（材料科学与工程专业论文）荧光dna探针在微球表面的自组装及其结构变化.pdf

of 。? ，毒 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得云洼王些态堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 斗寄 签字同期幽，拜护，日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解丞洼王些太堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权丞洼王些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学 校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名。忒。年 剔醛轹 即蜊 签字日期：弘c o 年立月f 日签字日期：酗，矿年亏月，日 学位论文的主要创新点 一、本课题通过自组装的方法，利用微球表面功能基与纳米粒子 表面所带基团之间的氢键作用，将纳米粒子连接到聚合物微球表面， 形成了一种树莓状的复合物微球。并对其负载微球的稳定性做了研 究。 二、荧光d n a 探针作为d n a 检测的重要手段，本课题突破了 传统荧光探针的合成难点与局限，利用聚合物微球作为桥梁，借用固 相有机合成的方法限制了d n a 在纳米粒子( c d t e 量子点和a u 纳米 粒子) 上的自组装位点，从而达到精确控制探针内部能量供体( c d t e 量子点) 与能量受体( 金纳米粒子) 比例的目的。这是对荧光探针用 于d n a 检测的新的尝试。 摘要 荧光d n a 探针在研究基因相互作用、基因快速识别与疾病诊断领域有良好的 应用前景。传统方法的荧光d n a 探针存在两个问题，一个是探针结构的不确定性， 另一个是在制备过程中需要繁琐的提纯步骤。 本文针对目前荧光d n a 探针在组成结构、制备方法以及实际检测中所遇问 题，提出从表面带有功能基的聚合物微球入手，以半导体纳米晶( 量子点) 为能 量供体，金纳米粒子为能量受体，利用固相有机合成技术，使用表面具有功能基 的聚合物微球作为载体，通过自组装固载与切割的方法合成结构可控的d n a 探 针。 首先合成不同交联度，不同功能基的聚合物微球，修饰其表面功能基团以负 载c d t e 量子点。通过对微球功能基含量、负载量子点后荧光强度，并结合切割 微球表面量子点难易的情况的综合考察，选取交联度4 0 ：1 的p 从m 微球，交联 度4 0 ：l 的p n i p a m 微球，交联度5 ：l 的p 4 v p 微球作为固相有机载体连接氨基修 饰的d n a 。同样方法选取负载a u n p s 粒子的固相有机载体连接巯基修饰的d n a 。 并通过自组装固载与切割的方法合成d n a 探针。 与传统方法合成的d n a 探针相比，传统方法合成的d n a 探针结构存在不确定 性，而固相有机合成技术的d n a 探针，其结构是可控的，p a a m 和p n i p a m 作为固 相载体时供受体之问的比例为1 ：1 ，而p 4 v p 作为固相载体时供受体之间的比例 为1 ：2 。 聚合物微球作为固相载体的使用不但彻底避免了d n a 探针在传统合成方法 中繁琐的提纯步骤，极大的提高制备效率，解决了这类利用无机纳米粒子构建的 d n a 探针在结构上的不确定性。 关键词：聚合物微球；荧光共振能量转移；d n a 探针；固相有机合成 a b s t r a c t f l u o r e s c e n td n ap r o b eb a s e do nf l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ( f r e t ) w a sp r e p a r e db ys o l i d - p h a s eo r g a n i cs y n t h e s i sw h e nc d t eq u a n t u md o t s ( q d s ) w e r e a se n e r g yd o n o r sa n da un a n o p a r t i c l e s ( a u n p s ) w e r ea se n e r g y a c c e p t e r s t h em i c r o s p h e r e sw i t hh a dd i f f e r e n tf u n c t i o ng r o u po nt h e i rs u r f a c ew e r e p r o d u c e db yd i s t i l l a t i o np r e c i p i t a t i o np o l y m e r i z a t i o n ，a n dm ea a ，4 v p ，a a m ， ni p a mw e r ea st h em o n o m e rw i t ht h ed v ba n de g d m aw e r ea st h ec r o s s l i n k e r t h ec d t eq d sa n da u n p sw e r es e l f - a s s e m b l e d o nt h es u r f a c eo f m i c r o s p h e r e s ，a n d t h es t a b i l i t yo fq d sm o d i f i e d m i c r o s p h e r e s i nd i f f e r e n tp h i n d i c a t e dt h a tt h eq d sw e r ec u to f ff r o mp o l y ( d v b - c o 一4 v p ) m i c r o s p h e r e sw h e nt h e p h w a s13 ，w h i l et h e c l e a v a g e c o n d i t i o no f p o l y ( a a m c o - d v b ) a n d p o l y ( n i p a n c o d v b ) w e r e 11a n d9 10r e s p e c t i v e l y a n dt h ea u n p sc u tf r o m p o l y ( d v b c o 一4 v p ) m i c r o s p h e r e sw h e nt h ep hw a s11 , w h i l e t h ec l e a v a g ec o n d i c t i o n o fp o l y ( a a m c o d v b ) a n dp o l y ( n i p a n - c o d v b ) w e r e12a n d13r e s p e c t i v e l y b e c a u s eo ft h ee f f e c to ft h en u m b e ro ft h ef u n c t i o ng r o u p sa n dt h ef l u o r e s c e n t i n t e n s i t yo ft h ef l u o r e s c e n tm i c r o s p h e r e s ，t h em 0 1r a t i oo fm o n o m e r c r o s s l i n k e rw a s 1 ：5a st h e p o l y ( d v b c o - 4 v p ) ， 1 ：4 0a st h e p o l y ( a a m - c o d v b ) a n d p o l y ( n i p a n c o d v b ) m i c r o s p h e r e s t h el i n k a g eo fc d t eq d sw i t ho l i g o n u c l e o t i d e s ( c d t e d n a ) a n da u n p sw i t h c o m p l e m e n t a r ys i n 孚e s t r a n d e dd n a ( a u - d n a ) w a so nt h es o l i d p h a s e c a r r i e r s i n s t e a do fi na q u e o u ss o l u t i o n t h eh y b r i d i z a t i o no fc o m p l e m e n t a r yd o u b l es t r a n d e d d n a ( d s d n a ) b o n d e dt ot h eq d s a n da u n p s ( c d t e - d s d n a a u ) d e t e r m i n e dt h e f r e td i s t a n c eo fc d t eq d sa n da u n p s c o m p a r e dw i t ht h ef l u o r e s c e n c eo f c d t e d n ao nm i c r o s p h e r e s ，t h ef l u o r e s c e n c eo fc d t e - d s d n a a uc o n j u g a t e s ( d n a p r o b e s ) o nm i c r o s p h e r e sd e c r e a s e de x t r e m e l y w h i c h i n d i c a t e dt h a tt h ef r e t o c c u r r e db e t w e e nc d t eq d sa n da u n p s c o m p a r e dw i t ht h et r a d i t i o nd n ap r o b e ，t h es t r u c t u r eo ft h e t r a d i t i o nd n a p r o b ew a sn o ts t a b l e ，b u tt h es t r u c t u r eo fd n a p r o b ew h i c hp r e p a r e db ys o l i d - p h a s e o r g a n i c s y n t h e s i s w a s c o n t r o l l e d ， w h e nt h e p o l y ( a a m - c o d v b ) a n d p o l y ( n i p a n c o d v b ) w e r ea c t e da s t h ec a r r i e r ，t h er a t i oo fd o n o r sa n da c c e p t e r s w e r e1 ：1 w h e nt h ep o l y ( d v b - c o - 4 v p ) w e r ea c t e da sc a r t i e r ，t h er a t i oo f d o n o r sa n d a c c e p t e r sw e r e1 ：2 k e y w o r d s ：c d t eo d s tf l u o r e s c e n td n ap r o b e f r e t , m i c r o s p h e r e s s o l i d - p h a s e o r g a n i cs y n t h e s i s 目录 第一章前言1 1 1 国内外研究概况与发展趋势1 1 2f r e t 原理3 1 2 1 基本原理4 1 2 2f r e t 能量供受体对的选择5 1 2 3f r e t 效率的测量5 1 3 量子点的性质7 1 3 1 量子尺寸效应7 1 3 2 介电限域效应8 1 3 3 量子点所具有的荧光特性8 1 3 4 量子点所具备的优点8 1 3 5 量子点的共振能量转移在d n a 生物传感器中的应用9 1 4 纳米会在生物分析中的应用1 0 1 4 1 纳米金概况1 0 1 4 2 纳米金标记技术及其优点1 0 1 4 3 纳米金在d n a 识别与检测中的应用1 1 1 5 聚合物微球简介1 3 1 5 1 聚合物微球简介1 3 1 5 2 聚合物微球的特性1 3 课题提出1 4 第二章d n a 修饰负载在微球表面的c d t e 的合成与表征1 7 第一节实验部分1 7 1 1 实验试剂及其处理方法1 7 1 2 实验仪器1 8 1 3 实验所用d n a 序列1 8 1 4 实验所用缓冲液的配置1 8 第二节实验步骤1 8 2 1 不同功能基微球的制备( a a 、a a m 、n i p a m 、4 v p y ) 1 9 2 2c d t e 的制备及其提纯1 9 2 2 1c d t e 的合成1 9 2 2 2c d t e 量子点的提纯及浓度计算2 0 2 3c d t e 在微球表面的自组装2 0 2 4 从微球上切割c d t e 条件的探索2 0 2 5d n a 修饰负载在微球表面的c d t e 2 0 2 6 实验表征j + 2 0 2 6 1 微球表面功能基含量的测定2 0 2 6 2 微球及c d t e 纳米粒子粒径的表征及统计2 1 2 6 3 微球负载c d t e 量子点及其与d n a 连接后荧光变化的表征2 l 第三节结果与讨论2 2 3 1 回流时间对c d t e 量子点的影响2 2 3 2 聚合物微球的制备2 3 3 2 1 丙烯酸( a a ) 作为功能基单体的聚合物微球的制备2 3 3 2 24 一乙烯基吡啶( 4 v p ) 作为功能基单体的聚合物微球的制备2 7 3 2 3 丙烯酰胺( a a m ) 作为功能基单体的聚合物微球的制备2 9 3 2 4n 一异丙基丙烯酰胺( n i p a m ) 作为功能基单体的聚合物微球的制备3 1 3 3 不同微球负载c d t e 的表征3 2 3 3 1p o l y ( e g d m a c o a a ) 荧光微球、p o l y ( d v b - c o a a ) 荧光微球3 2 3 3 2p o l y ( e g d m a c o 一4 v p ) 荧光微球、p o l y ( d v b c o 一4 v p ) 荧光微球3 3 3 3 3p o l y ( d v b c o a a m ) 微球负载c d t e 荧光表征3 3 3 3 4p o l y ( d v b c o n i p a m ) 微球负载c d t e 荧光表征3 4 3 3 5e d c 对p o l y ( d v b c o a a m ) 、p o l y ( d v b c o n i p a m ) 微球连接c d t e 的 影响3 4 3 3 6 荧光微球的电镜表征3 5 3 4c d t e 在微球表面的切割3 6 3 5d n a 与荧光微球的链接3 7 本章小结3 8 第三章d n a 修饰负载在微球表面的a u n p s 的合成与表征3 9 第一节实验部分3 9 1 1 实验试剂及其处理方法3 9 1 2 实验仪器3 9 1 3 实验所用d n a 序列3 9 1 4 实验所用缓冲液的配置4 0 第二节实验步骤4 0 2 1 不同功能基微球的制备( 从、a a m 、n i p a m 、4 v p y ) 4 0 2 2 金纳米粒子的合成4 0 2 3 金纳米粒子在微球表面的自组装4 0 2 4a u 从微球表面的切割4 0 2 5 金纳米粒子与d n a 的连接4 l 第三节结果与讨论4 1 3 1a u 纳米粒子的表征4 l 3 1 1a u 纳米粒子t e m 表征4 l 3 1 2a u 纳米粒子紫外表征4 2 3 1 3 金纳米粒子的浓度测定4 2 3 2 微球表面负载a u 量子点的表征4 3 3 2 1 微球负载a u 纳米粒子t e m 表征4 3 3 2 2a u 纳米粒子在微球表面的切割4 4 3 4d n a 连接微球表面的a u 纳米粒子4 5 本章小结4 6 第四章固相有机载体制备探针及其结构变化4 7 第一节实验试剂与仪器4 7 1 1 实验试剂4 7 1 2 实验仪器4 7 第二节实验部分4 8 2 1 传统探针的制备4 8 2 1 1c d t e - d n a 的链接4 8 2 1 2a u n p s - d n a 的链接4 8 2 1 3 传统探针的制备4 8 2 2 固相有机合成的荧光d n a 的制备4 8 2 3 探针表征4 9 2 3 1 荧光表征4 9 2 3 2 电镜表征4 9 第三节结果与讨论5 0 3 1 传统探针的表征5 0 3 1 1 传统探针的荧光表征5 0 3 1 2e d c 对c d t e 的影响5 1 3 1 3 传统探针的电镜表征5 2 3 2 固相有机合成的荧光d n a 探针5 3 3 2 1p o l y ( d v b c o 一4 v p ) 微球作为固相载体的荧光d n a 探针5 3 3 2 1p o l y ( d v b - c o a a m ) 微球作为固相载体的荧光d n a 探针5 4 3 2 1p o l y ( d v b c o n i p a m ) 微球作为固相载体的荧光d n a 探针5 5 本章小结：5 6 第五章全文总结5 7 参考文献5 9 硕士期问发表论文情况6 5 致谢6 7 第一章前言 第一章前言 1 1 国内外研究概况与发展趋势 随着分子生物学、基因识别与检验、疾病诊断等领域的研究不断深入，对脱 氧核糖核酸( d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d ，d n a ) 的检测手段变得越来越重要。传统的 凝胶电泳法需要经过放射性标记、聚合酶链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ， p c r ) 、电泳等一系列操作过程，消耗时间长，劳动强度大。在这种情况下，以 w a t s o n c r i c k 碱基配对为基础的d n a 传感器应运而生。用d n a 传感器不仅省 去了放射性标记的危险性，而且避免了电泳操作的长时问消耗，因此近几年来受 到了广泛的关注。除了d n a 检测外，d n a 传感器还在环境监测、药物研究、法 医鉴定及食品检验等多方面显示出诱人的前景。基于荧光标记的检测体系近年来 在d n a 检测的应用已经获得认可，这类方法主要依赖于d n a 标记的供受体之 间的能量转移。 f 6 r s t e r t l j 于1 9 4 8 年针对荧光共振能量转移( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g y t r a n s f e r , f r e t ) 现象提出了偶极偶极相互作用产生能量转移的理论，即当能量供 体的荧光发射光谱与能量受体发色团的吸收光谱重叠，并且两者距离在1 0n m 以 内时，就会发生能量从供体到受体的非放射性转移，宏观上的表现是整个体系的 荧光强度下降或者消失。1 9 6 7 年，s t r y e r h a u g l a n d 提出能量转移可以作为光学 尺，用来测量1 0 6 0n l n 之间的距离【z j 。 对于一个成功的f r e t 体系，其能量供体和受体的选择至关重要，以往的研 究多采用传统有机染料作为供受体对，而有机染料在大多数情况下，由于它们的 激发光谱都较窄，所以很难同时激发多种组分，而其荧光光谱又较宽，分布不对 称，给区分不同探针分子的荧光带来困难，因此要同时检测多种组分较为困难p j 。 同时不同波长激发之间的重叠也会使各个能量给体和受体之间的能量转移变得 不明显，增加数据分析的复杂性f 4 】。此外，有机染料的光化学稳定性较差，光漂 白与光解作用使每个染料探针能够发出的荧光光子平均数量不可能太多，光解产 物又往往会对生物体产生不利的影响。因此，选择新的材料作为能量供受体构建 荧光检测体系，是这一领域的发展方向。 半导体纳米晶体( 亦称为量子点，q d s ) 拥有独特的光、电效应，因此成为 一类比较特殊的荧光纳米材料，在生物与医学领域吸引了大量的科学家进行探索 5 - 7 1 。量子点拥有许多的特性与功能，但最基本的是量子尺寸效应和表面效应。 大津l ：业大学硕十学位论文 量子尺寸效应是指当粒子尺寸下降到接近或小于某一值时( 激子波尔半径) ，费 米能级附近的电子能级由准连续变为分立能级的现象。半导体量子点的电子态由 体相材料的连续能带过渡到分立结构的能级，表现在光学吸收谱是从没有结构的 宽吸收过渡到具体结构的特征吸收。表面效应是指微粒表面原子与总原子数之比 随微粒的减小而急剧增大从而引起了微粒自身性质上发生改变。量子尺寸效应带 来的能级改变和能隙变宽使微粒的发射能量增加，光学吸收向短波长方向移动， 直观上表现为样品颜色的变化。例如c d s 微粒由黄色变为浅黄色，c d 3 p 2 微粒粒 径约1 5n n l 时，其颜色会从黑色变到红、橙、黄，最后到无刨引。量子点的这一 性质引发了人们的极大的兴趣，尤其是在基因表达、药物开发、医疗诊断等领域， 量子点的荧光特性促使其成为极具潜力的荧光材料。与传统染料相比，半导体量 子点作为新型荧光材料有以下几个显著的特点：荧光颜色强烈地依赖于量子点的 尺寸，激发谱带宽，不同颜色荧光可用同一光源同时激发，发射光谱窄而对称， 光稳定性好等 9 - 1 1 】。吉林大学杨柏等人对半导体量子点的合成以及与聚合物复合 等方面做了大量开拓性的工作，为半导体量子点应用提供了良好基础【1 2 14 1 。 o r d e n 等i d j 将四甲基罗丹明( t e t r a m e t h y l r h o d a m i n e ，t m r ) 标记的链霉亲和素 ( s t r e p t a v i d i n ) 与生物素化的牛血清白蛋白( b s a ) 特异性结合，用核壳型c d s e z n s 量子点标记b s a ，形成了以量子点作为能量供体，有机荧光物质t m r 作为能量 受体的共振能量转移体系，可以对生物素与链霉亲和素的结合进行检测。以4 0 0 n l i l 的光进行激发，对于量子点来说有很高的激发效率，而对于t m r 来说则几 乎不被激发。当以这个波长对连接体进行激发时，由于发生了共振能量转移， t m r 荧光强度显著增强。 m a t t o u s s i 等人【1 6 】提出了麦芽糖粘附蛋白( m b p ) 的麦芽糖生物传感器的设计 方案。把量子点( q d ) 修饰的m b p 和染料标记的p 坏糊精( p c d ) 作为f r e t 的 供体、受体对，尽管1 3 - c d 连接于m b p ，但由于天然的麦芽糖配体的强烈竞争， 导致了q d m b p 和 3 - c d 染料连接体的物理性分开。这种分开有效地减少了量 子点的淬灭，增强了荧光信号的数量。通过对设计的生物传感器的检测，发现生 物连接的量子点可以作为基于识别的传感器的f r e t 供体。并认为量子点不仅 作为有效的能量供体，还相当于生物传感器纳米组装的“脚手架”。最近，他们还 提供了q d 蛋白生物连接纳米组装的f r e t 分析，证明了通过对这种精确控制 来得到高效和精确的分析【1 7 】。并利用多个麦芽糖粘附蛋白( m b p ) 标记光敏性的 b i p s 来反向调节量子点的发射光谱，调节的效率可以通过改变b i p s 的数量来进 行控制【l 引。因此，光敏性开关的装置或生物传感器有望通过这样的装置来实现。 他们还利用荧光量子点连接抗体片段发展了溶液相纳米尺度传感器的组装，基于 f r e t 对液相环境的2 ，4 ，6 三硝基甲苯( t n t ) 进行了特定的检测，抗t n t 特定 第一章前言 抗体片段通过金属吸附作用连接到亲水的量子点上【1 9 】。 目前利用量子点作为能量供体构建基于f r e t 理论的d n a 探针的研究逐渐 增多，其原理在于，利用d n a 链段( 杂交双链d n a 或者单链d n a 分子信标) 控制供体与受体之间的距离，达到f r e t 的效果。当d n a 探针遇到互补的目标 d n a 时，由于杂交反应导致供受体之i 、日j 的距离拉开，探针的荧光强度有一定的 恢复( 反淬灭) 。通过检测探针荧光强度的变化，从而可以定性或定量的研究检 测体系中，目标d n a 的序列与数量。 o z k a n 等【2 0 j 以z n s 包裹的c d s e 量子点作为能量供体，4 ( 4 二甲基对胺基偶 氮苯) 苯甲酸( d a b c y l ) 为能量受体，利用单链d n a 构建了以分子信标( 灯塔探 针) 形式的f r e t 体系，当目标d n a 序列完全互补时，分子信标结构因杂交而 打开，供受体之间的距离拉大，荧光强度恢复可达分子信标自身的5 - 6 倍。但是 分子信标在杂交时存在不能完全与目标d n a 结合，稳定性较差，并且在合成过 程中荧光标记比较复杂的缺点。 c a d y 等【2 l 】以链霉亲和素改性的量子点( s t r e p t a v i d i n m o d i f i e dq u a n t u md o t s ， s m q d s ) 、羧基改性的量子点( c a r b o x y l m o d i f i e dq u a n t u md o t s c m q d s ) 两种改性 量子点作为供体；i o w ab l a c k 、d a b c y l 和1 4n l t l 的会纳米粒子( a u n p s ) 为供体， 分别构建了三种基于f r e t 规则的分子信标作为d n a 传感器。他们发现， s m q d s i o w ab l a c k 分子信标拥有最好的检测效果，而s m q d s a u n p s 分子信标 的检测效果一般。与o z k a n 等人的工作相矛盾的是，c m q d s d a b c y l 分子信 标几乎不能用于互补目标d n a 的检测，造成这种现象的原因可能在于他们所用 量子点的荧光最大发射峰不同有关，o z k a n 等人所用量子点的荧光最大发射峰为 4 9 0n m 2 0 1 ，而c a d y 等人所用量子点的荧光最大发射峰为5 2 5n n l 。这造成了受体 吸收光谱与供体发射光谱之间的重叠程度不同，从而导致检测效果不一致。 g u e r o m 等【2 2 】以核壳型c d s e z n s 量子点( 粒径2 8n l n ，最大荧光发射峰为 5 2 2n m ) 为能量供体，n 琥珀酰亚胺基碳酸酯( n h s ) 修饰的a u n p s 作为受体， 与分子信标的不同的是，g u e r o m 将它们分别与两段互补的单链d n a 相连接， 随后通过杂交构成双链的d n a 探针。当量子点与a u n p s 之间的距离为7 5a m 时，荧光粹灭效率达到5 0 。虽然c a d y 认为以单链d n a 构成的分子信标在检 测互补目标d n a 时的荧光恢复率较副2 ，但是以杂交双链d n a 构成的探针则 在供受体对的距离控制上占有优势，而且制备方法较为简单。 1 2f r e t 原理 所谓荧光共振能量转移是指电子激发能在适当的能量供体和能量受体对之 间的传递。荧光共振能量转移( f r e t ) 分析法由于其仪器简单、灵敏度高、所需样 天津i ：业人学硕+ 学位论文 品量少、分析速度快等优点，与色谱分离手段相结合，它己成为一种有效的痕量 及超痕量分析技术。1 9 4 8 年，f 6 r s t e r 对于这种实验现象提出了偶极偶极相互作 用产生能量转移的理论。据此，s t r y e r 和h a u g l a n d 在1 9 6 7 年提出，f r e t 可以 作为光学尺，用以测量1 0 6 0 n m 之间的距离。f r e t 因其对距离的敏感性，广 泛地被用于生物大分子结构、性质、反应机理以及定量分析等方面的研究。因此， 能量转移荧光分析非常适合于对环境、生物医学科学和临床化学等方面复杂、低 含量组分的分析，也是基因工程中的一种新手段。 1 2 1 基本原理 荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团( 供体 d o n o r ) 的发射光谱与另一个基团( 受体a c c e p t o r ) 的吸收光谱有一定的重叠， 当这两个荧光基团间的距离合适时( 一般小于1 0 n m ) ，就可观察到荧光能量由供 体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团 发射的荧光。简单地说，就是在供体基团的激发状态下由一对偶极子介导的能量 从供体向受体转移的过程，此过程没有光子的参与，所以是非辐射性的。给体分 子被激发后，当受体分子与给体分子相距一定距离，且给体和受体的基态及第一 电子激发态两者的振动能级间的能量差相互适应时，处于激发态的给体将把一部 分或全部能量转移给接受体，使受体被激发，在整个能量转移过程中，不涉及光 子的发射和重新吸收。如果受体荧光量子产率为零，则发生能量转移荧光熄灭； 如果受体也是一种荧光发射体，则呈现出受体的荧光，并造成次级荧光光谱的红 移，其过程如图1 1 所示。 姗6o a r 。5 凄 蜥6q 蝴， r 羚1 。5 反 图1 1 供受体间荧光共振能量转移示意图 荧光能量转移的速率，依赖于给体荧光发射光谱同受体吸收光谱的重叠度、给体 与受体转移偶极的相对方向和给体同受体之间的距离，用f 6 r s t e r 方程式表示【2 3 】： e = 击 式中：r 为供受间的距离。 为能量传递达到5 0 的距离，它依赖于供受体双方的光物理性质以及它们之 第一章前言 间的取向，用公式表示为： 氏= ( 8 7 9 x1 0 2 3 j x 2 q o n 。4 ) 压彳 式中k 2 ：和能量供体与受体跃迁相互取向有关的因子 n ：溶剂的折射率 q o ：无受体存在时能量供体的荧光量子产率 j ：光谱的重叠积分 在计算时可认为能量供体与受体i b j 的相互取向是无规则的，此时因子k 2 = 2 3 。 利用这个临界转移距离粕和实验测得的能量转移效率e 就可测出能量供体与受 体间的距离r 2 4 1 。 1 2 2f r e t 能量供受体对的选择 荧光物质要成为f r e t 的能量供受体对( 简称d a 对) ，必须满足以下几个 条件【2 5 】： a 供受体要相互比较接近( 1 1 0 n m ) 。 b 供体的发射光谱与受体的吸收光谱要重叠( 如图1 2 ) 。 c 供受体的跃迁偶极距要近乎平行。 只有在这样的条件下，供体的激发光才不会对受体直接产生干扰，可能获得足够 灵敏而准确的结果。 w a v e l e n g t h ( 九) 1 2 3f r e t 效率的测量 图1 - 2 供受体间的光谱重番示意图 当能量供体被激发后，可通过测定激发态供体寿命的缩短，供体稳态荧光强 度的减弱，受体稳态荧光强度的增强以及荧光偏振的变化来确定e ，但常用的是 天津一i ：业人学硕十学位论文 寿命测量法和荧光强度测量法两类方法。 激发态的能量供体可以通过辐射与非辐射方式失去能量。当有受体存在时， 多了一条非辐射退激的途径，故激发态能量供体的寿命缩短。使用测荧光寿命的 仪器可以很简单地得到有受体和无受体存在时的d 水寿命t ，利用公式【2 6 】 e ： ! 互 ： 肇 r d + k tf r l + k t 进而算得e 。这一方法的优点是极为准确，但是由于d 拳的寿命f 为d s 数量 级，对仪器的要求很高，所以此类仪器很昂贵，且不易维修和推广使用。 荧光强度测量方法就是通过分别测量供体在没有受体和有受体时的荧光强 度来计算f r e t 效率。 荧光强度测量法测量简单，对仪器设备要求低，因此是目前使用较为普遍的 测量方法。既可以通过测量供体的荧光强度，也可以通过测量受体的荧光强度来 获得f r e t 效率。当f r e t 发生时，供体荧光减弱，而受体荧光增强，如果能准 确测量受体增加的荧光强度和供体减少的荧光强度，就可以准确测量f r e t 效 率。通过供体荧光强度来获得f r e t 效率的具体测量表达式为 2 7 e ：鱼二生 f d 得出，其中f d a 为受体存在时供体的荧光强度，f d 为受体不存在时供体的 荧光强度。 虽然荧光强度测量法对仪器设备的要求不高，但是却受到如下问题的困扰： ( 1 ) 光谱重叠。为了获得灵敏的f r e t 效应，在选择时通常要求供体的发射光 谱尽量与受体的吸收光谱重叠，这样就会导致供体和受体的发射谱往往大部分重 叠在一起，很难将两者发射的荧光区分开来； ( 2 ) f r e t 和非f r e t 分量的重叠，即激发谱的重叠。供体发射的荧光由两部 分组成：激发光直接激发受体产生的非f r e t 分量和由于f r e t 效率产生的分量 完全重叠在一起。 ( 3 ) 浓度。在许多情况下，荧光基团浓度的准确定量是非常困难的，因此很难 保证不同时刻或者不同区域荧光强度的同一性。 通过f r e t 测量的距离分布的分辨率大约为l a ，低于此值的距离和分布便 不可分。若供体受体的距离太短或太长( 相对于r ) ，则荧光测量中就丢掉了距 离信息。当平均距离低于f 6 r s t e r 距离时，平均距离可以很好的精确测量。由于 f r e t 的时间是纳秒，因此可以测量慢过程。 第一章前言 1 3 量子点的性质 量子点的结构导致了它具有尺寸量子效应和介电限域效应【2 引，并由此派生出 量子点独特的发光特性。量子点由于粒径很小，电子和空穴被量子限域，连续能 带变成具有分子特性的分立能级结构，因此其光学行为与一些大分子( 如多环的 芳香烃) 很相似，可以发射荧光。由于光谱禁阻的影响，当这些半导体纳米粒子 的直径小于其玻尔直径( 一般小于l o n m ) 时，这些小的半导体纳米粒子就会表 现出特殊的物理和化学性质。 1 3 1 量子尺寸效应 量子剧2 9 1 是尺寸小于1 0 0 n m 的超微粒。在纳米尺度范围内，半导体纳米晶 体随着其粒径的减小，会呈现量子化效应，显示出特殊的光学和电学性质。量子 点的晶体颗粒越小，比表面积越大，分布于表面的原子就越多，吸收的光能也越 高，即存在量子尺寸效应，从而使其吸收带蓝移，荧光发射峰位也相应蓝移。通 常当半导体纳米粒子尺寸效应与其激子玻尔半径相近时，随着粒子尺寸的减小， 其相应的吸收光谱和荧光光谱发生蓝移。一些纳米半导体粒子所呈现的量子尺寸 效应可用下列公式来描述： 驯= f g r 习j + 等一竿- o 2 4 8 e ；, 式中e ( r ) 半导体纳米粒子的吸收带隙，r 为粒子半径， p = b 玎胪【毒+ 刮 为粒子的折合质量，其中i 如和m h + 分别为电子和空穴的有效质量，第二项 为量子限域能( 蓝移) ，第三项为电子一空穴对的库仑作用能( 红移) ， 露：嘉 为有效的里德伯量。由上式可以看出：随着粒子半径的增大，其吸收光谱发 天津j i ：业人学硕十学位论文 1 3 2 介电限域效应 随着粒径的不断减小，比表面积不断增加，颗粒表面的原子数目与处于粒子 内部的原子数目的比值增加，颗粒的性质受到表面状态的影响。半导体超微粒表 面上修饰某种介电常数较小的材料后，它们的光学性质与裸露的超微粒相比，发 生了较大变化，此种效应称为介电限域效应。当介电限域效应所引起的能量变化 大于由于尺寸量子效应所引起的变化时，超微粒的能级差将减小，反映到吸收光 谱上就表现为明显的红移现象。将半导体纳米晶体的表面包上一层能级差更大的 壳层，由于介电限域效应也会使得吸收光谱红移。 1 3 3 量子点所具有的荧光特性 由于尺寸量子效应和介电限域效应的影响，使得半导体纳米晶体显示出独特 的荧光特性。半导体纳米晶体的发光特性具有以下特点： ( 1 ) 半导体纳米晶体的激发波长的范围较宽，发射波长的范围较窄。 ( 2 ) 半导体纳米晶体具有很高的量子产率，核壳结构的半导体纳米晶体的 量子产率一般都在3 0 以上。 ( 3 ) 同一种组分的纳米材料，纳米晶体的粒径不同时，可以发出不同光。 用同一波长的光照射不同直径的纳米晶体即可获得不同波长的可见光。 1 3 4 量子点所具备的优点 量子点具有许多特别的光学特性【3 0 - 3 3 】： ( 1 ) 量子点的激发光波长范围很宽，这使得单个波长可激发所有的量子点， 这给生物学研究带来很大的方便。半导体纳米粒子的发射光谱覆盖从紫外到红外 区域。 ( 2 ) 量子点具有较大的斯托克斯位移和狭窄对称的荧光谱峰，半高峰宽( f u l l w i d t h sh a l fm a x ，f w h m ) 常常只有4 0 n m 或更小。这样就允许同时使用不同光 谱特征的量子点，而发射光谱不出现交叠，或只出现很少交叠，使所标记的生物 分子的荧光光谱易于区分和识别。 ( 3 ) 量子点比较稳定，荧光光谱几乎不受周围环境( 如溶剂、p h 值、温度 等) 的影响，它可以经受反复多次激发，量子点的发光寿命长，可采取时间分辨 技术来检测信号，这样可大幅度降低背景的强度，获得较高的信噪比。这为研究 细胞中生物分子之间长期的相互作用提供了有力工具。量子点的荧光强度是罗丹 明6 g 的2 0 倍，稳定性是它的1 0 0 倍，光谱线宽只有其三分之一。 第一章前言 1 3 5 量子点的共振能量转移在d n a 生物传感器中的应用 除了用于免疫分析和其他特异性结合分析外，应用共振能量转移原理，量子 点在生物传感器方面的研究更是方兴未艾，在这些传感器中都是以量子点作为能 量供体，以有机荧光染料作为能量受体。c l a p p 3 4 】等人将人工改造的并且保持结 合能力的麦芽糖结合蛋白( m a l t o s e b i n d i n gp r o t e i n ，m b p ) 与量子点不可逆静 电结合，花青染料( c y a n i n ed y e s ) 共价结合到m b p 上，形成q d m b p - c y 3 。在 连接到量子点上的m b p 保持一定数目的情况下，增加m b p c y 3 时，量子点荧光强 度随之减弱，c y 3 荧光强度相应增加，也就是说包围在量子点周围的能量受体越 多，光谱重叠越好，能量转移效率越高，在连接到量子点上的m b p - c y 3 数目一定 的