（植物病理学专业论文）JERF3在转基因水稻中的功能分析.pdf

摘要 不利的环境条件如干旱和高盐严重影响了植物的生长发育和农作物的产量。 植物形成各种抗逆机制来适应环境。大量研究表明乙烯应答因子( e t h y l e n e r e s p o n s i v ef a c t o r , e r f ) 在植物生长发育、逆境胁迫应答等方面具有重要的调控功 能。我们以g c c - b o x 为b a i t ，利用酵母单杂交系统从番茄e d n a 表达文库中筛选到 e r f 类转录因子家族的一个新成员j e r f 3 ( j a s m o n a t ea n de t h y l e n er e s p o n s i v e f a c t o r3 ) 。j e r f 3 能结合乙烯，茉莉酸应答元件g c c 盒与渗透胁迫应答元件d r e ， 在番茄中主要应答乙烯，茉莉酸，高盐，低温或a b a 处理。在转基因烟草中过 表达j e r f 3 能通过激活下游功能基因的表达明显提高烟草的耐盐性。基于水稻 在我国农业生产和粮食安全中的重要地位和其较好的生物信息基础，本实验通过 培育j e r f 3 转基因水稻，在明确j e r f 3 在植物非生物胁迫中的功能的基础上，阐 明j e r f 3 可能参与的信号调控途径，为分子设计育种提供优良的抗性基因和材 料。 我们利用p c r 技术鉴定出阳性的转基因株系，再用t 2 代转基因水稻进行干 旱和p e g 处理，在2 5 m mp e g ( p e g 6 0 0 0 ) 和干旱逆境处理后，野生型水稻叶 片发生明显萎蔫，叶片向心卷曲，转基因株系只有少数叶片萎蔫。在正常生长状 态下，转基因水稻的脯氨酸含量、胞质总蛋白等渗透调节物质的含量明显高于野 生型。转基因水稻中渗透胁迫应答基因o s p 5 c s 和o s e n o l 基因的表达量明显增 多，并且冷应答基因0 s s p d s 2 和w c o r 4 1 3 - l i k e 基因的表达量也明显高于野生型， 此外，过表达j e r f 3 转基因水稻和野生型比较没有出现生长缓慢和明显的表型 改变。我们初步证明过表达的j e r f 3 提高了转基因水稻的渗透胁迫耐性。 关键词：j e r f 3 ；转基因水稻；非生物胁迫；信号转导 a b s t r a c t a l la d v e r s ee n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n ss u c h 蠲d r o u g h t 、h i g hs a l i n i t ya n ds oo n h a v eab a de f f e c to nt h eg r o w t ho fp l a n t sa n dt h ep r o d u c t i v i t yo fc r o p s p l a n t sh a v e a d a p t e dt oan u m b e ro fm e c h a n i s m st oc o p ew i t ha b i o t i cs t r e s s e s o u rl a bs c r e e n e d t h ee d n a e x p r e s s i v el i b r a r yo f t o m a t ob yy e a s to n e - h y b r i ds y s t e mu s i n gg c c b o xa s b a i ta n dg o ts e v e r a ln o v e lg e n e se n c o d i n ge t h y l e n er e s p o n s i v ef a c t o r s ( e r f ) ，o n eo f w h i c hh a sb e e nn a m e da sj e r f 3 ，w h i c hb i n d st oe t h y l e n e j ar e s p o n s i v eg c cb o x a n do s m o t i cs t r e s sr e s p o n s i v ed r ea n dm a i n l yr e s p o n d st oe t h y l e n e ，j a s m o 虹t e sa c i d ， s a l t , c o l d ，o ra b at r e a t m e n t o v e r e x p r e s s i o no fj e r f 3i nt r a n s g e n i ct o b a c c op l a n t s a c t i v a t e se x p r e s s i o no fd o w n s t r e a mg e n e st h e r e b ye n h a n c i n gs a l tt o l e r a n c e b e c a u s e o ft h ei m p o r t a n c eo fr i c ei na g r i c u l t u r a ld e v e l o p m e n ta n df o o ds a f e t ya n dh a v i n ga c l e a rg e n e t i cb a s i s ，t h i ss t u d yi st oa n a l y z et h ef u n c t i o n sa n dr e g u l a t o r yp a t h w a yo f j e r f 3i np l a n tr e s p o n s e st oa b i o t i cs t r e s s e s p o s i t i v et r a n s g e n i cr i c el i n e sw e l eu l t e r i o r l yi d e n t i f i e df r o md n al e v e la n d m r n al e v e lb yp c r j e r f 3r i c el i n e so ft 2g e n e r a t i o nw e l et r e a t e dd r o u g h ta n d o s m o t i cs t r e s s w i l dt y p er i c el e a v e se x h i b i to b v i o u sw i l t i n gu n d e r2 5 m mp e g o s m o t i cs t r e s sa n dd r o u g h ts t r e s s ，w h i l et h el e a v e so fo v e r e x p r e s s i n gj e r f 3r i c e d i s p l a yv e r ys l i g h tw i l t i n g t h eb i o c h e m i c a la n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h ec o n t e n to f p r o l i n ea n dc y t o p l a s m i cp r o t e i n si nt r a n s g e n i cl i n e su n d e rn o r m a lg r o w t hc o n d i t i o n s k r eh i g h e rt h a nt h e s ei nw i l dt y p er i c e o u rs t u d yi n d i c a t e dt h a tt h ee x p r e s s i o no f j e r f 3i nr i c ec o n s t i t u t i v e l ye n h a n c e st h ee x p r e s s i o no fo s m o t i c r e s p o n s i v eg e n e o s p 5 c s 、o s e n o la n do f c o l d r e s p o n s i v eg e n eo s s p d s 2 、w c o r 4 1 3 一l i k e i na d d i t i o n ， t h et r a n s g e n i cr i c ec o m p a r e dw i t hw te x h i b i t e dn e i t h e rg r o w t hi n h i b i t i o nn o rv i s i b l e p h e n o t y p i ca l t e r a t i o n sd e s p i t ec o n s t i t u t i v ee x p r e s s i o no ft h ej e r f 3 t h e s er e s u l t s s h o wt h a to v e r e x p r e s s i o no f j e r f 3e n h a n c e sd r o u g h tt o l e r a n c ei nt r a n s g e n i cr i c e k e yw o r d ：j e r f 3 ；t r a n s g e n i cr i c e ；a b i o t i es t r e s s ；s i g n a lp a t h w a y i i 英文缩略英文名称 a b a a b f a b r e b p b h l h b z i p c d n a c o r l5 a d r e e i n 3 e m s a e 船 e t j a j e r f 3 m r n a o s e n 0 1 o s p 5 c s 0 s s p d s 2 p d f l 2 p r p t i 4 s a s a r e t s i l 英文缩略表 a b s c i s i ca c i d a b a b i n d i n gf a c t o r a b a r e s p o n s i v ee l e m e n t b a s ep a i r b a s i ch e l i x l o o p h e l i x b a s i c d o m a i nl e u c i n ez i p p e r c o m p l e m e n t a r yd n a c o l d - r e g u l a t i o n l 5 d e h y d r a t i o n r e s p o n s i v ee l e m e n t e t h y l e n ei n s e n s i t i v e3 e l e c t r o p h o r e t i cm o b i l i t ys h i na s s a y e t h y l e n er e s p o n s i v ef a c t o r e t h y l e n e j a s m o n a t i ca c i d j a s m o n a t ea n de t h y l e n er e s p o n s i v ef a c t o r 3 m e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i d 【 o r y z qs a t i v a le n o l a s e l o r y z a s a t i v a l d e l t a l p y r r o l i n e - 5 - c a r b o x y l a t e s y n t h e t a s e o r y z a s a t i v a la m i n o p r o p y lt r a n s f e r a s e p a t h o g e nd e f e n s ef a c t o r l 2 p a t h o g e nr e l a t i o n p r o i n t e r a c t i n gp r o t e i n 4 s a l i c y l i ca c i d s a l i c y l i ca c i dr e s p o n s i v ee l e m e n t t o b a c c o s t r e s s - i n d u c e d g e n e l 中文名称 脱落酸 脱落酸结合因子 脱落酸应答元什 碱基对 碱性螺旋一环一螺旋 碱性亮氨酸拉链 互补d n a 低温调控1 5a 干旱应答元件 乙烯不敏感体3 电泳迁移率变动 乙烯应答元件 乙烯 茉莉酸 茉莉素乙烯应答因子 信使核糖核酸 水稻烯醇酶基因 水稻吡咯啉，5 一羧酸酯合成酶 水稻氨丙醇转移酶 病原物防卫网子1 2 病程相关 p t o 互作蛋白4 水杨酸 水杨酸应答元什 烟草胁迫诱导基因l 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：主上孔帆沙7 年f 月日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：剀莉时间：歹亏年月f 日 导师签名： 嵌侈襄 时间：们 年f 月日 第一章前言弟一早月| j 百 l 植物对逆境的应答反应 植物在整个生长过程中，必须面对各种各样的胁迫，如干旱、盐碱、低温以 及病虫害等。植物在感知到这些胁迫信号后，通过一系列信号途径的传递，最终 会诱导大量的胁迫相关功能基因表达，从而提高植物对逆境的抵抗能力。而这些 基因的表达往往离不开与其顺式作用元件相互作用的转录调节因子的调节。在对 从信号感知开始到最终的应答反应的信号转导途径的研究发现，植物对逆境胁迫 的应答反应是一个复杂的网络调控，不同的胁迫应答途径相互交错，同时不同的 胁迫应答途径又具有特异性，从而保证了植物生命活动的高效有序的进行。在这 些信号转导过程中植物激素、转录因子、以及转录因子与顺式作用元件的特异性 结合发挥了重要的作用。 1 1 环境胁迫和胁迫信号转导 胁迫在物理学上表示垂直作用在物体表面上的机械力，力可以使物体产生形 变。而在生物学中，胁迫的概念不同于i ； 者，后者表示一种生物的环境。这种生 物环境对一种植物可能造成胁迫但对另一种植物可能就变成有利的条件。生物学 上的胁迫是影响植物的生物系统的正常功能的一种有害的条件或外力【l 】。通常植 物受到的胁迫有非生物胁迫和生物胁迫两大类，前者包括低温、高温、高盐、干 旱、淹水、辐射、化学污染和氧化胁迫等等，后者包括微生物、害虫、动物等。 细胞膜作为一个屏障将细胞和周围的环境隔离开。细胞对环境的应答是以细胞外 分子和细胞膜上的蛋白互作开始的，这个细胞分子称为配体或激发子体的膜蛋白 称为受体。各种非生物和生物胁迫信号都可认为是植物细胞外的配体。当细胞外 信号分子和膜上的受体结合后，随着信号的传递产生第二信使。第二信使如磷酸 肌醇调节细胞内的钙离子浓度。细胞内的钙离子浓度的变化激活钙依赖蛋白钙 感应器，后者再和各自特异结合的蛋白互作，开始一系列的级联反应，将胁迫的 信号在细胞内放大。最后，胁迫应答的功能基因或者调控这些基因的转录因子被 表达，引起一系列的生理生化调节反应，提高植物对逆境的抵抗能力。这些基因 的表达产物有的直接参与保护细胞，还有一些参与了内源信号分子( 如植物激素) 的产生，这些信号分子又会引起新一轮的信号转导【2 】，这些信号转导途径最终使 植物作出生理的改变( 比如气孔关闭) 、基因表达的改变、分子修饰以及细胞程 序的改变。 1 2 环境胁迫诱导的基因及其表达调控 随着基因转录组学方面的研究深入大量基因被发现参与胁迫的应答和提高 植物的胁迫耐力。目前许多非生物胁迫诱导的相关基因已经克隆和研究【3 7 1 。 r a b b a n i 等利用c d n a 微阵列技术和r n a 杂交分析检测低温，干旱，高盐胁迫和 a b a 处理下水稻基因的表达情况p j 。而在干旱，低温和高盐胁迫处理下7 0 0 0 个拟 南芥基因中，2 9 9 个干旱诱导基因，5 4 个低温诱导基因和2 1 3 个高盐诱导基因被发 现1 9 】。在这些胁迫诱导的基因中，一部分通过产生的代谢蛋白直接保护植物的细 胞，另一部分则参与调节胁迫信号转导途径中相关基因的表达。因此，这些基因 的产物被分为两组。第一组为可能具有胁迫耐力功能的蛋白，如大分子保护因子， l e af l a t ee m b r y o g e n e s i sa b u n d a n t ) 蛋白，胞质蛋白，水通道蛋白、转运蛋白等膜 蛋白，脯氨酸、蔗糖等渗透调节剂合成的关键酶，以及过氧化氢酶等毒性降解蛋 白。其中一些渗透调节剂合成的关键酶，l e a 蛋白和毒性降解蛋白的基因在转基 因植物中过表达，同时表现出胁迫耐力的表型i 加1 1 1 。这些研究表明以上胁迫诱导 基因的产物具有胁迫耐性功能。第二组蛋白主要包括各种转录因子，除此之外还 包括一些蛋白激酶，蛋白磷酸化酶和调钙素结合蛋白等信号分子。胁迫诱导相关 的转录因子主要包括d r e 结合蛋白家族，e r f 家族，锌指家族，以及w r k y 家族， m y b 家族，b h l h 家族和b z i p ( b a s i c - d o m a i nl e u c i n ez i p p e r ) 家族等。它们参与各种 胁迫信号转导和调节具有胁迫耐力功能基因的表达，暗示不同转录因子在干旱、 低温、高盐胁迫信号转导途径中存在不同的转录调节机制【l2 1 。许多胁迫诱导的 基因被不同的转录因子协同或单独调控，从而可能形成一个基因表达调控网络， 这些胁迫相关的转录因子的功能研究将会提供更多关于基因调控网络的信息。通 过在转基因植物中过表达研究，一些转录因子的抗逆功能被确定i 。15 1 。 另外，研究发现在干旱处理后大量应答复水反应基因表达量提高，暗示这些 基因可能参与非生物胁迫的恢复过程【j “。这些胁迫恢复基因的产物功能不仅包 括胁迫受害恢复，而且参与细胞生长和伸长。复水诱导的脯氨酸脱氢酶基因 ( p r o d h ) 编码的蛋白能降解植物脱水时累积的脯氨酸【1 7 1 p r o d h 的启动子研究 发现一个重要的顺式作用元件a c t c a t ，它主要参与复水诱导基因的表达调控。 许多复水诱导基因的启动子中都包含了a c t c a t 元件。最近，根据其蛋白结合特 性，a c t c a t 结合蛋白被验证属于b z i p 转录因子1 1 8 l 。而在低温胁迫后的恢复过程 中，也可能存在一些被诱导的基因。通过转录组学等研究将有利于我们了解在非 2 生物胁迫和胁迫恢复过程中整个植物的反应。 通过检测拟南芥在干旱，高盐和低温胁迫下诱导基因的表达模式，有3 0 0 多 个基因被发现。在这些基因中，一半以上的干旱诱导基因也被高盐诱导，这暗示 在干旱和高盐信号转导途径存在交叉点。而干旱和低温诱导的基因中只有1 0 是 一样的1 9 】。根据在时间上的表达差异特点，这些被胁迫诱导的基因基本分为两类。 一类基因在受到干旱，高盐和低温胁迫后会快速和瞬间表达，并在几小时内达到 最大量，随后再降解。这类基因主要编码调节蛋白因子像锌指蛋白，b h l h 转录 因子，乙烯应答转录因子等。另一类基因在受到胁迫后缓慢地表达，在十多小时 内表达量慢慢地增加。这类基因大多数编码功能蛋白如l e a 蛋白，毒性降解蛋白， 渗透调节剂合成的关键酶。在另一方面，植物在干旱、高盐、低温等逆境胁迫下 体内的a b a 含量会明显增加，同时a b a 又会诱导许多抗逆境基因的表达。而a b a 应答基因根据其表达对a b a 的依赖性，基本可分为两类：( 1 ) a b a 依赖型 ( a b a - d e p e n d e n c e ) ，其表达依赖于内源a b a 的积累或外源a b a 的处理。( 2 ) a b a 非依赖型( a b a i n d e p e n d e n c e ) ，其表达除受a b a 的影响外，还受其它因子( 干旱、 低温等) 的影响，在无a b a 存在时对其它因子照常起反应，i i p a b a 的存在对其表 达并不是必须的。利用a b a 突变体，那些应答a b a 的低温和干旱的基因被研究 分析在a b a 缺失和a b a 不敏感的拟南芥突变体中，发现外源的a b a 诱导的一些 基因同时也能被干旱、高盐和低温诱导，说明这些基因的表达不依赖a b a ，但 可以应答外源的a b a ，这些基因有r d 2 9 a 、k i n l 、c o r l 5 a 等【1 9 l 。 1 3 植物激素 植物在受到环境胁迫时会合成一种或几种特异的植物激素，通过这些植物激 素调节相关基因的表达，改变植物的代谢方式，甚至调控植物的发育进程以适应 外界环境条件。脱落酸( a b a ) 是调节植物生长发育的一种多功能激素，它在 种子休眠、植物胚胎发育、促进气孔关闭和提高植物抗逆性，通过a b r e ， m y c m y b 顺式作用元件在非生物胁迫中发挥重要。研究发现干旱或高盐引起的 渗透胁迫信号至少通过两个途径传输：a b a 依赖和a b a 非依赖途径低温胁迫主 要通过a b a 非依赖途径。而在两种不同的路径中有一些相同的基因被诱导，说 明在逆境胁迫的适应反应中多种基因调控机制同时并存m 2 ”。一类新型的具有环 戊烷酮结构特点的植物激素茉莉酸( j a ) ，参与植物的各种生理功能，如：抑制 光合作用、促进呼吸作用、叶片衰老脱落和果实成熟、伤害、病原物侵入和渗透 胁迫等瞄j 。茉莉酸能调节植物防御和胁迫相关基因的表达。乙烯作为一种气体 激素参与植物各种发育调节和胁迫应答，包括种子的萌发、花和果实的凋亡、叶 片的脱落、果实的成熟、细胞的程序性死亡、对病原物侵入以及低温、干旱、盐 碱等生物和非生物胁迫的应答”- 2 6 1 人们发现用乙烯处理黑暗中萌发的种子后， 植物形态发生显著的变化，表现出顶端弯曲，胚轴和根的生长受到抑制等形态特 征，即“三重反应( t r i p l er e s p o n s e ) 9 9 。随着近几年的研究深入，乙烯被证实在植 物非生物胁迫特别是低温和渗透胁迫方面发挥重要的作用。利用拟南芥乙烯应答 突变体和乙烯信号途径中重要基因的研究，人们对乙烯信号转导途径有了更深入 的了解。 图卜1 ：乙烯信号转导模式图 f i 9 1 1 ：m o d e lo f t h ee t h y l e n es i g n a l i n gp a 1 w 2 1 图1 1 所示，首先，乙烯信号的受体，包括e t r i 、e t r 2 、e 1 n 4 、e r s l 和e r s 2 等，是一组类似细菌和酵母的组氨酸双组分蛋白激酶的跨膜受体蛋白1 2 ”。位于 乙烯受体蛋白下游的是一个类似m a p i c 姒( m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e k i n a s ek i n a s e ) 的蛋白激酶c t r i ，乙烯受体和c t r l 都是乙烯信号转导途径的负 调控因子 2 93 0 1 。在没有乙烯存在时，乙烯受体激活下游的c t r l ，c t r i 通过促分 裂原蛋白激酶途径( m a p kc a s c a d e ) 使下游的e i n 2 等乙烯信号传导途径成员处 于失活状态，从而关闭乙烯信号途径；在有乙烯存在时，乙烯通过与乙烯受体的 结合，使下游的c t r l 失去抑制下游传导途径的能力，乙烯信号途径处于激活状 态l 刈。近来的一些发现，一些逆境条件可以以不依赖乙烯受体的方式激活植物 4 的乙烯信号途径，如：盐胁迫、病害和水杨酸信号可以通过m a p k 途径调控乙烯 信号途径【3 13 2 1 。在乙烯信号途径中，e i n 3 e i l s 处于e i n 2 的下游，是乙烯信号途 径中的第一个转录因子，在调控其它下游转录因子和功能基因表达过程中具有重 要作用【3 3 3 4 j 。对拟南芥e i n 3 的研究发现，e i n 3 的稳定性受到与泛素降解系统相 关的f b o x 蛋白e b f l e b f 2 的调控【3 s 】，表明了泛素降解系统与乙烯信号传导途径 有密切关系。e i n 3 通过形成同源二聚体结合到e r f ( e t h y l e n er e s p o n s i v ef a c t o r ) 类转录因子e r f i 启动子中的顺式元件p e r f 上而激活e r f i 的表达。e r f 转录因子 调控着植物抗病相关基因p r 基因和调控植物形态发育基i 天i h l s l 等的表达【3 6 期。 2 抗逆相关转录因子 2 1 转录因子的结构功能 转录因子也称为反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中顺式作用元 件发生特异性作用的d n a 结合蛋白，通过它们之间以及与其它相关蛋白之间的 相互作用，激活或抑制转录。植物体内存在大量的转录因子，仅含有2 7 0 0 0 个基 因的拟南芥就有5 6 的基因是编码转录因子的。一个典型的植物转录因子往往含 有d n a 结合区( d n a - b i n d i n gd o m a i n ) 、转录激活域( a c t i v a t i o nd o m a i n ) 、寡聚 化位点( o l i g o m e d z a t i o ns i t e ) 、以及核定位信号区( n u c l e a rl o c m i z a t i o ns i g n a l ) 。 这些功能区域决定转录因子的功能和特性。有些转录因子中除了以上典型的功能 域外，还具有一些其他结构域，像r n a 结合域和g 蛋白亚基相似的结构域等f 3 8 】。 d n a 结合区是指转录因子识别d n a 顺式元件并与之直接结合的氨基酸序 列，其特定氨基酸序列决定转录因子与顺式作用元件识别及结合的特异性。通常 一种植物转录因子只含有一种类型的d n a 结合域，它可以单拷贝或多拷贝的形 式存在。例如，a p 2 类的转录因子通常含有两个拷贝的d n a 结合域，由一个保守 的序列连接起来；而e r f b p 类的转录因子只含有一个拷贝的d n a 结合域。植 物转录因子中比较典型的d n a 结合域有b z l p ( 碱性亮氨酸拉链) 结构域、锌指结构 域、m y c ( 碱性螺旋一环一螺旋) 结构域、m y b 结构域、a p 2 e r e b p 结构域、w r k y 结构域等。 同类转录因子的主要区别在于它们的转录调控结构域各不相同，转录调控结 构域包括转录激活结构域和转录抑制结构域两种，它们决定转录因子功能的差 异。近年来，高等植物转录因子的转录激活区研究的非常广泛转录因子转录激 活结构域一般在d n a 结合结构域以外，由3 0 1 0 0 个氨基酸组成。该结构域常见的 有4 种：酸性a 螺旋( a c i d i o - a h e l i x ) 。该结构域含有酸性氨基酸的保守序列，形 成带负电荷的螺旋区，如酵母活化因子g a i a 4 0 。富含谷氨酞胺结构域 ( g l u t a m i n e r i c hd o m a i n ) 。首先在s p i 中发现，其n 端有两个转录激活区，其中谷氨 酞胺( g i n ) 残基含量可达2 5 。富含脯氨酸结构域( p r o l i n e - r i c hd o m a i n ) ，例 如。c t f 家族的c 端区与转录激活有关，其脯氨酸残基可达2 0 3 0 。富含丝氨 酸苏氨酸结构域( s e r i n e t h r e o n i n e r i c hd o m a i n ) 。有的转录因子含有不止一个转录 激活调控区，可能是转录因子和其他的蛋白相互作用的区域。关于转录抑制结构 研究则比较缓慢，现在对其结构和作用机理还了解不深。它们对基因表达的抑制 或者通过和其他转录激活因子竞争基因启动子上的同一顺式作用元件，或者和其 他的转录因子结合来抑制该转录因子的激活域。阻止转录。 寡聚化位点是不同转录因子借以发生相互作用的功能域，它们的氨基酸序列 很保守。许多植物转录因子可由寡聚化区域形成同源或异源的寡聚物，通过这种 方式来影响转录因子对顺式元件的结合特性、结合能力及核定位性质。寡聚物 可由疏水螺旋、b 折叠以及疏水氨基酸残基问的互作来稳固。 转录因子要进入核中才发挥调控的基因的作用，因此它们一般都具有一 个富含精氨酸和赖氨酸残基的核定位信号区。在植物转录因子中。核定位信号在 序列特征、所处位置和数目方面的变化很大。有的转录因子具有多个拷贝的核定 位信号序列，它们各自在功能上保持独立，有时串联一起有时分散存在，如玉米中 的转录因子z m h o x 2 a 和2 b ，就含有8 个核定位序列【4 “。 2 2 转录因子作用的分子机理 2 2 1 转录因子的表达调控特征 转录因子根据表达的特点可分为两类，一类是组成型转录因子，无论在逆境还 是在正常状况下基因都表达；更多的一类转录因子的表达受到时间空间变化的调 节或直接被外界刺激所诱导，大多数转录因子都属这种类型 4 2 l 。组成型转录因子 的基因表达不受外界影响，但在无逆境条件下蛋白成惰性状态或活性很低，在逆境 条件下其空间构象发生改变或磷酸化，激发其和下游靶基因的顺式作用元件结合 活性，下游基因就会表达。在非组成型转录因子中，一些转录因子家族成员的表达 在时间空间或强度上各不同，也有一些成员同时表达，在功能上相互配合。而有一 大部分转录因子的表达受到干旱、低温、盐碱、病虫害等胁迫环境的诱导，然后 进一步启动其下游抗逆基因的表达，如e r f b p 家族、b z i p 蛋白等。这些胁迫诱导 的转录因子对植物逆境信号传导具有重要的意义。对于同一胁迫信号，同一类基 因家族不是所有成员都会作出应答，水杨酸和机械伤害都能诱导番茄p t i 4 ，而p t i 5 6 则都不应答阳】。 转录因子的表达和其他蛋白表达一样受到各个水平上的调控。首先，转录因 子自身也处于顺式作用元件的控制之下，如乙烯信号途径中的转录联级作用i 州。 还有一些转录因子的顺式元件还可有自身进行调控，e r f b p 家族成员调控含 g c c b o x 的下游基因，而烟草n t e r f s 2 的启动子区也含有一个c r c c b o x ，说明它可 能受到自身的调控。其次，转录后修饰对调节转录因子的活性起很重要的作用和 改变转录因子的功能。磷酸化和去磷酸化能够改变转录因子和d n a 的结合能力， 影响着一系列靶基因的表达也包括一些转录因子，如番茄中p t o 对p t i 4 的磷酸化可 以增加后者对顺式作用的结合能力【4 5 1 。一些转录因子可以通过去磷酸化活化因 此许多蛋白激酶和磷酸酶在调控转录因子的功能中发挥着重要的作用。 2 2 2 转录因子作用形式的复杂性 虽然每种转录因子有各自主要的功能，但是同一个胁迫环境可以有多个转录 因子的参与，同一个转录因子也可以参与多个胁迫环境。很少情况下是一种逆境 在单独起作用，低温或高温就不可避免地有水分胁迫，所以任何一个胁迫反应都可 能使许多转录因子表达。如干旱就可能诱导d r e b 类、a b r e 类和m y b 类转录因 子的同时表达，使许多下游抗性基因同时表达有的一种基因启动子中含有多个顺 式作用元件，如r d 2 9 a 同时存在d r e b 和a b r e 元件，r d 2 9 b 则同时含有一个 a b r e 元件和一个m y b 元件，任何一个转录因子顺式作用元件的缺失都会引起基 因表达的降低。大麦中受a b a 和干旱诱导的基因h v a 2 2 ，它含有至少3 个顺式作用 元件，高浓度的a b a 能诱导其表达，敲除其中一个元件使a b a 和干旱诱导应答降 低。因此，胁迫诱导的基因表达是受多重顺式作用元件顺序调控的。 综上所述，转录因子对许多胁迫因素作出应答，然后通过各种各样的方式对 下游的靶基因进行表达调控。植物中含有很多转录因子，在拟南芥基因组中约有 1 5 0 0 多种的编码转录因子的基因1 4 6 1 。有些转录因子如e r f 类是植物特有的，它们 一般具有大的转录因子家族。 植物处在各种各样的环境中经常遇到不利的生活条件，。为了能够抵抗这些 不利的环境并生存下来，植物进化出了学多针对逆境的基因表达模式，那些胁迫 相关的转录因子在这些过程中发挥着重要的作用。 2 3 植物中主要胁迫相关的转录因子 植物中有许多胁迫相关的转录因子家族，研究比较多的有四类家族：b z i p 、 w r k y 、a p 2 e r f b p 、m y b ，在植物对逆境条件的应答中起着极为重要的作用。 2 3 1b z i p 类转录因子 b z i p 转录因子广泛存在于真核生物中，都有一个可结合d n a 并形成二聚体的 结构域该结构域由两个保守区域：一个是由亮氨酸拉链序列组成，亮氨酸拉链形 成一个两亲性的q 螺旋，该结构为b z i p 蛋白与d n a 结合之前形成二聚体所需。一个 是富含约2 5 个碱性氨基酸残基的序列，它紧靠亮氨酸拉链结构域的n 末端，能与特 异的d n a 序列相互作用b z i p 类转录因子识别核心序列为a c g t 的顺式作用元 件。干旱、高盐或外源脱落酸能诱导内源脱落酸的合成，b z i p 类型的转录因子也 随之被激活，并结合在a b r e ( a b ar e s p o n s i v ee l e m e n t ) 上，如从拟南芥中分离出逆 境诱导的4 种b z i p 蛋白，分别称为a b f i ( a b ab i n d i n gf a c t o r l ) 、a b f 2 、a b f 3 、 a b f 4 。干旱、盐胁迫和a b a 处理能够使这4 种转录因子大量表达，然后转录因子 又可以诱导a b a 的过敏感以及其他表现型，使植物体内的糖积累，内源a b a 合成， 耐盐和耐旱等诸多抗性相关基因的表达增强【4 7 1 。 2 3 2w r k y 类转录因子 w r k y 类转录因子是植物特有的近期研究较多的新型锌指型转录因子，拟南 芥就含有1 0 0 多种w r k y 成员，含有一个或两个w r k y 结构域。它的结构域是一个 有6 0 个氨基酸的区域，n 端具有保守的氨基酸w r k y c _ , q i ( 序列和一个锌指结构 域。w r k y 的靶基因顺式作用元件是w 盒，许多植物防御反应相关的的启动子中 都含有这个元件。当受到病原体、防御信号和机械伤害时，w r k y 家族成员的表 达加强。像拟南，阳t w r k y s 、烟草n t w r k y s 就是在逆境下其作用的w r k y 转录因 子。w 盒及其相似序列往往在启动子区内成串排列，它们相互协同作用，应答 一系列的胁迫信号1 4 8 1 。 2 3 3m y b 转录因子 m y b 转录因子含有1 3 个由5 1 5 3 个氨基酸组成的呈螺旋转角一螺旋构象的 不完全重复序列，每个重复序列都含有3 个保守的色氨酸残基。m y b 是植物中最大 的转录因子家族，拟南芥中大约有1 8 0 个成员，玉米中大约有2 0 0 个成员。m y b 广泛 参与植物的各种反应，如次生代谢、细胞形态发生、植物生长的信号传导、生物 和非生物胁迫应答，但是参与逆境反应的只占很少一部分。m y b 结合基因启动子 中的顺式作用元件的核心序列为t a a c t g ；这些转录因子存在于高盐、低温和干 旱应答的a b a 依赖途径中，和下游靶基因启动子的顺式作用元件结合，诱导抗逆 基因的表达。拟南芥爿t m y b s 和烟草n t m y b s 就属于这类转录因子。 2 3 4a p 2 e r f b p 转录因子 a p 2 e r f 类是在植物中发现的一个转录因子大家族，它广泛的存在于多种植 物中。最初是从拟南介的a p e t a l a 2 蛋白中发现两个重复的d n a 结和域，故称 这类d n a 结构域为a p 2 结构域，把这类含两个重复a p 2 结构域的转录因子称为 a p 2 转录因子【删。后来又在烟草中发现四种与乙烯应答有关的d n a 结合蛋白 e r e b p ( e t h y l e n e r e s p o n s i v ee l e m e n t b i n d i n g p r o t e i n ) 。经序列比较发现这四个转 录因子都含有一个同a p 2 型d n a 结构域同源的d n a 结构域【5 0 1 ，因此把这两类转 录因子统称为e r f 或a p 2 e r e b p 转录因子。它们都含有由6 0 个左右氨基酸残基组 成的非常保守的d n a 结合区( 即e r f ) 且n 末段都含有起核定位作用的碱性氨 基酸序列，此碱性亲水区决定这类转录因子与不同的顺式作用元件的特异性识别 和结合。最近几年，r i e c h m a n n 等人分析了拟南芥基因组全序列，发现有1 4 4 个 a p 2 e r e b p 型转录因子，并根据含d n a 结合区的数目分为三个亚 族：a p 2 ( a p e t a l a 2 ) 亚族，有2 个a p 2 e r e b p 结构域，共有1 4 个成员，主要参与 调节细胞的生长发育；r a v 亚族，有2 个不同的d n a 结合结构域，a p 2 e r e b p 结 构域和b 3 结构域，共有6 个成员；以及e r e b p 亚族，仅含1 个a p 2 e r e b p 结构域， 共有1 2 4 个成员，主要参与调控植物对激素( 乙烯) 、病原、干旱、高盐和低温等 胁迫应答反应 s 1 1 而s a k u m a 等人分析拟南芥基因组全序列，发现有1 4 5 个 a p 2 e r e b p 型转录因子，并进一步将其分为5 个亚族：a p 2 亚族，r a v 亚族，d r e b 亚族，e r f 亚族和a l 0 7 9 3 4 9 1 5 2 1 下面的部分将对乙烯应答有关的d n a 结合蛋白 e r e b p 做详细介绍。 3e r f 转录因子在植物抗逆中的作用 3 1e r f 转录因子 e r f 转录因子又称乙烯应答件结合蛋白( e t h y l e n e r e s p o n s i v ee l e m e n tb i n d i n g p r o t e i n ，e r e b p ) 最先是从烟草中作为g c c b o x 结合蛋白分离出来的。e r f 蛋白均 具有一个高度保守的含有5 8 5 9 个氨基酸残基的d n a 结合结构域，而且n 末端都 含有起核定位作用的碱性氨基酸序列。现在已有大量的e r f 蛋白被人们从不同的 植物中分离出来，同时利用电泳迁移率变动实验( e m s a ) ，顺式作用元件突变 分析以及体内瞬时表达等手段分析它们的d 1 q a 结合特性。如拟南芥的a t e r f s 、 番茄的p t i 4 5 6 和烟草的e r f s 、长春花的c r c a l 2 等与g c c b o x 特异性结合。而 拟南芥中的c b f i 和d r e b i 2 证明能特异性结合d r e c r t 顺式作用元件。此外， 烟草的t s i l 既能与d r e c r t 特异性结合又能与g c c b o x 特异性结合，但对后者的 结合能力更强，对生物和非生物胁迫都有一定的耐受能力。同类转录因子的主要 9 区别在于转录调控区的作用是激活还是抑制。利用植物瞬时表达等分析，在e r f 类家族中，烟草的e r f 2 、e r f 4 和t s i l ，拟南芥的a t e r f i 、a t e r f 2 、a t e r f 5 、c b f l 和d r e b l ，番茄的p t i 4 等在转录调控中起到激活的作用1 5 3 - 5 5 】，其中e r f 2 转录激活 域位于羧基末端；e r f 4 的氨基末端和羧基末端具有转录激活功能。而像n t e r f 3 、 a t e r f 3 和a t e r f 4 则是转录的阻止蛋白。 3 2 和e r f 转录因子互作的顺式作用元件 e r f 转录因子的各个成员能以不同的方式在植物体中发挥调节作用。作为植 物特有的一大类转录因子，其作用的发挥离不开和顺式作用元件的特异作用。与 e r f 转录因子特异结合的顺式作用元件主要有d r e c - r e p a e t 和g c c b o x d r e 顺 式作用最早是在拟南芥干旱应答基因r d 2 9 的启动子中发现的，它的核心序列是 t a c c g a c a t 。另外，在拟南芥低温诱导基因c o r l 5 a 的启动子中发现了一个类似 序列t g g c c g a c ， 被称为c r e p a e t 元件【蜘。由于c c g a c 是两个元件都有的一个相同核心序列， 而且他们所调控的基因往往和干旱，高盐及低温胁迫有关，因此把这两种元件统 称为d r e c r e p a e t 。含有这一类顺式作用元件的基因多与植物非生物胁迫有关， 如拟南芥中的r d c o r l t i 系列的基因启动子中大多含有该类元件，d r e b c b f 类转录因子和它们的表达相关。所