中l u i s o l sa 为蒽醌类抗生素 属黏菌素类 由南 加利福尼亚海沉积物中分离的放线菌c n b 6 3 2 得到倍半萜萘醌酮化合物m a r i n o n e 和去溴 m a r i n o n e 也具有抑菌活性 a h m e de ta 1 2 0 0 3 1 3 2 5 多肽类 i m a d a 等从交替单胞菌 a l t e r o m o n a ss p 分离得到一种低分子量多肽 1 5 0 0 1 7 0 0u 称为m a r i n o s t a t i n s 是一种广义的蛋白水解抑制剂 可抑制真菌甲 壳质水解酶的活性 佛罗里达珊瑚礁水母体附生放线菌 产生l 氨基酸形成的环肽 s a l i n a m i d e a 和b 具有新的内酯环肽骨架 能选择性地抑制革兰氏阳性菌 c a r s t e n 1 9 9 0 从几内亚巴布亚岛的蠕虫组织分离的一株芽孢杆菌 能产生一组新的环肽 菌素l o l o a t i n sa d 能抑制抗二甲氧基苯青霉素的s t a p h y l o c c o c c u sa u r e u s 及抗药物 4 抗植物病原真菌海洋赞杆菌及 e 活性物质研究 的s t r e p t o c o c c u sp n e u r n o n i a e 1 3 2 6 萜类 萜类化合物是天然的烃类化合物及其衍生物 分子中往往含有具有异戊二烯的 多单元结构 海洋微生物产生的萜类化合物也丰富多样 主要有三环倍半萜 二环 倍半萜和开环四萜等形式的结构 萜类化合物往往也具有多种生物活性 从海泥中 分离的一株海洋真菌 e m e r i c e l l av a r i e c o l o r g f l 0 菌株中分离到了9 个o p h i o b o l i n 二倍半萜类化合物 其中o p h i o b o l i nk 对t 4 7 d 和m d a m b 2 3 1 人乳腺癌细胞系 h o p l 8 和n c i h4 6 0 人肺癌细胞系 h c t l1 6 人结肠癌细胞系 a c h n 人肾癌细胞 系 p 3 8 8 小鼠白血病细胞系 p 3 8 8 a d r 抗白血病细胞系等一系列肿瘤细胞系都显 示了细胞毒性 其中对耐阿霉素 a d r i a m y c i n 小鼠白血病细胞p 3 8 8 的i c 5 0 值为 o 2 7 0 6 5 阻n o l l 胡申才 2 0 0 3 1 3 2 7 杂环类 日本k o b a y a s h i 等人培养海绵h y r t i o s a l t u m 的共生细菌h b r i os p 获得一种全 新的吲哚三聚体抗生素t r i s i n d o l i n e k o b a y a s h ie ta 1 1 9 9 5 从海洋细菌a l t e r o m o n a s r a v as a n k 7 3 3 9 0 分离得到一种独特的含硫化合物t h i o m a r i n o l sa g 通过质谱分析 及化学降解可知 t h i o m a r i n o l s 是假单胞茵酸衍生物和去乙酰全霉素的混合物 对 革兰氏阴性和阳性菌的作用强于假单胞菌酸和吡咯类抗生素 i m a m u r a 等从大型藻 p o c o k i e l l av a r i e g a t a 分离的一株海洋细菌p e l a g i o b a c t e rv a r i a b i l i s 其代谢产物可 获得酚嗪类抗生素p e l a g i o m i d n sa c 其中p e l a g i o m i e i na 可抑制多种病原真菌 细菌 同时还具有抗癌活性 i m a m u r aa n dn i s h i j i m a 1 9 9 7 1 3 2 8 其他活性物质 迄今为止 从海洋微生物中发现并分离的次生代谢物质除以上几大类别外 还 有许多其它类化合物 如脂肪酸类 烯类 醇类 甾体类等 从海洋细菌中分离筛 选的天然活性产物还有多糖 维生素 氨基酸等 如 m i l i 等从一种屈挠杆菌 f l e x i b a c t e rs p 分离出类胡萝卜素 方金瑞等分离到类胡萝卜素和b 胡萝卜素 方 金瑞 1 9 9 8 海洋微生物代谢也产生大量的有机酸及其酯类 有些化合物亦表现 出了一定的生物活性 如抗肿瘤 抗菌和抑制酶活性等 澳大利亚的w e l l s 研究小 组在药物筛选的过程中 发现一株变单胞菌 a l t e r o m o n a sr u b r a 培养液的氯仿萃 取物在体外试验中显示了支气管扩张活性 1 4 黄杆菌属细菌产生的活性物质 研究显示 具有抑菌作用的近海海洋细菌主要属于假单胞菌属 p s e u d o m o n a s 发光杆菌属 p h o t o b a c t e r i u m 梭状芽孢杆菌属 c l o s t r i d i u m 交替单胞菌属 a l t e r o m o n a s 黄杆菌属 f l a v o b a c t e r i u m 屈桡杆菌属 f l e x i b a c t e r 黄单胞 菌属 x a n t h o m o n a s 7 个属 而大部分的活性菌株属于发光杆菌属 假单胞菌属 梭状芽孢杆菌属 黄杆菌属和交替单胞菌属 a l a n 就a 1 2 0 0 4 z h e n ge ta 1 2 0 0 4 5 2 0 0 8 扁华中农业人学顾i 学位论文 黄杆菌属细菌对枯草芽孢杆菌 b a c i l l u ss u b t i l i s 金黄色葡萄球菌 s t a p h y l o c o c c u s a u r e u s 和根瘤土壤杆菌 g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s 明显抗菌效果 郑立等 2 0 0 4 k o b a y a s h i 等从i s h i k a r i 海湾收集的海洋贝壳c r i s t a r i ap l i c a t a 中分离出细菌 f l a v o b a c t e r i u ms p k o b a y a s h ie ta 1 19 9 5 2 5 0 c 时 细菌在z o b e l l 培养基中稳定 生长1 0 天 细菌菌体用氯仿 甲醇 1 1 萃取 提取浸膏在乙酸乙酯和h 2 0 之间 进行分配 溶于乙酸乙酯的部分进行硅胶柱层析后再进行反向柱层析得到 f l a v o c r i s t a m i d ea 和b k o b a y a s h ie ta 1 1 9 9 5 y a 西等从革兰氏阴性细菌 f l a v o b a c t e r i u mm a r i n o t y p i c u m a t c c1 9 2 6 0 菌体中分得一种单酰二糖单酰甘油 乙 酰衍生 有些黄杆菌属能产抗肿瘤活性的化合物 如日本冈见分离到一株黄杆菌 属的海洋细菌u l i g i n o s u m 代谢产杂多糖m a r i n a c t a n 能增强机体免疫功能和抑制动 物肿瘤并成为化疗药物治疗肿瘤的佐剂 n a t h a ne ta 1 2 0 0 4 但未见海洋黄杆菌 属抗农作物病原菌的报道 1 5 本课题的立题背景及研究目的 1 5 1 本课题的立题背景 从近海海洋微生物得到的化合物中新结构物质比例远高于陆生微生物 研究人 员己从海洋细菌 放线茵和真菌中分离出众多的具有新分子结构的抗菌 抗病毒和 抗肿瘤化合物 对用于医学的深海微生物活性物质研究显示 深海微生物将是新活 性物质的重要来源 因此从中发现具有抗作物病原菌的新活性物质是一种有效途 径 对于解决目前困扰我们的几种重要作物病害问题具有十分重要意义 本研究从丰富而新颖的深海微生物资源中筛选对农作物病原菌具有稳定拮抗 作用的海洋菌株 以水稻纹枯病 棉花枯萎病和油菜菌核病三类病原菌为筛选模型 采用高通量筛选方法 在已有筛选的基础上继续筛选有效深海微生物 对活性物进 行深入研究 已筛选到的几株高效抗病原真菌深海细菌 如黄杆菌w w p 3 7 f l a v o b a c t e r i u ms p 等 与现有菌的产物相比 抗菌谱不同 并能抗多种作物病 原菌 对这些菌的活性产物 用h p l c 等方法分离纯化 用质谱仪鉴定它们的初步 结构 确定其活性谱和最小抑制浓度 以期发现新种和新的靶标化合物 1 5 2 本研究的目的与意义 本试验的研究目的与意义主要有二 其一是从海洋微生物菌种中进行抗作物病 原菌的筛选分离 建立资源库以供研究之用 其二是通过抗农作物病原菌筛选模型 进行活性菌株的理性筛选 从中分离 筛选出对几种作物病原菌具有稳定拮抗作用 的海洋菌 确定其拮抗谱 对次级代谢抗菌物质进行分离 纯化并加以鉴定 为抗 农作物病原菌的研究开发提供先导化合物 对活性菌株的发酵条件进行优化 获得 高产抗菌物质并对该产物对农作物真菌病害生防作用进行评价 期望提供一种具有 生物防治功效的微生物制剂 6 抗植物炳原真菌海洋黄杆菌及 e 活性物质研究 第二章材料和方法 2 1 海洋微生物菌种来源 海洋微生物分三批共计1 7 6 株均由中国海洋微生物菌种保藏管理中 l m c c c 提供 海洋黄杆菌w w p 3 7 f l a v o b a c t e r i u ms p m c c c1 a 0 1 3 6 8 由国家海洋局 第三海洋研究所海洋生物遗传资源重点实验室邵宗泽博士鉴定 2 2 植物病原菌 植物病原真菌 稻梨孢菌 尸矿i c u l a r i ao r y z a ec a v 稻生黄单胞 x a n t h o m o n a s o r y z a ep v o r y z a e 立枯丝核菌 r h i x o c t o n i as o l a n ih u h n 尖刀镰孢菌 f u s a r i u m o x y s p o r u mf s p v a s i n f e c t u m 核盘菌 s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m l i b d eb a r y 葡萄 孢菌 b o t r y t i sc i n e r e ap e r s 意大利青霉 p e n i c i l l i u mi t a l i c u mw e h m e r 玉蜀黍平 脐蠕孢 b i p o l a r i sm a y d i s 叫i s i k a d oe tm i y a k e s h o e m l 奇异长喙壳菌 c e r a t o c y s t i s p a r a d o x a d a d e m e r e a u 玉蜀黍赤霉 g i b b e r e l l az e a e s c h w 和病原细菌 e s c h e r i c h i ac o l i p a s t e u r e l l am u l t o c i d a p r o t e u sv u l g a r i s s a l m o n e l l aa r i z o n a e s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 和s t r e p t o c o c c u ss