发表论文3.21.doc

醒脑开窍法对阳明腑实证发热大鼠神经肽类分子的影响摘要目的：探讨醒脑开窍法对阳明腑实证发热大鼠下丘脑中促肾上腺激素释放激素（CRH）、血管加压素（AVP）、P物质（SP）、神经降压素（NT）的含量影响。方法：参照樊氏1造模法，建立大鼠阳明腑实证发热模型，随机分为6组：空白组、模型组和4组给药治疗组，各治疗组应用醒脑静注射液、大承气汤、醒脑静合用大承气汤（简称开窍通腑组）、扑热息痛治疗，体温下降期处死动物，观察其下丘脑、胃、结肠及血浆中CRH、AVP的含量变化。结果：神经肽类物质的含量治疗组与模型组间存在显著性差异（P0.05），通过药物作用提高机体AVP含量来抑制内生致热源CRH的生成，从而使CRH的含量降低，抑制体温升高；通过药物作用使P物质、NT的含量增加来降低体温。结论：醒脑开窍法对大鼠阳明腑实证发热有很好的解热作用，但开窍法兼顾通腑法治疗效果最佳。其解热机制与神经肽类物质CRH、AVP、P物质、NT的含量有关；在脑-肠轴的调控下，药物作用于机体，通过改变机体神经肽类分子的含量参与体温调节，维持机体内环境的稳态，使体温恢复正常。关键词：醒脑开窍法；神经肽；阳明腑实证；发热； 开窍法，是开通心窍，苏醒神志的治法，传统上用其治疗窍闭时表现的意识昏迷、谵语等，但近年来，被广泛应用于临床各种发热的治疗，如肺系疾病发热2-6、中枢性发热7-11、癌性发热12-15、流行性出血热发热16-19等，并取得良好疗效。其临床常用代表方剂醒脑静注射液治疗各种发热亦有诸多报导，但其作用于机体的解热机制尚不明确。本研究基于脑肠相通理论和同病异治的治疗原则，旨在研究醒脑开窍法对体温正负调节因子的影响，揭示醒脑开窍法对阳明腑实证的解热机制，为指导临床治疗发热性疾病提供实验依据。1材料与方法1.1药品试剂Elisa试剂盒（由上海江莱生物科技有限公司提供）；大肠杆菌内毒素（由西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司,批号L-2630）称取1mg（3106EU/mg），加300ml生理盐水配制成10000EU/ml的母液，取1ml母液加250ml生理盐水，配制成40EU/ml的大肠杆菌内毒素注射液；附子、干姜、肉桂（购自山东中医药大学中鲁医院）以1:1:1做水煎剂，先泡一个小时，加十倍量的水，水沸后半小时，过滤药液，再加八倍量的水，煎煮40分钟，过滤药液，两次药液混合后，将药液浓缩至2g/ml，4保存；大承气汤（购自山东中医药大学中鲁医院）大黄12g，厚朴24g，枳实12g，芒硝9g，先煎厚朴、枳实，水沸30分钟，后下大黄，约十分钟后，过滤药液，第二遍煎约20分钟，两遍和在一起溶入芒硝，浓缩至1g/ml，4保存；醒脑静注射液（购自山东省中医院）；扑热息痛片：（购自山东省中医院）根据换算系数，取一片扑热息痛，加33.3ml蒸馏水，给药量即是体重/100ml；1.2实验仪器离心机（微量高速离心机（国产）仪器型号：TG16W）；微型电动匀浆机(购于北京优尼康生物科技有限公司)；酶标仪芬兰（Labsystems Multiskan MS）仪器型号(352型)；洗板机：芬兰（Thermo Labsystems）仪器型号(AC8)；培养箱(隔水式恒温培养箱（国产）仪器型号：GNP-9080型) ；电子体温计（欧姆龙）仪器型号LM-142。1.3动物分组取Wistar大鼠40只随机分为A、B、C、D、E、F组，每组10只，雌雄各半，A组（空白组）、B组（模型组）、C组（醒脑静组，造模后尾静脉注射醒脑静注射液，0.06ml/100g体重）、D组（大承气汤组，造模后灌服大承气汤，1ml/100g体重）、E组(醒脑静合用大承气汤，等效剂量)、F组（扑热息痛组，造模后灌服体重/100ml）。1.4造模给药除空白组外，用制好的附子、干姜、肉桂水煎剂，每天按20g/kg体重，对模型组和治疗组进行灌胃，空白组灌等量蒸馏水，连续12天后，禁食（不禁水）12h。将大鼠自身粪便制成100g/L的混悬液，给模型组和各治疗组大鼠2ml灌胃 ，每天两次，连续两天，空白组灌等量蒸馏水。根据40EU/100g体重于实验的第15天对模型组和治疗组进行腹腔注射，空白组注射等量生理盐水。治疗组于注射大肠杆菌内毒素后，分别进行给药治疗。1.5标本制备麻醉各组大鼠，在冰台迅速取出各组大鼠的动脉血、下丘脑、胃、结肠。将动脉血置37水浴30分钟后以3000转/分的速度离心10分钟，取血清置于5ml冻存管-20保存，下丘脑、胃、结肠分别匀浆后离心取上清液装入5ml冻存管置于-20冰箱保存。1.6指标检测体温测量使用电子体温计测量大鼠肛温。各组织CRH、AVP、SP、NT的测量采用Elisa试剂盒进行检测。1.7统计处理采用GraphPad Prism 4进行统计学处理，所有数据结果均以s表示，组间均数比较s结果经t检验，P0.05表示有差异性。2 实验结果2.1体温动态变化曲线 如下图1所示阳明腑实证大鼠尾静脉注射醒脑静后体温下降迅速且平缓，大承气汤组体温迅速下降的同时，由于过度的泄泻导致体温降至基础体温以下，醒脑静合大承气汤组的体温下降较以上两组还要迅速，且降低的趋势较单用大承气汤组平缓，表现出理想的解热作用。西药扑热息痛的解热效果亦明显迅速，但在解热的过程中偶尔出现反复的体温回升趋势。从各组大鼠的体温变化过程中的平均体温来看（见图3-1），除模型组与空白组之间有统计学意义外，其余各给药组与空白组之间没有统计学意义，证明醒脑静注射液及大承气汤、扑热息痛等同样对阳明腑实证大鼠具有很好的解热作用，由此可见，醒脑开窍法在治疗阳明腑实证发热过程中发挥有效的解热作用。图1：给药后体温动态变化曲线2.2各组大鼠脑肠轴上各组织中CRH、AVP、SP、NT的含量如表2、表3所示，CRH、AVP主要分布在下丘脑中，在胃肠及血浆中也广泛分布，各组间进行比较，CRH的含量治疗组明显低于模型组（P0.05），接近于空白组水平；AVP的含量差异性主要表现在治疗组与空白组（*P0.05），考虑模型组AVP含量高于空白组却与治疗组差异不大，这可能与大鼠自身免疫有关。表4、表5显示，SP的含量各治疗组含量明显高于空白组，模型组SP含量升高可能与自身免疫相关，NT的含量各治疗组含量明显高于空白组（*P0.05）和模型组（P0.05），但各给药组与醒脑静组比较没有显著性差异。表2：大鼠各组织中CRH的含量比较（ng/L）（s, n=10）下丘脑脊髓胃结肠肾肺血浆A组B组C组D组E组F组32.301.20*40.044.4033.342.89*33.663.19*29.141.61*30.423.67*23.853.15*30.915.1723.641.89*24.401.76*22.642.49*23.972.34*22.243.07*27.451.9721.282.92*22.872.42*20.691.97*20.963.17*19.303.91*24.811.7317.952.17*19.572.60*20.241.78*20.743.45*20.340.89*24.182.2519.480.95*21.101.60*22.301.84*20.280.97*22.201.45*26.062.9021.411.32*21.541.33*21.380.84*22.421.46*24.290.98*27.373.0822.961.66*21.471.48*22.721.74*23.512.62*与A组比较P0.05，与B组比较*P0.05，与C组比较P0.05表3：大鼠各组织中AVP的含量比较（ng/L）（s, n=10）下丘脑脊髓胃结肠肾肺血浆A组B组C组D组E组F组541.026.35575.925.74607.815.98608.128.97587.018.79593.129.09459.444.02513.237.30539.833.17517.840.51528.141.94513.230.15532.737.57583.257.95599.534.68577.652.06621.136.30595.364.18466.837.89*533.940.45562.341.50530.541.34593.328.75*525.936.34463.240.13*510.221.57533.838.75538.424.17552.525.30*572.317.93*465.025.91507.418.39551.052.01521.241.83548.240.76507.837.75473.727.37528.548.36543.150.04535.642.93558.612.72534.834.02与A组比较P0.05，与B组比较*P0.05，与C组比较P0.05表4：大鼠各组织中中SP的含量比较（ng/L）（s, n=10）下丘脑脊髓胃结肠肾肺血浆A组B组C组D组E组F组147.45.15155.46.61161.17.11159.95.39168.47.55*160.63.41138.49.46144.83.61152.45.94156.02.26*156.38.43*151.24.89106.15.31109.110.26115.39.37114.96.23124.75.90*118.47.7996.299.3693.127.58113.15.19*107.15.74*112.56.65*110.16.30*87.125.0185.204.3588.476.5389.575.2790.633.5292.974.8082.137.1380.983.0191.105.43*89.196.4098.359.36*91.245.19*102.26.64100.48.78108.06.81106.25.72107.96.29108.98.12与A组比较P0.05，与B组比较*P0.05，与C组比较P0.05表5：大鼠各组织中中NT的含量比较（ng/L）（s, n=10）下丘脑脊髓胃结肠肾肺血浆A组B组C组D组E组F组105.34.68*111.85.67134.52.49*136.42.69*169.81.96*157.06.19*98.427.45103.03.01130.02.30*141.32.91*155.14.90*143.56.78*74.657.7376.085.99109.38.74*101.63.41*118.46.27*97.414.14*68.066.5268.035.1585.804.91*84.655.24*93.882.31*82.695.06*52.955.2952.595.4069.263.51*69.734.33*74.777.63*65.455.64*51.014.0747.954.8764.515.05*62.824.97*69.825.53*61.792.46*84.424.4185.464.6495.047.24*96.143.58*108.15.29*92.813.37*与A组比较P0.05，与B组比较*P0.05，与C组比较P0.053讨论中枢脑内神经肽在体温调节和发热机制中的作用颇受注意，发现促肾上腺皮质激素释放激素(CRH）是重要的中枢发热介质。精氨酸加压素(AVP)是一种下丘脑合成的后垂体肽激素，在体温负调节中有重要作用20。P物质（ substance P，SP）、神经降压素（neurotensin，NT）在神经系统与非神经系统之间的桥梁作用，尤其是其介导的神经系统与免疫系统、神经系统与内分泌系统间的作用引人注目。众多试验证明P物质、NT参与体温调节反应 21。本实验表明：醒脑开窍法对阳明腑实证发热有很好的解热作用，其解热机制与神经肽类物质CRH、AVP、P物质、NT有关，通过药物作用提高机体AVP含量来抑制内生致热源CRH的生成，通过提高P物质、NT的含量来降低体温，从而达到速效解热的目的。同时，揭示了醒脑开窍法与通腑泻热法同样对胃肠道疾病造成的发热有很好的治疗作用，提示“肠病治脑”的思路，为“脑肠相通”理论提供实验依据。以此为基础引导我们探求治疗温病三焦发热的新的治疗方法。参考文献1樊新荣,王荣田,朱文锋.阳明病肠热腑实证大鼠模型的建立与机制J.世界华人消化杂志,2007;15(21): 2290-2294. 2陈霖.清开灵注射液治疗风热型感冒发热54例J.福建中药,1998;29(6):25-26.3赖意芬.醒脑静注射液治疗小儿外感高热142例J.中国中西医结合急救杂志,2000;7(2):70.4谷颖伟.蟾蜍注射液治疗小儿呼吸道感染50例J.现代中西医结合杂志,2005;14(4):492.5冼建平,关良劲,赵海娴.清开灵治疗急性上呼吸道感染高热疗效观察54例J.中国医药指南,2010;8(16):35-37. 6李雅琼,申艳梅,夏进娥.清开灵保留灌肠治疗感冒高热疗效观察J.实用中医药杂志,2009;(10):653.7张东兰,王新云.安宫牛黄丸治疗脑出血中枢性发热36例J.中成药,2001;23(1):73-74.8朱蓓,李碧莹,陈莹.安宫牛黄丸预防小儿热性惊厥25例J.传统医药,2011;20(20):71.9张晓红.含牛黄中成药的临床应用J.现代中西医结合杂志,2011;20(19):2463-2464.10姚爱玲,李青.牛黄制剂应用于高热中的临床观察J.河北医药,2011;33(4):637-638.11廖碧鹅.安宫牛黄丸在儿科感染性高热的应用中国中医急症J.1999;8(2):93.12袁仕烈.清开灵注射液治疗癌肿发热13例J.湖南中医杂志,1995;11(5):45.13周希广.安宫牛黄丸治疗肺癌发热J.浙江中医学院学报,1987;11(06):7.14张所乐,程剑华,赵德慧等.安宫牛黄丸并中医辨证治疗中晚期原发性肝癌2