（微生物学专业论文）微生物絮凝剂产生菌的筛选及培养条件的优化.pdf

沈阳农业 j 学碘i j 学位论文 摘要 微生物絮凝剂是微生物产生的高分子絮凝剂 它具有高效 安全 无毒 无二次污染等优点 具有广泛应用日口景 通过对土壤 活性污泥中的微生物絮凝剂产生菌的富集与分离 获得2 2 株优势絮凝剂产生菌 以0 2 的发酵液对4 9 l 高岭土悬浊液的絮凝效果测 定菌株絮凝活性进行复筛 菌株y 2 w 2 的絮凝活性均达到9 0 以上 因此将 这两株菌确定为高效微生物絮凝剂产生菌 并对其生物学特征 培养条件 最佳絮凝剂产生条件及应用效果等作进一步的研究 经过形态学 生理生化特征等方面的测定 初步鉴定y 2 为微球菌属 k t i c r o e o c e u s w 2 为节杆菌属 a r t h r o b a c t o t 通过对两个菌株絮凝活性的影响因素及菌株培养条件的研究发现 y 2 培养基配方为葡萄糖2 n a n 0 30 2 k 2 h p 0 40 6 m g s 0 40 0 1 时 絮凝率达9 3 8 9 w 2 培养剂配方为蔗糖2 蛋白胨0 3 k 2 h p 0 4 0 3 m g s 0 40 0 2 时 絮凝率达9 3 4 7 y 2 和w 2 菌株的最适培养温度为3 0 c 时 在此温度条件下 菌株所产生 的絮凝剂絮凝活性最大 y 2 培养条件为摇床转速1 5 0 r p m 接种量8 p h 7 5 时 絮凝率达9 2 7 8 w 2 培养条件为1 5 0 r p m 接种量1 0 p h 6 5 时 絮凝率达9 1 1 1 对y 2 和w 2 两个菌株的生长特性进行了研究 两菌株的生长量与絮凝 活性曲线基本上呈平行关系 在o 一5 0 h 时间段内 生长量和絮凝剂的絮凝活 性增加迅速 到6 0 h 达到最大 6 0 h 后 生长量和絮凝剂的絮凝活性变化均 不显著 并略有降低 由此表明 供试菌株产生的絮凝活性物质是在发酵过 程中合成的 而非菌体自溶产生的 两个菌株的絮凝活性分布情况研究结果 也证明 y 2 和w 2 这两个菌株产生的絮凝荆的絮凝活性物质大部分存在于 上清液中 洗涤后的菌体细胞的絮凝活性只有5 1 0 未接种的培养液几 摘要 乎没有絮凝活性 对y 2 和w 2 两菌株产生的絮凝剂进行热处理和酸碱处理 发现y 2 和w 2 两菌株产生的絮凝剂具有良好的热稳定性和酸碱稳定性 对y 2 和w 2 两个菌株产生的絮凝剂的进行了初步的应用试验 结果表明 y 2 菌株产生的絮凝剂对豆制品废水具有良好的除浊和脱色效果 关键词 微生物絮凝剂 分离筛选 絮凝活性 分离鉴定 弼 m 椒业人学坝f 学位论正 刖吾 水是生命的起源 是人类和生物赖以生存不可缺少的物质 是发展工业 的重要条件和农业的命脉 随着经济的快速发展和人口的增加 污水处理问 题同益严峻 基于物理 化学和生物学原理的各种污水处理工艺不断出现 如离子交换 吸附 化学氧化 电渗析和絮凝沉淀等 其中应用最普遍 成 本较低的处理方法是絮凝沉淀法 杨延梅和周富春 2 0 0 2 在絮凝沉淀法 处理废水中 絮凝剂的丌发选择是其关键技术之 就目前来看 微生物絮 凝剂不仅具有许多传统的絮凝剂无法具备的优点 同时还有使用安全 对人 体无害的优点 因此微生物絮凝剂方而的研究越来越受国内外的普遍关注 一 絮凝剂概述 絮凝剂是一类可使在液体中不易沉降的悬浮颗粒凝聚沉淀的物质 一般 可分为有机高分子絮凝剂 无机絮凝剂和微生物絮凝剂 d e r m li nwe ta l 1 9 9 9 有机高分子絮凝剂又分为有机合成的高分子絮凝剂 如聚丙烯酰胺 和天然高分子物质 如甲壳素 腐植酸 改良淀粉 在这些絮凝剂中有机 合成的高分子絮凝剂因其良好的絮凝效果和低廉的价格而被广泛应用 但是 人工合成的絮凝剂如 聚丙烯酰胺的单体有神经毒性和三致效应 致畸 致 癌 致突变 尹华 2 0 0 0 无机高分子絮凝剂大体上可以分为铝系和铁系 目前使用较多的有聚合硫酸铝 聚合氯化铝等几种 有关研究表明 铝托具 有毒性 常饮用以铝赫为絮凝剂的水 能引起老年性痴呆症 铁盐会造成处 理水中带颜色 高浓度的铁也会对人类健康和生态环境产生不利影响 k u r a n ere ta l 1 9 8 6 天然高分子絮凝剂 由于取自动植物 因而毒 性较低 有的絮凝效果较好 但成本过高 絮凝效果不理想 所以应用也很 有限 无机 有机和天然高分子絮凝剂存在的问题 使研究开发具有高絮凝 活性 安全 无毒和不造成二次污染的絮凝剂成为迫切而有意义的课题 面 微生物絮凝剂克服了无机絮凝剂和合成高分子絮凝剂的上述缺点 而又具有 前高 以上优点 因此人们丌始把研究目光转向微生物絮凝剂 人们对微生物絮凝剂的种类 特点 机理 絮凝条件 性质及应用等方 面进行了 系列工作 本文就以下几个方面作一简要介绍 二 微生物絮凝剂研究现状 一 微生物絮凝剂产生菌的种类 能产生絮凝剂的微生物有很多种类 细菌 放线菌 真菌以及藻类都可 以产生絮凝剂 陈晓畅等 2 0 0 3 至今发现具有絮凝性能的微生物多达数 十种 分布极为广泛 研究者利用不同的培养条件 测试标准从各种环境 如土壤 活性污泥 沉积物和废水中分离筛选絮凝剂产生菌 从这些微生物 中分离出的絮凝剂不仅可以处理废水和改进活性污泥的沉淀性能 还可以在 微生物发酵工业中进行微生物细胞和产物的分离 二 微生物絮凝剂的种类 微生物絮凝剂包括从微生物细胞壁提取的絮凝剂 微生物细胞代谢产 生的絮凝剂和直接利用微生物细胞的絮凝剂 1 利用微生物细胞壁提取物生产絮凝剂 微生物细胞是天然有机高分子絮凝剂的重要来源 藻类细胞壁的基质 主要由许多异多糖 脂类物质和部分蛋白质组成 目前已广泛用作絮凝剂 的褐藻酸就是一些褐藻细胞壁的成分 它是由d 一甘露糖醛酸和l 一葡萄糖 醛酸组成的多糖 另外褐色海藻细胞壁中古有一种由岩藻糖和硫酸根组成 的多糖 岩藻多糖也是重要絮凝剂 酵母菌细胞壁的葡聚糖 甘露聚糖 蛋白质及n 一乙酰葡萄糖胺等成分也可用作絮凝剂 丝状真菌的细胞壁多 糖除了纤维素 甘露聚糖和葡聚糖外 还有一种极其重要的多糖 几丁 质 几丁质是n 一乙酰一d 一氨基葡萄糖以1 3 1 4 糖苷键连成的不分支 链 它是分布于自然界中唯一的碱性同聚物 是一类能被生物合成和分解 不造成环境污染的天然高分子化合物 几丁质经过碱水解处理就产生了以 沈川农业人学f 啦j 学位论史 其正电性 高效无毒而备受环保工作者青昧的脱乙酰几丁质 脱乙酰几丁 质含有活性氨基和羟基 对许多微生物菌体及其它带负电荷粒子有极强的 絮凝能力 如果再配以一些含有羧基的其它有机高分子絮凝剂将取得更好 的效果 同时它还可作为一种助凝剂与其它阴离子型絮凝剂配合使用 加 大絮体 以上所述的细胞壁中可作絮凝剂的成分都含有亲水的活性基团 如氨基 羟基 羧基等 其絮凝机理同有机高分子絮凝剂的机理相同 即 利用其所带电荷或基团中和菌体表面电荷 或形成氢键 压缩双电层 并通 过高分子架桥形成网络 聚集沉降 2 利用微生物细胞代谢产物的絮凝剂 微生物细胞的代谢产物有的贮藏在细胞内 有的则分泌到细胞外 分 泌到细胞外的物质主要是细菌的荚膜和粘液质 除水外 它们的主要成分 是多糖及少量的多肽 蛋白质 脂类及其复合物 傅旭庆等 1 9 9 8 这些 物质在某种程度上都可用作絮凝剂 但最主要的还是多糖类 活性污泥中 常含有一种生枝动胶菌 z o o g l o e ar a m i g e 们 在生长后期向胞外分泌的多糖 能使细菌凝聚 而在生长旺盛期不分泌胞外多糖 细菌则浮游于液体中 有些微生物在其细胞内还可贮藏代谢产物 当然这些代谢产物必须通过细 胞破裂或其他方式溢出细胞才能发挥作用 黄秀梨 1 9 8 9 3 直接利用微生物细胞作絮凝剂 直接利用活细胞作絮凝剂有下列优点 1 免去了提取所需成本 2 可用 少量菌种接入发酵废液中使其繁殖 3 无二次污染 不足是被处理废液中必 须无妨碍菌体生长的因素 虽然从宏观上讲细菌细胞表面是带负电的 但 利用不同种微生物表面间的细微成分及结构差别可能导致絮凝 这大概就 是不同种微生物间絮凝的重要机理之 不同种微生物间其各自细胞表面 正负电荷之比不同 即其电负性大小不同 故不同种微生物细胞混合较同 种微生物间易絮凝 到目前为止 已报道的微生物产生的絮凝物质为糖蛋白 粘多糖 蛋白 前苦 质 纤维素等高分子化合物 其分子量一般在1 0 5 以上 从化学组成上来看 微生物絮凝剂主要是微 士物代谢产生的各种多聚糖类 蛋白质 或者是蛋白 质和糖类参与形成的高分子化合物 多聚糖中有的是由一种糖单体聚合而 成 而有的则是由多种精单体聚合而成的杂多糖类 此外 有的絮凝剂中还 有无机金属离子 如c a m g a 1 f e 2 等 三 微生物絮凝剂的特点 1 高效性 与现在常用的各类絮凝剂 如铁赫 铝赫和聚丙烯酰胺等相比 在同 等用量下 微生物絮凝剂对活性污泥的絮凝速度最大 而且絮凝沉淀比较 容易用滤布过滤 2 安全性 微生物絮凝剂的安全性也可得到保证 经小白鼠安全试验证明 微生 物絮凝剂完全能用于食品 医药等行业 3 无二次污染 微生物絮凝剂为微生物菌体或菌体外分泌的生物高分子物质 属于天 然有机高分子絮凝剂 因此它不会危害生物 也不会影响水处理效果 且 絮凝后的残渣可被生物降解 对环境无害 不会造成二次污染 4 应用范围广 微生物絮凝荆能絮凝处理的对象较广 有活性污泥 粉煤灰 果汁 饮用水 河底沉积物 细菌 酵母菌和各种生产废水等 如已研制成的微 生物絮凝剂n o c 1 是一红平红球菌 r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s 为主体 在 c a 2 存在的条件下 对大肠杆菌 酵母 泥浆水 河水底泥沉淀物 粉煤灰 活性炭分 水畜产废水 膨胀污泥 瓦厂废水 纸浆废水 染料废水等 有极好的絮凝和脱色效果 l e v y n 1 9 9 2 k u r a n e r 1 9 9 0 其它絮凝剂 则由于各自的特点而在某些应用领域受到限制 沈 农业大学倾j 学位论文 5 价格相对较低 主要从两方面考虑 微生物絮凝剂为生物菌体或有机高分子 较化学 絮凝剂便宜 微生物絮凝剂是靠生物发酵产生的 化学絮凝剂是人工合成 的 从生产所用原材利 生产工艺和能源消耗等方而考虑 微生物絮凝剂 也是经济的 这一点已为国内外普遍认同 微生物絮凝剂处理技术总费用 低于化学絮凝处理技术的处理费用 前者约为后者的2 3 6 投入量相对少 使用少量的微生物絮凝剂就能实现大面积污水的净化作用 等同用量 下 与先用各类絮凝剂相比 a s p e r g i l l u ss o j a e a j 7 0 0 2 产生的絮凝剂对活性 污泥的絮凝速度最大 而且絮凝沉淀较容易用滤布过滤 用聚丙烯酰胺 藻蛋白酸钠 4 0 0 p p m 以上的量就会使絮凝沉淀粘稠而不易过滤 张志强 2 0 0 3 由于微生物絮凝剂具有这些优点 因而具有广阔的丌发应用前景 已 成为近年来国内外研究丌发的热点 三 微生物絮凝剂的絮凝机理 在利用m b f 进行水处理过程中 往往由于对m b f 的絮凝机理不清楚 而导致不必要的资源浪费 例如 絮凝剂的投加量过多或相对较少而导致 处理效果不明显 或使用m b f 来处理带有同种电荷的污水从而导致絮凝剂 使用的浪费 只有清楚m b f 的絮凝机理才能更好的对症下药 微生物絮凝 剂是带有电荷的生物大分子 关于它的絮凝机理主要有以下三种 其中以 桥联机理学说最为人们接受 1 桥联作用 机理 絮凝剂借助离子键 氢键 同时结合了多个颗粒分子 因而在颗粒建 起了 中间桥梁 的作用 把这些颗粒连接在一起 从而使之形成网状结 构沉淀下来 有试验表明 絮凝剂絮凝膨润土过程时 通过测定等温线和 前击 z e t a 电位发现絮凝剂确实是以 桥联方式 絮凝的 l e v y n 1 9 9 2 2 电性中和 机理 水中胶体一般带有负电荷 当带有一定j 下电荷的链状宅物大分子絮凝 剂或其水解产物靠近这种胶粒时 将中和其表面的部分电荷 使胶体脱稳 从而使胶粒之阳j 胶粒与絮凝剂分子之阳j 易产生互相碰撞 通过分子州作 用力凝聚而沉降下来 许多试验中加入金属离子或调节p h 即可影响其絮凝 效果 主要是通过影响其带电性而起作用的 王镇 1 9 9 4 3 化学反应 机理 生物大分子中某些活性基团与被絮凝物质相应的基团发生了化学变 化 聚集成较大分子而沉淀下来 通过对生物大分子改性 处理 使其添 加或丧失某些活性基团 其絮凝活性就大受影响 有些学者认为这些絮凝 剂絮凝活性大部分依赖于活性基团 温度影响絮凝效果 主要通过影响其 化学基团活性从而影响其化学反应 傅旭庆 1 9 9 8 邵青 2 0 0 0 四 影晌微生物絮凝剂产生及絮凝能力的因素 1 影响微生物絮凝剂产生的因素 影响微生物絮凝剂产生的因素包括培养基成分 碳源 氮源 无机离 子 水 生长因子及其他物质 操作条件 培养基p h 值 培养温度 通 气量 培养时间等 不同微生物产生絮凝剂的碳源 氮源 培养基p h 值 培养温度 通气量等也各不相同 一般来说 营养丰富的培养基有利于絮凝剂的产生 但各絮凝剂的产 生菌之削的营养要求差别很大 培养基的初始p h 对絮凝的产生也有影响 过酸或过碱均不利于絮凝剂的产生 最适p h 一般为中性偏碱 红平红球菌 的最适p h 值为9 5 王镇等人的研究还显示出菌株产絮凝剂最佳p h 值与 其生长最适p h 略有差异 培养温度对微生物产絮凝剂也有影响 不同絮凝 剂产生菌有各自最适的培养温度 红平红球菌最适生长及产絮凝剂的温度 沈m 农业人学倾i 辟 位论文 为3 0 c 通气量也会影响到絮凝剂的产生 通过曝气对红平红球菌细胞生 长影响不大 但絮凝剂的产量却大为减少 王镇等对四株絮凝剂产生菌进 行了通气量影响试验 发现培养后期减少通气量有益于多糖类絮凝剂的产 生 而不利于部分核酸类絮凝剂产生菌产絮凝剂 但也有些菌产絮凝剂的 能力不受通气量的影响 程金平 2 0 0 3 许多研究表明 许多微生物絮凝剂产生菌的产絮凝剂与细菌的生长和 代谢活动有关 拟青霉s p i 1 随着菌丝体的生长 发酵液具有絮凝能力并 出现絮凝剂的积累 在培养5 天后达到最大值 并保持稳定 协腹产碱杆 菌发酵液的絮凝能力在前三天持续上升 并在剩卜的培养时期内保持稳定 这些结果表明 对数生长期的后期和稳定期的初期是收获絮凝剂的最佳时 期 因为絮凝剂的生产菌在超过这个时期将减慢甚至减少絮凝剂的产生 菌生长量与絮凝剂的量及所表现出的絮凝活性有很好的相关性 然而并不 是所有的絮凝剂产生菌都遵循这个规律 如菌s t r e p t o m y c e sg r i s e u s 在菌体 生长的衰亡期开始大量生产絮凝剂 可能是由于在不同的微生物絮凝剂的 合成代谢途径或分泌途径是不同的 微生物产生的絮凝剂在发酵液中和细 胞表面的分配随菌的不同而不同 对于拟青霉菌a j 7 0 0 2 拟青霉菌a j 7 3 6 0 等 絮凝剂主要分稚于细胞表面 而假单胞菌a j 2 0 8 4 假单胞菌a j 2 1 1 6 假单胞菌a j 9 0 2 2 等 絮凝剂则均匀分布于发酵液和细胞表面 2 影响微生物絮凝剂絮凝能力的因素 影响微生物絮凝剂絮凝能力的因素也很多 主要包括絮凝剂的分子结 构 分子量 投加剂量 温度 p h 值和无机金属离子等 一般来说 有线性结构的大分子絮凝剂的絮凝效果较好 如果分子结 构是交联或支链结构 其絮凝效果就较差 微生物絮凝剂的分子量大小对 其絮凝活性非常重要 分子量越大 活性位点越多 絮凝效率越高 另外 絮凝剂产生菌处于培养后期 细胞表面疏水性增强 产生的絮凝剂活性也 提高 陈宗琪 1 9 8 4 前高 絮凝剂般都有一个最佳投加剂量 过多或过少均会使絮凝效果下降 据分析 最佳投加量大约是固体颗粒表面吸附大分子化合物达到饱和时的 一半吸附量 因为此时大分子在固体颗粒上架桥机率最大 有些微生物絮凝剂的絮凝能力随着温度的变化而发生变化 这类絮凝 剂中往往含有蛋白质或多肽等对温度敏感的物质 在高温下易变性 空间 结构发生改变 造成活性位点结构变化 使某些活性基团不再与悬浮颗粒 结合 从而使絮凝活性降低 陶涛 1 9 9 9 红平红球菌n o c 1 产生的絮 凝剂是蛋白质 高温下可变性失活 在一个开放系统中1 0 0 c 处理1 5 m i n 可使其活性下降5 0 也有的絮凝剂对温度不敏感 如拟青霉s p i 1 产生 的絮凝剂活性在一段时间内不随温度改变而变化 这是由于该絮凝剂由三 部分组成 其蛋白质部分的作用是加大絮凝剂的分子量 高温处理蛋白质 变性但分子量不变 而其表现絮凝活性的主要部分聚己糖胺高温处理后结 构不改变 仍能以化学键的方式与被絮凝物结合 因此它的活性在一段时 间内不随温度变化而变化 絮凝剂对温度的敏感 与其它离子的存在也有 关系 如p s e u d o m o n a ss p c 1 2 0 产生的d n a 絮凝剂在有1 m n a c l 存在时 在1 0 0 c 的条件下加热 其絮凝活性没有发生改变 这是由于高浓度的无机 盐溶液可以提高d n a 的溶点 增加它的稳定性 陶涛 1 9 9 9 p h 值影响微生物絮凝剂及微生物和悬浮颗粒的结构和表面电荷的性质 和数量 因而影响絮凝剂和被絮凝物的相互作用 不同的絮凝剂对p h 的变 化敏感程度不同 同一种絮凝荆对不同的被絮凝物具有不同的最适p h 值 n a k a m u r a 用7 种微生物产生的絮凝剂进行的试验表明 在中性偏酸范围内 这些絮凝剂对酵母细胞絮凝效果好 尤其是p h 低于5 的范围内 p h 3 5 是 酵母细胞的等电点 因而絮凝剂在细胞表面电荷最低时 表现出最高絮凝 活性 而在碱性范围内对高岭土絮凝效果好 这些结果也证实了作为聚电 解质性质的絮凝剂是通过形成化学键而使微生物细胞或高岭土成为网状絮 凝物 沈m 农业人学坝i 学位论史 二价或三价离子的参与对于某些絮凝剂表现絮凝活性是必需的 这些 金属离子不仅降低悬浮物的运动电势 减少微生物絮凝剂和悬浮物间的排 斥力 降低反应的自由能 同时通过化学作用介导生物絮凝剂分子的各官 能团于悬浮物的吸附结合 促进絮凝作用的发生 五 微生物絮凝剂的研究与应用现状 1 微生物絮凝剂的研究现状 微生物絮凝剂 m i c r o b i a lf l o c c u l a n t 简称m b f 是利用现代生物技术 通过微生物发酵 抽提 精制从微生物或其分泌物中得到的一种具有生物分 解性和安全性的新型 高效 无毒的廉价的水处理剂 具有分泌絮凝剂能力 的微生物称为絮凝剂产生菌 最早的絮凝剂产生菌是1 9 3 5 年b u t l e r f i e l d 从活 性污泥中分离出来的 垓菌的培养液具有一定的絮凝能力 1 9 7 1 年 z a j i c 和k n e t t i n g 从煤油中分离出了一株棒状杆菌 该菌可以分泌对污水具有絮凝 作用的多聚物 1 9 7 5 年 j u n j i n a k a m u r a 等从霉菌 细菌 放线菌和酵母菌 等菌株中 最终分离筛选出1 9 株产絮凝剂的微生物 包括霉菌8 株 细菌5 株 放线菌5 株和酵母菌1 株 其中以酱油曲霉 a s p e r g i l m ss o j a e 产生的 絮凝剂a j 7 0 0 2 效果最好 n a k a m u r aj m i y a s h i r os 1 9 7 6 2 0 世纪八十 年代 日本的仓根隆一郎等从日本的旱田土壤中分离筛选到红平红球菌 r o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s 并将菌株产生的微生物絮凝剂命名为n o c 1 1 9 8 5 年 h i r o n k i t a k a g i 等对他们分离出的拟青霉菌 p a e c i t o m y c e ss p i 1 产生的微生物絮凝剂p f i o i 的特性研究表明他对各种微生物细胞均具有絮 凝作用 并且可以除去溶液中几乎所有的悬浮颗粒 包括有机物和无机物 如血红细胞 碳粉 纤维素 硅藻土等 由于微生物絮凝剂的非特异性絮凝 和沉淀性质 它在污水处理方面的巨大潜能引起人们的普遍重视 t a k a g ih k a d o w a k ik 1 9 8 5 1 9 8 6 年p y i c h i r ok u r a n e 等将n o c 1 用于畜产废水 膨 胀污泥和砖场生产废水等的处理 均取得了很好的效果 被认为是目前发现 前寿 的最好的一种微生物絮凝剂 k u r a n ere ta l 1 9 8 6 1 9 9 1 年 k u r a n e 从 土壤中分离出一株革兰氏阴性菌 产碱杆菌a l 2 0 1 垓菌在含有蔗糖的 培养基中生长并分泌絮凝剂 我国对于微生物絮凝剂的研究起步较晚 国内较早开展微生物絮凝剂研 究的单位有中国科学院成都生物研究所 大连理工大学 南丌大学和江苏微 生物研究所等 他们是在1 9 9 3 年才j f 始这方面的研究 目日i 微生物絮凝 剂的研究主要停留在试验室阶段 还未见大规模的工业应用 微生物絮凝剂的发展趋势是降低生产成本 以豆饼 水产加工废水和牛 血清等廉价原料或废物代替培养基中的氮源 可是成本下降7 0 8 0 而 且不影响絮凝剂的絮凝效果 美国已有多种牌号的 生物活液 销售 用以 快速清除下水道淤塞 水体富营养化和污泥膨胀等现象 这类 生物活液 一般由数十种微生物组成 其中不乏高絮凝活性菌株 能使膨胀的活性污泥 胶体迅速脱水形成絮凝沉降 或使富营养化水体中悬浮的污染物絮凝沉降 在其它微生物的配合下 迸一步得到生物降解 最终彻底矿化 目前开发各种絮凝剂产生菌是在试验室中以葡萄糖 果糖 蔗糖 半乳 糖 淀粉等作为有机碳源 以酵母浸出汁 牛肉膏 蛋白胨 酪蛋白氨基酸 等作为有机氮源 存在培养基成本高的缺点 严重的限制了微生物絮凝剂的 适用性 如 生产微生物絮凝剂n o c 1 的培养基成分为 1 l 培养基中岔有 果糖 或葡萄糖 果糖 1 0 9 k 2 h p 0 4 5 9 k h 2 p 0 4 2 9 m g s 0 4 7 h 2 0 n a c i o 1 9 酵母膏o s g 尿素o 5 9 初始p h 8 8 5 一般为8 因此寻找开发廉价的代 替品 甚至是高浓度的有机废物 作为絮凝剂产生菌的碳源和氮源以降低微 生物絮凝剂的生产成本 具有重要意义 l e v gne ta l 1 9 9 2 目前已经开 发出一些廉价的代替品 1 碳源 k u r a n e 考察了多种碳源对红平红球菌 r h o d o c o c c u se r y t h r o p o l i s n o c 一1 产生微生物絮凝剂的影响 结果发现乙醇不仅对菌细胞的生长和絮凝剂的产 沈m 农业大学坝f 学位论文 生都极为有效 而且在乙醇培养基中生长的絮凝剂的每单位细胞浓度的絮凝 活性是所有被考察的碳源中最高的 结果还表明 各种醇类包括甘油 丙醇 均有助于絮凝荆的产生 其中以乙醇最好 以乙醇为碳源产生的絮凝剂同以 果糖和葡萄糖为碳源产f 卜的絮凝剂一样 能絮凝高岭土 酸性土壤 碱性土 壤以及墨水等广范围的物质 而乙醇容易得到 容易处理且价格低廉 是较 为满意的碳源替代品 另外 k u r a n e 还发现罐头制品厂产生的含鱼血废物可 作为该菌产生絮凝剂的碳源 但是尚不清楚是鱼血中哪种成分起作用 另外 许多絮凝剂产生菌可降解自然界中或人工合成的高分子物质 如 红平红球菌可降解有机物降低b o d 的同时使固体悬物凝集沉淀 这是其它 类型絮凝剂无法比拟的 f u j i t a 等以低分子量的挥发性脂肪酸如乙酸 丙酸作为碳源对絮凝剂产 生菌c i t r o b a c t e r is p 进行培养 生产絮凝剂 以降低生产成本 因为这些物 质可以很方便的从各种有机废水中得到 以该方法得到的絮凝剂能够有效的 去除各种无机和有机悬浮物 如高蛉土 活性污泥和土壤 其中絮凝效果好 于p a c 而比p a a 稍差 他们还考察了以乙酸为唯一碳源批式培养 c i t r o b a c 阳r is p t k f 0 4 以提高絮凝剂的产量及降低生产的成本 2 氮源 k u r a n e 在他的一篇专利中 介绍了采用米糠 鱼肉和葵花籽粉作为培养 红平红球菌产生微生物絮凝荆的氮源 这样就使絮凝剂的成本大大降低了 另外 采用豆饼作有机氮源 具有与酵母膏相同的效果 但培养基价格可下 降2 3 以上 采用牛血液有良好的生产能力 但是牛血浓度对产量有较大的 影响 n a p o l i sce ta l 1 9 7 5 k u r a n e 还发现以麦芽根作为有机氮源具有非常出色的生产絮凝剂 n o c 1 的性能 在啤酒制造工程中 将发芽的大麦拿到焙干室中处理后 用 除根机得到麦芽根 这在啤酒制造过程中是大量产生的 这些麦芽根可以直 接应用于絮凝剂n o c 一1 的生产 前青 2 微生物絮凝剂的应用现状 1 用于畜产废水处理 畜产场废水中含有较高浓度的总有机碳 t o c 和总氮 丁n 是一类较难 处理的有机废水 采用合成高分子絮凝剂处理时效果不好 而用微生物絮凝 剂n o c l 处理则效果很好 处理l o m i n 后 上清液接近透明 其t o c 出 1 4 2 0 m g l 降为4 2 5 m g l t n 从4 2 0 m g l 降为2 1 5 m g l 废水的澄清度 o d 6 6 0 从1 5 7 降为0 8 5 张彤等 1 9 9 6 2 用于建筑材料加工废水处理 含有高悬浮物的建筑材料加工废水也是较难处理的一类废水 例如陶瓷 厂废水 主要包括坯体废水和釉药废水两种 前者主要含较多的粘土颗粒 后者除粘土颗粒外 还有相当数量的釉药 当添加2 0 m g l 左右的n o c l 处理5 r a i n 后 坯体废水的o d 值从原来的1 4 降低到o 0 4 3 釉药废水的o d 值从1 7 2 下降到o 3 5 浊度去除率分别为9 6 7 和9 7 9 可得到几乎透明 的上清液 李兆龙 1 9 9 1 3 用于发酵液和有机废水处理 油脂废水和乳化油废水中由于油脂呈乳化状态 与水的结合紧密 难于 将其分离出来 以棕榈酸乳化油废水为例 还没有哪种絮凝剂包括常用的无 机和有机絮凝剂 能有效的破乳 将油水分离开来 将a 1 a t u s 产生的微生物 絮凝剂投加到该废水 可以看到油滴状的悬浮物迅速升到液体表面 形成一 个油脂层 该油脂层可以很容易去除 r y j i c h i r ok u r a n e 1 9 8 6 在食品的 发酵行业中 由于发酵产品往往以溶解的状态存在 因此产品的提取首先要 将菌体及其它固悬物 胶体从发酵液中分离出来 由于常用的无机和有机絮 凝剂存在安全性方面的问题 其处理效果很难达到预期的目的 在该领域的 应用受到限制而其它类型的絮凝剂如天然高分子絮凝剂甲壳素等 由于成本 或其它原因 对发酵液的固液分离效果也不理想 而微生物絮凝剂 如t a k a g i 和l e e 等人分别筛选到的絮凝剂产生菌p a e c i d m y c es p 和a r c u a d e n d r o m 沈阳农业大学伽 i 学位论文 s p t s 一4 9 产生的絮凝剂能有效地将各种不同的微q i 物从悬液中分离出来 4 用于废水脱色 目前 对有色废水脱色还没有有效处理方法 我国采用物理化学方法 无机或合成高分子絮凝剂或生化处理 效果均不显著 尤其是对那些可溶性 色素很难处理 李兆龙 1 9 9 1 采用微生物絮凝剂n o c i 对含有可溶性着 色物质的黑墨水 面包酵母生产过程中排出的糖蜜废水 糖蜜发酵生产酒精 过程中精馏后的酒精发酵母液 造纸废水和染料废水等有色废水进行了试 验 废液经处理后变为无色透明 可见微生物絮凝剂具有很好的脱色性能 5 用于膨胀活性污泥处理 工业废水和生活污水在采用活性污泥法处理过程中 出于供养 溶解 氧 温度 口h 等条件发生变化 引起丝状菌的过度生长 使活性污泥发生 膨胀 导致液面飘泥严重 泥水分离困难 影响出水水质及处理效果 若 添加微生物絮凝剂 促进活性污泥中的菌胶团絮凝 提高活性污泥的沉降 性能 抑制丝状真菌的过度生长即活性污泥膨胀 取得很好的效果 n o r i o s h i m i z i u 1 9 9 5 如甘草制药废水生化处理过程中形成的膨胀活性污泥 当在其中添加n o c t 后 消除了污泥的膨胀 恢复了活性污泥的沉降性能 6 用于重金属离子脱除 在工业废水中 含重金属离子的废水占有相当大的比重 这些废水中的 重金属离子如c r 3 十 c u 2 h 9 2 c d n i 2 等是对生奄环境危害极大的 类污染物 引起进入环境后参与食物链并最终在生物体内积累 破坏生物体 正常生理代谢活动 危害人体健康 研究表明有的微生物 如啤酒酵母以及 真菌 细菌等 对重金属有一定的耐受性 而且能去除水中的重会属离子 张 彤等 1 9 9 6 利用生物体作为吸附剂进行废水处理回收重金属 可以直接 利用发酵工业微生物残渣及活性污泥 此方法不仅可以降低生产吸附剂的费 用 而且减少了发酵工业生物残渣的处理费用 且具有较好的经济效益 生 物吸附重金属是一个新的研究领域 它以其新颖 独特的优势受到越来越广 前击 泛的重视 小结 微生物絮凝剂高效 安全 不污染环境 在医药 食品加工 发酵处理 污水处理等领域有很大的应用潜力 但目前对其研究还停留在微生物絮凝剂 产生菌的分离筛选方面 还未能大规模应用于污水处理上 微生物絮凝剂是 当今 种最具希望的絮凝剂 它有着广泛的应用前景 今后微生物絮凝剂的 研究将主要集中于以下几个方面 1 分离和筛选出针对不同废水具有高效絮凝活性的菌种 利用现代生 物技术 分析出控制絮凝剂产生的基因 建立微生物絮凝剂的基因库并利用 基因控制技术 将其导入容易获取的微生物的细胞内使其大量表达 以满足 人们对微生物絮凝剂的需求 2 把m b f 作为产品来开发 实现其工业化的生产 开发出与微生物絮 凝剂处理废水相配合的高效反应器 优化工艺条件 降低投资和运行成本 提高处理效率 3 研究m b f 与其它絮凝剂的配合使用 使其优势互补 从而提高絮凝 效率和降低使用剂量 微生物絮凝剂的特性和优势为水处理技术的发展展示了一个广阔的前 景 通过对微生物絮凝剂的深入系统的研究 微生物絮凝剂将会更广泛的应 用于生产实践 三 本研究目的和意义 污水处理技术的不断发展和工程应用已经成为维系社会经济可持续发 展的必要组成部分 随着水资源和水污染形势的日趋严峻 水处理技术开始 走向了以资源综合利用为背景的历程 基于物理 化学和生物原理的各种污 水处理工艺不断出现 其中生物处理技术的应用最为广泛 已经成为城市污 水和有机工业废水处理的主流工艺 但是随着污水水质的复杂化和更多难降 沈 农业人学坝i j 学位论史 解物的出现 传统的污水处理工艺及方法已很难满足现代污水处理要求 絮凝剂是一类可使液体中不易沉降的悬浮颗粒凝聚沉淀的物质 它是絮 凝沉淀法处理水和废水的必不可少的药剂 一般可分为无机絮凝剂 有机高 分子絮凝剂和微生物絮凝剂 在这些絮凝剂中有机合成的高分子絮凝剂因其 良好的絮凝效果和低廉的价格而被广泛的应用 但是人工合成的絮凝剂如聚 丙烯酰胺的单体有神经毒性和 三致 致畸 致癌 致突变 效应 无机 高分子絮凝剂大体上可以分为铝系和铁系 目前使用较多的有聚合硫酸铝 聚合氯化铝等几种 有关研究表明 铝盐具有毒性 长期饮用以铝盐为絮凝 剂的水 能引起老年性痴呆症 铁盐会造成处理水中带颜色 高浓度的铁也 会对人类健康和生态环境产生不利 微生物絮凝剂是利用现代生物技术 通过微生物发酵 抽提 精制从微 生物或其分泌物中得到的一种具有生物分解性和安全性的新型 高效 无毒 的廉价水处理荆 它高效 安全 无二次污染 可生物降解 所以微生物絮 凝剂方面的研究 在絮凝剂领域己越来越受到国内外的关注 本课题基于这一思想 在借鉴前人经验的基础上 通过对土壤和活性污 泥中微生物的富集分离 从中筛选出优良 高效 具有高絮凝活性的菌株 优化微生物絮凝剂产生菌的培养条件 为其在污水处理中的应用奠定基础 基于以上目的 本文主要从以下几方面进行了研究 1 土壤和活性污泥中微生物的富集分离纯化 2 通过对絮凝剂产生菌的初筛和复筛 获得高效的絮凝剂产生菌 3 对所筛选的絮凝剂产生菌进行分类地位的初步鉴定 4 微生物絮凝剂产生菌的最佳培养条件研究 包括培养基初始p h 值 通气 量 培养时间等 5 研究不同c n 源对絮凝剂产生的影响 优化培养基配方 6 所筛选的菌株产生的絮凝剂进行废水处理模拟试验 第一章微生物絮擞剂产生菌的分离 o 筛选 第一章微生物絮凝剂产生茵的分离与筛选 一 材料与方法 1 样品来源 样品来源 沈阳农 j p 大学蔬菜试验用土 植物园土 沈阳辉山乳品厂 的污水处理站活性污泥 土样采集 首先在选好的地点除去土表杂物 所采集的土样为0 l o c m 的土壤 采集后土样混合均匀 取2 0 0 2 5 0 9 装入无菌的塑料袋中 带回 试验室立即进行分离 2 培养基及试剂 1 富集培养基 张平 2 0 0 5 葡萄糖l o og 蛋白胨0 5 9 脲0 5 9 酵母膏0 5 9 n h 4 2 s 0 4 0 2 9 k h 2 p 0 4 2 9 k 2 h p 0 4 5 9 n a c i o i g m g s 0 4 7 h 2 0 0 2 9 水1 0 0 0 m l p h7 o 7 5 分装于2 5 0 m 1 的三角瓶中 每瓶l o o m l 1 2 1 灭菌2 0 m i n 2 分离培养基 牛肉膏蛋白胨培养基 牛肉膏3 o g 蛋白胨1 0 o g n a c l 5 o g 琼脂 2 0 0 9 水1 0 0 0 m l p h 7 2 7 4 分装于三角瓶 1 2 1 灭菌2 0 m i n 倒平 板 3 1 c a c i 溶液 称取i o f f 的c a c l 2 溶于l o o m 蒸馏水 4 6 0 目高蛉土 3 试验方法 1 微生物絮凝剂产生菌的富集 吸取l o m l 水样 或称取l o g 土样 接种于富集培养基中 3 0 c 摇床培 养7 d 然后用无菌吸管吸取富集培养液l o m l 移入另一个富集培养基中 继续培养7 d 后再吸取二次富集培养液1 0 m l 移入另一个富集培养液中 继 沈1 5 r 农业人学删j 学位论史 续培养7 d 2 微生物絮凝剂产生菌的分离 用无菌吸管吸取富集培养后的富集培养液1 m l 移入装有9 m 无菌水的 试管中 制成1 0 1 稀释液 再用无菌吸管吸取1 0 稀释液l m 移入另一装 有9 m i 无菌水的试管中 制成1 0 稀释液 以此类推分别制成i o 一 l o 4 1 0 1 0 6 的稀释液 然后用无菌吸管吸取o 1 m l o 1 0 一 1 0 6 三个稀释度 的菌液 接种到牛肉膏蛋白胨分离培养基上 用无菌玻璃刮铲涂匀 每个稀 释度三个重复 最后放到2 8 恒温培养室中培养1 2 d 观察分离培养基上 微生物的生长情况 最后选择在培养基上生长良好 表面光滑带粘性的细菌 单菌落 用接种环挑取少量菌体 转接到牛肉膏蛋白胨斜面培养基上 2 8 的培养室培养2 4 h 放于4 冰箱中保存 以用于进一步筛选 1 3 微生物絮凝剂产生菌的初筛 用上述培养7 2 小时的菌液4 滴 滴加到浓度为4 9 l 的6 0 目的高岭土 悬浊液中 目测观察絮凝现象 根据絮凝块大小和沉降速度进行初筛 4 微生物絮凝剂产生萄的复筛 初筛获得的菌株培养后 定量测定发酵液的絮凝活性 进行复筛 测 定方法 1 0 0 m 量筒中加入0 4 96 0 目高岭土 加8 0 m l 蒸馏水 5 m l1 c a c l 2 2 m l 发酵液 混合 加蒸馏水至1 0 0 m 调p h 至7 0 用磁力搅拌 器先快速搅拌 2 0 0 r m i n lr a i n 在转入慢速搅拌 8 0 r m i n 2m i n 静置 5 m i n 在紫外可见分光光度计为5 5 0 n m 处测定上相液的浊度 以不加发酵 液的上相液浊度为对照 通过浊度减少来确定絮凝程度 用絮凝率定量表 示絮凝活性 絮凝率公式如下 王镇 1 9 9 5 絮凝率 塑掣 1 0 0 a 对照上相液5 5 0 h m 处的光密度值 b 样品上相液5 5 0 n m 处的光密度值 第一帝微生柳絮凝剂产生菌的分离 筛选 二 结果与分析 1 微生物絮凝剂产生菌的富集分离 通过3 次连续富集培养 得到了不同来源样品的混浊培养液 况明样 品中的微生物在营养充足 条件适宜的情况下得到了大量的扩增 利用稀 释平板法对富集培养液中的微生物进行分离 结果得到了2 2 株优势菌株 根据培养基上生长的菌株的菌落形态 颜色 大小等特征 对它们进 行初步分类 经过富集培养后共得到微生物絮凝剂产生菌2 2 株 将这2 2 株菌作为进 步筛选的对象 并对它们进行编号 从以上分离结果可以看出自然界环境中具有大量的微生物絮凝剂产生 菌 这为微生物絮凝剂产生菌的研究提供了丰富的资源 但每一种微生物 絮凝剂产生菌的絮凝剂能力不同 因而还需进一步的筛选 2 微生物絮凝剂产生菌的初筛 通过初筛 分离得到的2 2 株菌的絮凝能力是不同的 其中y l y 3 y 5 y 6 y 9 y 1 0 y 1 3 w 4 w 5 w 6 进行絮凝试验时 絮凝块小 而且速度慢 y 2 y 4 y 7 y 8 y 1 l y 1 2 y 1 4 y 1 5 w 1 w 2 w 3 w 7 絮凝时絮凝块较 大 沉降速度快 絮凝效果比较好 这说明土壤中和活性污泥中具有絮凝 活性的菌株很多 但并不是所有絮凝剂产生菌都是高效絮凝产生菌 因而 还要进行进一步的筛选 通过复筛筛选出高效的絮凝剂产生菌 3 微生物絮凝剂产生菌的复筛 通过初筛 从2 2 株菌株中获得1 2 株絮凝活性较好的絮凝剂产生菌 再对1 2 株菌株进行复筛 这1 2 株菌的絮凝率都在8 0 呲a 上 絮凝效果都很 好 其中y 2 和w 2 的絮凝率达到9 0 以上 所以选择y 2 w 2 两株絮凝剂产 生菌作为迸一步的研究对象 三 结论与讨论 在自然界中具有絮凝活性的微生物种类很多 不论是土壤还是水体中 沈m 农业k 学f 幔i 学位论文 都含有大量的絮凝剂产生菌 为了获得高效的絮凝剂产生菌 本试验分别 以二 二壤和活性污泥作为絮凝剂产生菌的来源 另外 从微生物的种类上来 看 具有絮凝洒性的微生物也很多 包括部分真菌和人部分细菌 本试验 选择具有高絮凝活性的细菌作为研究对象 但由于样品中微生物的种类和 数量都很多 为了减少筛选的工作量 采用具有选择性的富集培养基对样 品中的进行富集培养 这样既可使样品中的絮凝剂产生菌处于优势 又淘 汰了大部分其它菌株 大大减少了工作量 经过富集与分离 共分离到2 2 株菌株 通过初筛从中选择了1 2 株具 有较高絮凝活性的菌株进行复筛 根掘1 2 株菌株在相同条件下的絮凝活性 选择其中絮凝率在9 0 以上的y 2 w 2 两株菌作为进一步的研究对象 一章微乍物絮跚剂产生菌的初步箍定 第二章微生物絮凝剂产生菌的初步鉴定 一 材料与方法 一 供试菌株 本试验筛选的高絮凝活性菌株y 2 w 2 二 试剂 1 石碳酸复红染色液 a 液 碱性复红0 3 9 9 5 酒精 1 0 m l b 液 石炭酸5 o g蒸馏水 9 5 m l 将碱性复红在研钵中研磨后 逐渐加入9 5 酒精 继续研磨使之溶解 配成a 液 将石炭酸溶解在蒸馏水中 配成b 液 将a 液和b 液混合即成 2 结晶紫染色液 a 液 结晶紫2 5 99 5 酒精 2 5 m l b 液 革酸铵1 o g蒸馏水1 0 0 m l 将结晶紫在研钵中研磨后 加入9 5 酒精 继续研磨使之溶解 配成a 液 将草酸铵溶解在蒸馏水中 配成b 液 将a 液和b 液混合即成 3 碘液 碘化钾2 o g碘1 o g蒸馏水3 0 0 m l 先用少量 3 5 m 1 蒸馏水溶解碘化钾 再投入碘片 待碘全部溶解后 加水稀释至3 0 0 m l 4 番红染色液 将2 o g 蕃红溶于1 0 0 m 蒸馏水中即成 5 美兰染色液 美兰0 3 99 5 酒精3 0 m l蒸馏水 1 0 0 m 溶解美兰于酒精中 再加蒸馏水即成 保存于棕色瓶中 备用 沈m 农业人学岫i 学位论殳 6 格里斯试剂 a 磺胺0 5 93 0 9 6 醋酸i 5 0 m l b 一奈胺0 5 9 蒸馏水 5 0 m l 3 0 醋酸 1 5 0 m l 将磺胺溶于醋酸溶液中 保存在棕色瓶 即成a 液 将 一奈胺放入蒸 馏水中 煮沸后 缓缓加入3 0 9 6 的醋酸溶液 保存于棕色瓶中 即成b 液 用时取一滴a 液和b 液混合后再加入待测样品中 7 二苯胺试剂 二苯胺1 1 o g蒸馏水 2 0 m 浓硫酸l o o m l 将二苯胺溶于蒸馏水 徐徐加入浓硫酸 保存在棕色瓶中 备用 8 奈氏试剂 a 液 碘化钾1 0 o g蒸馏水l o o m l碘化汞2 0 o g b 液 氢氧化钾 2 0 o g蒸馏水l o o m 将碘化钾溶于蒸馏水中 再加入碘化汞 直到溶液饱和为止 即成a 液 将氢氧化钾溶于蒸馏水中 即成b 液 冷却后将其倒入a 液中 保存于棕色 瓶中 备用 三 试验方法 东秀珠和蔡妙英 2 0 0 1 1 培养性状的观察 1 平板菌落特征 将菌液稀释后滴在营养琼脂平板表面 然后用玻璃刮刀涂抹均匀 适温 培养3 7 d 后 选择分布疏密适中的单菌落 观察其形态 大小与形状 表 面 光滑 粗糙 皱纹 同心环 辐射状等 隆起 凸 凹 平 边缘 锯 齿状 波浪状 纤维状等 硬度 透明度等 2 液体培养特征 取少量菌体接入澄清的牛肉膏蛋白胨培养液中 静止培养1 7 d 观察培 养物的混浊 整个培养液里混浊状态 并均匀一致 沉淀 絮状 粘液状 鹕一章微生物絮龇剂产生菌的 j j 步裕定 颗粒状 块状等 结膜 液面成一层薄膜 有的沿试管壁长一圈 有无气 泡 气味等 2 个体形态的观察 1 简单染色 取1 8 2 4 h 幼龄菌种涂片 固定 用石炭酸复红染色i m i n 水洗 干燥 在油镜下观察 并照相 2 革兰氏染色 h u c k e r 修改法 取1 8 2 4 h 幼龄菌种涂片 固定 并以已知菌 会黄色葡萄球菌或青虫 杆菌 作为对照 先用结晶紫染色l m i n 水洗 风干 然后稀碘液媒染l mj n 水洗 风干 再用9 5 的酒精脱色2 0 3 0 s 立即用蒸馏水冲洗终止脱色至洗 下的液体无色为止 最后用番红液复染1 2 r a i n 水洗 风干 镜检观察 菌体呈蓝紫色者为革兰氏阳性 g 十 呈红色者为革兰氏阴性 g 一 3 芽孢染色 取培养三天的老龄菌种的浓菌液2 3 滴与大体等量的石炭酸复红混合于 试管中 置沸水浴中煮l o m i n 按常规涂片 涂