（食品科学专业论文）水产过敏原的模拟胃肠液消化.pdf

学术诚信声明 兹呈交的学位论文 是本人在导师指导f 独立进行的研究工作及取 得的研究成果 除文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其 他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果 本人依法享有和承担由此 论文产生的权利和责任 声明人 签名 童国因 时间 叼辛易 日矽日 保护知识产权声明 本人完全了解集美大学有关保留 使用学位论文的规定 即 学校 有权保留送交论文的复印件和磁盘 允许论文被查阅和借阅 可以采用 影印 缩印或扫描等复制手段保存 汇编学位论文 同意集美大学可以 用不同方式在不同媒体上发表 传播学位论文的全部或部分内容 作者 签名 蕾i 虱国 铷c 枷p 乏伽 时间 坼舞易日z l i j 水产过敏原的模拟胃肠液消化 摘要 近年来 食物过敏问题受到了越来越多人的关注 也被认为是食品安全问题的一个重 要方面 在f a o 公布的八大类主要过敏食物中 水产品占了两类 虽然迄今为止已有不少 关于食物过敏机理的研究报道 但食物过敏原是通过什么途径引发过敏的以及食物过敏原 在消化道中的稳定性等问题 目前仍不是很清楚 绝大部分食物过敏原是通过肠胃接触引 发的 因此通常认为食物过敏原能耐受肠胃消化 在转基因食品致敏性的评估方面 已经 将模拟胃肠液消化作为评价转基因蛋白致敏性的重要指标 但是近年来很多研究者对这种 评估的有效性提出了质疑 所以 对该问题仍然需要进一步的研究 锯缘青蟹 s c y l l as e r r a t a 中华绒螯蟹 e r i o c h e i rs i s e n s i s 斑节对虾 p e n a e u sm o n o d o n 和南美白对虾 p e n a e u sv a n n a m e i 等甲壳类动物肉质鲜美 营养丰富 是我国乃至全世界水 产养殖业的重要对象 白鲫鱼 c a r a s s i u sa u r a t u s 白鲢鱼 h y p o p h t h a l m i c h t h y sm o l i t r i x 则 是我国淡水养殖具有重要经济价值的优质鱼类 我国国民由于消费上述水产品而引发食物 过敏的报道屡见不鲜 但有关水产过敏原的体外模拟消化鲜见报道 本研究以上述几种水 产品为研究对象 通过模拟胃肠液消化试验分析甲壳类和鱼类主要过敏原 分别为原肌球蛋 白和小清蛋白 的消化特性 消化过程中影响消化性的因素 消化对过敏蛋白致敏性的影响 等指标 以期为解明水产动物过敏原的消化稳定性以及今后开发低过敏性水产食品提供参 考 首先 参考美国药典描述的模拟胃 肠液配方 测定了纯化的甲壳类原肌球蛋白和鱼 类小清蛋白在体外模拟胃 肠液消化过程中的稳定性 以十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶 电泳 s d s p a g e 和免疫印迹法 w e s t e r nb l o t 进行分析 结果发现在模拟胃液消化试验中 甲壳类动物原肌球蛋白具有较高的稳定性 而鱼类小清蛋白则能被较快的分解 在模拟肠 液消化试验中 原肌球蛋白则能被不同程度地分解 并产生一些降解条带 而小清蛋白则 几乎不被分解 其次 对甲壳类肌原纤维蛋白和鱼类肌浆蛋白进行体外模拟胃 肠液消化 比较过敏 蛋白与其他蛋白消化特性的区别 结果显示在模拟胃液中 相对于原肌球蛋白 肌球蛋白 重链 肌动蛋白能被快速的分解 在模拟肠液消化中 蟹类肌动蛋白比原肌球蛋白要耐降 解 而虾类则相反 说明过敏蛋白不一定都比其他蛋白稳定 消化稳定性和过敏性没有必 然的联系 分别采用兔抗蟹类原肌球蛋白 兔抗鱼类小清蛋白特异性多克隆抗体的免疫印 迹检测粗提蛋白中过敏蛋白的分解情况 结果表明其他蛋白的存在对甲壳类原肌球蛋白和 鱼类小清蛋白的消化特性基本没有影响 考虑到人体的实际生理情况 研究酶 蛋白比值和p h 值对模拟胃液消化过敏蛋白稳定 i 性的影响 结果表明 提高胃蛋白酶的相对比例有利于原肌球蛋白的降解 但是原肌球蛋 白的降解产物具有较强的稳定性 即使当酶 蛋白比值提高到1 0 1 时 一些稳定的降解条 带仍未被完全分解 当p h 5 时 胃液消化会受到抑制 原肌球蛋白和小清蛋白均不会被 消化分解 最后 采用免疫印迹 i g e i m m u n o b l o t t i n g 矛 l l 抑制性酶联免疫吸附试验 i n h i b i t i o n e l i s a 检测甲壳类原肌球蛋白消化产物的i g e 结合情况及消化对蛋白致敏性的影响 结果发现 模拟胃 肠液消化能在不同程度上降低甲壳类原肌球蛋白的致敏性 其中以胰蛋白酶作用 最为明显 胰凝乳蛋白酶对蟹类原肌球蛋白致敏性的降低作用明显强于胃蛋白酶 但是 二者对于虾类原肌球蛋白致敏性的降低作用均不明显 关键词水产品 过敏原 模拟胃肠液消化 致敏性 s d s p a g e 免疫印迹 抑制性e l i s a i l e f f e c to fi nv i t r og a s t r o i n t e s t i n a id i g e s t i o no na l l e r g e n s j oo o fa q u a t cp r o d u c t s a b s t r a c t t h ei n c i d e n c eo ff o o da l l e r g yc r e a t e da l li n c r e a s i n gp r o b l e ma n di sc o n s i d e r e d 嬲am a j o r c o n c e r no ff o o ds a f e t y a m o n gt h e8m a j o rs o u r c e so ff o o da l l e r g e n s t w os p e c i e s c r u s t a c e a n s a n df i s h a r eb l o n gt os e af o o d a l t h o u g hm a n yr e s e a r c h e so nt h em e c h a n i s mo ff o o da l l e r g e n s s e n s i t i z i n gh y p e r s e n s i t i v i t yr e a c t i o n sh a v eb e e nc a r r i e do u t t h em e c h a n i s m sb yw h i c hf o o d a l l e r g e n ss e n s i t i z ea ni n d i v i d u a la n dt h es t a b i l i t yo ff o o da l l e r g e ni na l i m e n t a r yt r a c tr e m a i n s u n c l e a r m o s to ft h e ma r et h o u g h tt os e n s i t i z ev i at h eg a s t r o i n t e s t i n a l g i t r a c t i nc o n s e q u e n c e i ti sg e n e r a l l yr e g a r d e dt h a ta na l l e r g e nm u s te n d u r ed e g r a d a t i o ni nt h eg it r a c t s t a b i l i t yt o d i g e s t i o nh a sb e e np r o p o s e da so n eo ft h ei n d i c a t i o nt oa s s e s st h ea l l e r g e n i cp o t e n t i a l o f t r a n s g e n i cf o o d s h o w e v e r r e c e n t l y t h ev a l i d i t yo fd i g e s t i o ns t a b i l i t y 硒ac r i t e r i o nf o rp r o t e i n a l l e r g e n i c i t ya s s e s s m e n th a se n c o u n t e r e d s o m ec r i t i c i s m t h u s f u r t h e rs t u d yi sn e e d e dt o e v a l u a t et h es t a b i l i t yo fa l l e r g e n st od i g e s t i o n c r u s t a c e a n ss u c h 嬲m u dc r a b s c y l l a e r r a t a c h i n e s em i t t e nc r a b e r i o c h e i rs i n e n s i s g r a s sp r a w n p e n a e u sm o n o d o n a n dw h i t e l e gs h r i m p p e n a e u sv a n n a m e i a r er e g a r d e d 镐a d e l i c a c yf o ri t sh i g h e rm e a tc o n t e n ta n dn u t r i t i o n t h e s ec r u s t a c e a n sh a v eap r o m i s i n gf i s h e r y i n d u s t r yi nc h i n aa n de v e no v e rt h ew o r l d c r u c i a nc a r p c a r a s s i u sa u r a t u s a n ds i l v e rc a r p h y p o p h t h a l m i c h t h y sm o l i t r i x a l s oh a v eap r o m i s i n gf r e s h w a t e rf i s h e r yi n d u s t r ya n dp o s s e s sa n i m p o r t a n te c o n o m i c a lv a l u e b e c a u s eo ft h ei n c r e a s i n gc o n s u m p t i o no fs u c hk i n d so f s e af o o d s t h er e p o r ta b o u to c c u r l e n c eo fh y p e r s e n s i t i v er e a c t i o n si sa l s oe x t e n d i n g h o w e v e r r e s e a r c h e s t h a ts y s t e m i c a l l ys t u d yt h ei nv i t r og a s t r o i n t e s t i n a ld i g e s t i o no ns e af o o da r es c a r c e i nt h e p r e s e n ts t u d y t h ed i g e s t i v es t a b i l i t yo ft h em a j o rc r u s t a c e a na l l e r g e n t r o p o m y o s i n t m a n df i s h a l l e r g e n p a r v a l b u m i n p a v f a c t o r st h a tm a ya f f e c tt h ed i g e s t i o nr e s u l ta n dt h ee f f e c to f g a s t r o i n t e s t i n a ld i g e s t i o no na l l e r g e n i c i t yo fa l l e r g e n sw e r ea 1 1a n a l y z e df o rt h ed e v e l o p m e n to f h y p o a u e r g e n i cs e a f o o dp r o d u c t si nt h ef u t u r e f i r s t s t a n d a r ds i m u l a t e dg a s t r i cf l u i d s g f a n ds i m u l a t e di n t e s t i n a lf l u i d s r z w e r e p r e p a r e d b a s e do nt h eu n i t e ds t a t e sp h a r m a c o p e i a t h es t a b i l i t yo fa l l e r g e n i cp r o t e i n t r o p o m y o s i na n dp a r v a l b u m i nt os g fa n ds i fw a sa n a l y z e d r e s p e c t i v e l y t h er e s u l t s w e r e e v a l u a t e db ys o d i u md o d e c y ls u l f a t e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e e t r o p h o r e s i s s d s p a g e a n d w e s t e r nb l o t i ns g fs y s t e m c r u s t a c e a na l l e r g e nt r o p o m y o s i nw a sr e l a t i v e l yr e s i s t a n tt op e p s i n w h i l ef i s ha l l e r g e np a r v a l b u m i nw a sr a p i d l yd e g r a d e dw i t h i nas h o np e r i o do ft i m e i ns i r t m t t t c a r lb ed e c o m p o s e dt od i f f e r e n td e g r e e s r e s u l t i n gs e v e r a lf r a g m e n t s w h i l ep a r v a l b u m i nw a s s t a b l e i nt h es l f h a r d l yt ob ed e c o m p o s e d n e x t d i g e s t i o no f c r u s t a c e a sm y o f i b r i l l a rp r o t e i n sa n df i s hm u s c l ep r o t e i n sb ys g fa n ds i f w e r ea l s oc a r r i e do u t 1 1 1 es t a b i l i t yo fa l l e r g e n i cp r o t e i na n do t h e rp r o t e i n sw a sc o m p a r e da n d t e s t e d r e s p e c t i v e l y i ns g f m y o s i nh e a v yc h a i n m s c a n da c t i nw a sr e l a t i v e l ym o r er a p i d l y d e c o m p o s e dt h a nt m i ns i f c r a ba e t i ni sm o r es t a b l et h a nt m w h i l es h r i m pa c t i ni sm o r e d e g r a d a b l et h a nt m t h er e s u l t ss h o w e dt h a tf o o da l l e r g e n sa l en o tn e c e s s a r i l ym o r e r e s i s t a n tt o d i g e s t i o nt h a no t h e rp r o t e i n s t oc l a r i f yt h ei d e n t i t yo ft h ed e g r a d e dp r o t e i nf r a g m e n t s w e s t e r n b l o tu s i n gs p e c i f i cp o l y e l o n a la n t i b o d i e sa g a i n s ta c t i n t ma n dp a vw e r ec a r r i e do u t t h er e s u l t s a l s os u g g e s t e dt h ed e g r a d a t i o np a t t e r no fa l l e r g e nb ys g fa n ds i fw a sa l m o s tn o ta f f e c t e db y t h ep r e s e n c eo fo t h e rp r o t e i n s c o n s i d e r i n gt h er e a lp h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o no fh u m a n t h ep e p s i n p r o t e i nr a t i o s a n dp h w e r es t u d i e dt or e f l e c tt h ei n f l u e n c et os t a b i l i t yo fa l l e r g e n s i ti si d e n t i f i e dt h a tt h ea p p a r e n t s u s c e p t i b i l i t yo fa l l e r g e n st op r o t e o l y s i si sd e p e n d e n to l l t h ep e p s i nt oa l l e r g e nr a t i o t m p o s s e s s e sr e l a t i v e l yh i g h e rs t a b i l i t y e v e nt h ep e p s i nt oa l l e r g e nr a t i or e a c h e d1 0 1 s o m es t a b l e d e g r a d e df r a g m e n t sc o u l ds t i l lb ei d e n t i f i e d a tp h 5 t h ed i g e s t i o no fa l l e r g e n i cp r o t e i n sb y s g fw a sc o m p l e t e l ys u p p r e s s e d f i n a l l y i g ei m m u n o b l o t t i n ga n di n h i b i t i o n e l i s aw e r ec o n d u c t e dt od e t e c tt h e i g e b i n d i n ge p i t o p e si nt h ed i g e s t i o np r o d u c t sa n dt h ea l l e r g e n i c i t yo ft mb yp r o t e i n a s e s r e s u l t ss h o w e dt h a tc o m p a r e dw i mu n d i g e s t e ds a m p l e t h ea l l e r g e n i c i t yo fa l ld i g e s t e ds a m p l e s w a sr e d u c e dt od i f f e r e n td e g r e e s e s p e c i a l l yb yt r y p s i n a sf o rc r a b e h y m o t r y p s i ni sm o r e e f f e c t i v ei nr e d u c i n ga l l e r g e n c i t yo ft mt h a nt r y p s i n w h i l ef o rs h r i m p b o t he n z y m e sr e v e a l e d s i m i l a ra n df a i n te f f e c t s t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tp r o t e i n a s et r e a t m e n ti sa na p p r o p r i a t ew a y i nr e d u c i n gt m a l l e r g e n i c i t ya n di sh e l p 伽f o rf u t u r ed e v e l o p m e n to fh y p o a l l e r g e n i cs e a f o o d p r o d u c t s k e y w o r d s s e a f o o d s i m u l a t e dg a s t r o i n t e s t i n a ld i g e s t i o n a l l e r g e n a l l e r g e n i c i t y s d s p a g e w e s t e r nb l o t i n h i b i t i o ne l i s a i v 目录 第一章引言 1 1 1 食物过敏机理及症状 l 1 2 食物过敏原的种类和性质 l 1 3 食物过敏原的检测 2 1 4 食物过敏原的脱敏技术 2 1 5 水产品中的过敏原 3 1 6 体外模拟胃肠液消化研究 4 1 7 本文研究的目的和意义 5 1 8 主要研究目标及内容 6 第二章材料与方法 7 2 1 材料 7 2 1 1 水产品 7 2 1 2 试剂 7 2 1 3 实验所用溶液及其配制 8 2 1 4 实验仪器 1o 2 2 实验方法 1o 2 2 1 肌原纤维蛋白 肌浆蛋白的制备 1o 2 2 2 甲壳类粗蛋白的制备 1 0 2 2 3 主要过敏原 原肌球蛋白和小清蛋白 的纯化 1 1 2 2 4 模拟胃液消化实验 1 1 2 2 5 模拟肠液消化实验 1 2 2 2 6 酶 蛋白不同比值的模拟胃液消化 1 2 2 2 7 不同p h 值的模拟胃液消化 1 3 v 2 2 8s d s p a g e 13 2 2 9t r i c i n e s d s 队g e 1 4 2 2 10w e s t e r n b l o t 和i g e i m m u n b l o t t i n g 15 2 2 11 抑制性e l i s a i n h i b i t i o ne l i s a 16 第三章结果与分析 1 8 3 1 纯化过敏蛋白的模拟胃 肠液消化 18 3 1 1 原肌球蛋白 18 3 1 2 小清蛋白 2 2 3 1 3 小结 j 2 4 3 2 肌原纤维蛋白 肌浆蛋白的模拟胃 肠液消化 2 5 3 2 1 甲壳类动物肌原纤维蛋白的模拟胃 肠液消化 2 5 3 2 2 鱼类肌浆蛋白的模拟胃液消化 2 9 3 2 3 j 结 3 0 3 3 动物抗体w e s t e r nb l o t 分析消化产物 3 0 3 3 1 肌动蛋白 3 0 3 3 2 原肌球蛋白 31 3 3 3 小清蛋白 3 4 3 3 4 小结 3 5 3 4 酶 蛋白不同比值对消化的影响 3 5 3 4 1 甲壳类动物原肌球蛋白 3 5 3 4 2 鱼类小清蛋白 3 6 3 4 3 小结 3 7 3 5 不同p h 值对模拟胃液消化的影响 3 7 3 5 1 甲壳类动物原肌球蛋白 3 7 3 5 2 鱼类小清蛋白 3 8 v i 3 5 3 小结 3 9 3 6 过敏患者血清免疫检测消化产物 3 9 3 6 1i g e i m m u n o b l o t t i n g 3 9 3 6 2 抑制性e l i s a 4 0 第四章讨论与结论 4 4 4 1 纯化过敏蛋白的模拟胃 肠液消化 4 4 4 2 肌原纤维蛋白和肌浆蛋白的模拟胃 肠液消化以及w e s t e r nb l o t 4 5 4 3 酶 蛋白不同比值 p h 值对过敏蛋白消化稳定性的影响 4 6 4 4 模拟胃 肠液消化对原肌球蛋白致敏性的影响 4 7 4 5 结论 4 8 4 6 研究展望 4 8 致谢 4 9 参考文献 5 0 在学期间发表的学术论文 5 5 v n 中英文对照表 v m 篡羞太堂亟 堂焦途塞 丞亡过熟厘的搓拯冒题煎澄化 第一章引言 1 1 食物过敏机理及症状 近年来食品安全问题受到越来越多人的重视 食物过敏这一食源性疾病已引起广大消 费者 生产者和研究者的普遍关注 据国外流行病学调查 大约5 7 的儿童和1 2 的成人 有过食物过敏病症 1 1 中国疾控中心吕相征等的调查表明 在1 5 2 4 岁年龄段健康人群中 约有6 的人曾患有食物过敏 2 1 食物过敏医学上也称变态反应 主要是i g e 引起的i 型过敏 反应 其过敏机理是机体与抗原接触后 使机体对这种抗原呈致敏状态 当机体再次接触 该物质时 体内对应的特异性抗体会与其发生反应 促使细胞释放出组胺 趋化因子 白 三烯等生物活性物质 这些物质能使小血管扩张及通透性增加 粘膜体分泌增强 支气管 收缩等 从而引发致敏反应 3 1 食物过敏大多属于由i g e 介导的速发型过敏 其i i 缶床症状包 括过敏性皮炎 荨麻疹 过敏性鼻炎 哮喘 口腔综合症 肠病综合症等 严重的可导致 过敏性休克甚至危及生命 4 1 2 食物过敏原的种类和性质 过敏原是指能刺激机体发生过敏反应的物质 日常生活中的过敏原很多 有吸入性 如 花粉 皮毛 尘螨 烟雾 蚊香 油漆等 摄入性 如虾 蟹 鱼类 牛奶 花生 某些 水果或药物等 接触性 如化妆品 碘酒 某些外用药膏 塑料玩具等 注射性 如注射 青霉素 蚊虫叮咬 疫苗等 与吸入性过敏原相比 食物过敏原的种类更多 成分更复杂 环境影响因素也较多 由于人类每天进食的种类繁多 因此食物已成为诱发过敏性疾病的 重要因素之一 n 2 0 0 5 年已被i u i s i n t e r n a t i o n a lu n i o no fi m m u n o l o g i c a ls o c i e t i e s 认定的食物过敏原 共有1 2 7 种 其中动物来源过敏原2 2 种 植物来源过敏原1 0 5 种 5 1 9 9 9 年国际食品法典委 员会第2 3 次会议上公布的常见致敏食品 包括花生 牛奶 大豆 鱼类 鸡蛋 小麦 甲 壳类 蟹 虾 龙虾 和坚果 板栗 腰果等 等8 大类 9 0 以上的过敏反应是由这8 大类 常见致敏食品引起的 6 已报道的不常见过敏食物包括油菜子 主要粮食 蔬菜 水果 如 芒果 橘子 菠萝 牛肉 啤酒 巧克力等 大多数过敏性食物含有主要过敏原和次要过敏原 食物中9 0 的过敏原是蛋白质 但 并不是所有的蛋白质都会引起过敏 食物过敏原一般为具有酸性等电点 p i 的蛋白质或 已发生糖基化的蛋白质 一般分子量在1 0 8 0k d a 这些蛋白质通常具备小的分子量 水 溶性等特性 能使其穿过粘膜表面而易被机体吸收 还有研究报道大部分过敏原都具有 抗热变性 抗酸和抗蛋白水解的能力 能耐受食品加热或烹调等加工操作 兀 此外 还能 抵抗肠道消化酶的分解作用 8 1 当然 这些特性并不是致敏原所特有的 因为非致敏蛋白 塞羞太堂亟 堂僮j 佥塞 盔亡遵熟愿的搓赵豆题这消化 同样可具有这些特性 1 3 食物过敏原的检测 目前食物过敏原的检测主要分体内检测和体外检测 体内检测是通过人体内的试验 对过敏原的活性进行检测 目前较广泛应用的方法有 双盲安慰剂对照的食物激发试验 d o u b l e b l i n d e dp l a c e b o c o n t r o l l e df o o dc h a l l e n g e s d b p c f c 和皮肤试验 s k i np r i n k e ds t i n g s p t d b p c f c 被认为是诊断食物过敏的 金标 准 欧洲变态反应和临床免疫学会将其评定为唯一的判断食物过敏原的结论性实验一j 但 该方法不能确定具体的过敏原 耗时且费用昂贵 较少用于人群调查研究 皮肤试验作为 过敏原标准化的推荐方法 目前应用极为普遍 这种方法虽快速 简便 但其操作不安全 需要将过敏原注射入皮肤进行诱导反应 并且假阳性或假阴性的出现率也较高一j 体外检测主要有组胺释放试验 h i s t a m i n er e l e a s i n gt e s t h r t 和血清总i g e 测定 h r t 是因为i g e 介导的超敏反应会引起体内释放大量的组胺 通过测定组胺的含量来确定阴阳 性 但组胺测定必须在很短的时间 抽血后1d 之内 完成 且实验操作繁琐 应用受到很大 限制 方法有待改进 9 1 过敏原与i g e 结合是体现过敏原生物活性的中心环节 因此特异 性i g e 的血清学检测在食品过敏原检测过程中是必不可少的 目前已建立了放射标记过敏 原吸附实验 r a d i oa l l g o s o r b e n tt e s t r a s t 酶标记过敏原吸附实验 e n z y m el i n k e d a l l g o s o r b e n ta s s a y s e a s t 酶联免疫吸附试验 e l i s a 荧光和化学发光标记的检测技 术 c a p 变应原检测系统及免疫印记试验 d o t e l i s a 9 1 在体外过敏原检测实验中 r a s t 和e a s t 抑制实验是目前国际上临床及科研人员使用最灵敏 最广泛的方法 也是评价总 致敏活性的关键技术 r a s t 和e a s t 抑制实验的一个不足是对人血清的依赖性 由于人 血清i g e 的不确定性使得这两种方法也难以标准化 1 0 1 但是总体上来说 在检测食物过敏 蛋白与i g e 结合能力上 r a s t 和e a s t 抑制实验是较为理想的方法 l o j 1 4 食物过敏原的脱敏技术 食物过敏已严重影响到人们的生活和身体安全 研究食物过敏原的脱敏技术 制造低 致敏性食物在食品安全领域已成为一门重要的研究课题 根据去除原理可将食物脱敏技术分为物理化学法 酶法 生物化学法等3 类 其中最 常用的是物理化学法和酶法 l 物理化学法中的物理法主要有热处理和辐照 热处理是利用食物过敏原主要由蛋白质组成 蛋白质在高温处理下其空间构象及三维 结构会发生变化的原理 加热食物到一定程度以达到降低致敏性或去除过敏原的效果 热 处理破坏过敏原还取决于加热时间 加热温度以及蛋白质的内部特性等因素 虽然有报道 7 加热对过敏原致敏性的影响并不显著 但也有报道指出加热会使一些过敏原的致敏性降 篡差太堂亟 堂僮i 佥塞丞亡过熟厘数撞塑宦殛渲逍位 低 例如p a s c h k e 等 1 2 研究发现加热牛奶1 0m i n 能降低其过敏性 一般情况下 利用加热 方法来降低食品过敏原性的效果并是很不理想 因为大部分过敏原具有很强的耐热性和抗 机械破坏稳定性 使用长时间加热来破坏其过敏原 会引起食品感官质量下降 营养成分 损失 加工特性降低等问趔引 辐照能使食品分子的化学键断裂 从而导致蛋白质的结构发生改变 等 1 3 用丫射线 辐照虾肉 发现当辐照剂量超过1 0k g y 时 虾肉的过敏原性有明显的降低 刘光明等 1 4 j 对南美白对虾和梭子蟹原肌球蛋白进行辐照处理 发现纯化原肌球蛋白经7k g y 辐照处理 后出现明显降解 但抗原性无变化 经1 0k e y 辐照处理后几乎完全降解 抗原性降低 相 对于其他方法 辐照在改性 灭酶 杀菌 保存食品的营养成分等方面更具有优势 以后 可能会是开发低过敏食品的重要手段 物理化学法中的化学法主要是利用化学试剂改变过敏原的一些化学属性来达到目的 比如大米的过敏蛋白中含有二硫键 用硫氧还原剂可以还原二硫键 从而使其过敏性消失 日本在生产低过敏大米方面已取得了一定的进展 目前研究较多的是采用酶法来降低过敏原性 其中蛋白酶的作用主要有 一是通过改 变过敏原的三级结构 或者通过断裂过敏原的化学键使其失去活性 来降低过敏性 二是 通过断裂酰胺键 降低过敏原的分子量 破坏抗原表位 从而降低致敏性 不同的蛋白酶 的作用位点不同 所以达到降低或消除过敏性的结果也不相同 s h i m a k u r a 等 l5 j 用胰蛋白 酶等3 种蛋白酶对虾蟹加工品进行酶解处理 发现酶解能降低其过敏原性 h o n g 等 l6 用 胃蛋白酶对花生进行酶解 发现酶解能消除其i g e 反应 虽然大量的研究证明酶技术能降 低过敏原性 但是酶处理大多会产生苦味肽影响食品的风味 随着酶技术的发展和酶制剂 的广泛应用 筛选高效的复合酶和特异性酶对酶解进行优化 将是开发低过敏性水产食品 的发展方向 1 5 水产品中的过敏原 在联合国粮农组织提出的8 大类常见致敏食品中 水产品就占2 类 甲壳类动物及其 制品和鱼类及其制品 在过去的3 0 年来 大量的水产过敏原被发现 其中 主要有鱼类 小清蛋白 p a r v a l b u m i n p a v 和甲壳类的原肌球蛋白 t r o p o m y o s i n t m 和精氨酸激酶 h r g i n i n ek i n 嬲e 等 鳕鱼 g a d u sc a l l a r i a s 是鱼类中研究最透彻的一种 它的主要过敏原命名为g a dc1 这个小清蛋白早在3 0 年前就被a s a 和e l s a y e d 等人 r 卜1 9 发现 是最早的经纯化 性质分析 和测序的过敏原之一 随后 其他的鱼类 大西洋鲑鱼 鲭鱼 鲤鱼 也被证实主要的过 敏原是小清蛋白 2 0 2 2 它能引起l e e 介导的过敏反应 小清蛋白是一种c a 2 结合型水溶性 蛋白 具有较小的分子量 1 2 k d a 左右 以及酸性等电点 研究认为小清蛋白在肌肉组织 的松弛上起着重要的作用 2 3 2 4 并且不同鱼种中小清蛋白的结构具很高的同源性 1 9 篡差太堂亟 堂僮论塞丞主过熟愿的撞越置肠速澄化 近十几年来 对于甲壳类 尤其是虾 的研究逐渐增多 不同的研究 2 5 2 7 都表明虾类 的过敏原是原肌球蛋白 随后的研究证明原肌球蛋白也是其他甲壳类动物 如龙虾 2 引 蟹 2 川 以及软体动物 如鱿鱼 3 0 1 牡蛎 3 贝类 3 2 1 文蛤吲 的主要致敏蛋白 原肌球蛋白是肌 原纤维中的一种结构蛋白 是细肌丝中与肌动蛋白的结合蛋白 主要作用是加强和稳定肌 动蛋白丝 抑制肌动蛋白与肌球蛋白结合 原肌球蛋白由两个相同的亚基团组成 每个亚 基呈a 螺旋 并与另一个亚基缠绕成超螺旋结构 它的分子量为3 5 3 8k d a t 3 4 等电点约 为p h4 5 3 5 1 是一种糖蛋白 3 6 且耐高温 具有很稳定的过敏性 研究表明 不同水产品 中的原肌球蛋白具有极高的相似性 其相互之间的交叉反应也很高1 3 2 1 2 0 0 3 年 y u 3 7 等用虾过敏患者的血清在斑节对虾 p e n a e u sm o n o d o n 中发现一种新 的过敏原 通过克隆 测序发现其与甲壳类中的精氨酸激酶具有很高的相似性 纯化所得 的酶具有精氨酸激酶的酶活性 并能引起i g e 介导的过敏反应 由此确定精氨酸激酶为甲 壳类动物的一种次要过敏原 其后 在蛾和尘螨 3 8 中也证明精氨酸激酶是一种过敏原 水产品中除了以上几种过敏蛋白外 还有一些其他的次要过敏原 比如鱼类中的胶原 蛋白 c o l l a g e n 3 9 1 6 体外模拟胃肠液消化研究 由于食物过敏已成为全世界关注的一个食品安全问题 而人们所涉及到的食物可谓种 类多样 尤其是随着转基因技术的发展 转基因农作物的种类逐年增加 转基因食品的安 全性也受到越来越多的关注 所以对于新蛋白的致敏性需要做出安全性评估 2 0 0 1 年 联 合国粮农组织和世界卫生组织 f a o w h o 对蛋白的致敏性评估提出了一些指标 包括蛋 白的来源 与已知过敏蛋白的序列相似性 体外消化稳定性 血清试验 动物模型 临床 试验等 柏 当然 蛋白的致敏性评估需要有多个评估指标来判断 而不仅仅取决于其中的 一个单因素 本文主要对体外消化稳定性这个指标的国内外研究现状进行论述 通常认为 种天然蛋白或变性蛋白要想保持其致敏性 该蛋白的i g e 结合位点所处 的氨基酸片段必须耐受食品加工以及体内消化 因为食物过敏反应的发生与药物过敏和呼 吸道致敏反应不同 致敏蛋白须经消化系统处理 低酸 胆盐 蛋白酶水解等 到达肠粘 膜被吸收后才能发生免疫反应 因此体外模拟胃肠液消化试验被认为是评估食物致敏性的 一项重要指标 8 为了更清楚过敏蛋白致敏性与消化稳定性之间是否存在必然的关系 很 多学者在这方面做了许多相关的研究 国内目前关于模拟胃肠液消化过敏蛋白的研究报道较少 中国疾控中心的李英华等1 4 l j 采用美国药典提供的模拟胃液和模拟肠液的配方对多种蛋白 牛b 乳球蛋白a 牛b 乳球 蛋白b 花生血凝素 鸡卵粘蛋白等 进行消化 建立体外模拟消化模型 j i a n g 等 4 n j 根据 引起过敏途径的不同将致敏蛋白分为食物渠道引起过敏和非食物渠道引起过敏两类 并采 用一种模拟胃液消化的计算模型来分析这两类致敏蛋白的消化稳定性 结果认为前一类致 4 塞羞盔堂亟 堂僮论塞丞主过熟厦的槿拯置题邃逍丝 敏蛋白相对更耐消化性 而后者相对不稳定 国外对这方面的研究较多 早在1 9 9 6 年 a s t w o o d 等 8 对花生 大豆 芥末 蛋 牛 奶等中常见过敏蛋白和非过敏蛋白进行模拟胃液 s i m u l a t e dg a s t r i cf l u i d s g f 消化试验 发现过敏蛋白具有很强的耐消化性或者会产生一些稳定的小分子量片段 而非过敏蛋白在 1 5 秒内就被完全降解 近几年 许多学者对过敏蛋白要比非过敏蛋白更耐消化性这个观点 提出了质疑 y a g a m i 等 4 3 对橡胶乳液 马铃薯以及5 种水果的蛋白进行模拟胃液 s g f 和模拟肠液 s i m u l a t e di n t e s t i n a lf l u i d s l f 消化 发现在s g f 中 大多数的胶乳和蔬菜食 物蛋白在很短的时间内被降解 许多过敏蛋白也在8r a i n 内就被降解 在s i f 中 虽然大 多数的蔬菜食物蛋自比较稳定 但是猕猴桃的过敏蛋白需1 6h 才几乎被完全降解 f u 等1 4 4 也对牛奶 大豆 花生 蛋等食物中的蛋白进行s g f s i f 试验 发现主要过敏蛋白并没 有比次要过敏蛋白更耐酶解 致敏蛋白也没有比非致敏蛋白具有更高的耐消化性 对于体外模拟消化过敏原的试验 目前主要是针对大豆 花生 坚果 水果 蔬菜等 农作物和鸡蛋 牛奶等的研究 关于水产品模拟消化试验相对比较少 s h i m a k a w a 等i l5 j 用 胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶 蛋白酶p 对几种经加工后的虾 蟹提取液进行酶解1 2h 发现 其致敏性几乎完全丧失 u n t e r s m a y r 等 4 5 对鳕鱼提取液做不同p h 值0 h1 2 5 5 0 的模拟 胃液消化试验 并对酶解产物做免疫检测 发现小清蛋白在p h1 2 5 2 5 时会被很快降解 其i g e 结合能力随着消化时间的延长而降低 对于其他鱼类及甲壳类动物的体外模拟消化 研究目前仍未见报道 1 7 本文研究的目的和意义 我国水产业发展迅猛 水产品已成为我国国民的主要食品之一 但近年来 出现了很 多关于水产品过敏的报道 我国疾控中心的调查显示水产品是引发我国国民过敏的最主要 致敏原之一 2 因此 对于水产品过敏蛋白的致敏机理的研究及开发低过敏性食品是一个 亟待解决的问题 但是 对于水产食品经摄入后在体内的消化稳定性以及消化与过敏性的 关系目前仍研究很少 而且各个实验室对于体外模拟消化试验的条件并没有一个统一的标 准 例如模拟胃液消化的胃酸p h 范围从1 2 3 5 不等 胃蛋白酶和蛋白的比率从 1 2 5 0 5 0 0 0 1 4 6 都有 其中有些条件不能反映人体生理的真实情况 并且很多研究没有注 明消化酶的酶活 这些条件的不统一不利于不同蛋白之间消化稳定性的比较 此外 有些 研究只是对过敏蛋白进行消化 而没有采用免疫学方法对消化后的产物进行免疫检测 因 为单从蛋白是否易降解来判断该蛋白是否是致敏蛋白是不正确的 锯缘青蟹 s c y t t as e r r a t a 俗名鲟 又称泥蟹或红树林蟹 属于海水蟹 自然分布于 温带 亚热带和热带的沿海近岸及河口温暖而盐度较低的水域 在我国广东 广西 福建 台湾 浙江 江苏等省沿海均有分布 尤以广东 福建 浙江3 省为多 锯缘青蟹因其肉 味鲜美 营养丰富 在我国具有很高的产销量 5 篡羞太堂亟 堂僮j 金塞 盔主过熟厘的搓拯置肠速消化 中华绒螯蟹 e r i o c h e i rs i s e n s i s 又称河蟹 毛蟹或大闸蟹 在世界可食用的2 0 来种 螃蟹中最负盛名的要数我国的中华绒螯蟹 中华绒螯蟹的自然分布区主要在亚洲北部 朝 鲜西部和中国 我国北自辽宁鸭绿江口 南至