（遗传学专业论文）耐热邻苯二酚23双加氧酶的晶体结构及其诱变研究.pdf

复旦大擘博士学位论文 耐热邻苯二酚2 ，3 双加氟酶的晶体结构及其谤变研究 追传学研究所 萋涛 中文摘要 本论史所进行的研究工作和主要纬果包括以f 几个部分： 1 采用p c r 随机诱变方法，研究氨基酸置换对酬热邻苯二酚2 ，3 - 双加氧酶 ( t c 2 3 0 ) 性质的影响。，比较分析了突变体p r 0 2 2 8 s e r 和g l u 2 4 2 g l y 与野生型酶 的酶学性质。结果显示点突变p r 0 2 2 8 一s e r 或g l u 2 4 2 一g l y 并未改变酶的最适 反应温度( 均为6 0 ，) ；突变体p r 0 2 2 8 s e r ( k c a t k m = 48 9 0 0 1 1 0 0 t o o l s 。1 ) 以及突变体g l u 2 4 2 g l y ( k c a t k m = 5 8 8 o 0 1 1 0 6 t o o ! 。s 。) 的 催化能力与野生型酶( k c a t k m = 6 9 7 o 0 l i 0 6t o o l “s1 ) 相比有所f 降； 点突变p r 0 2 2 8 一s e r 大幅度降低了酶的热稳定性( t m 1 0 2 ) ，而点突 变o l u 2 4 2 - - g l y 对酶的热稳定性影响较小( a t m 一1 5 ) 。推测p r 0 2 2 8 对耐热邻苯二酚2 ，3 双加氧酶的热稳定性有重要贡献。 2 甲硒氨酸( s e m e t ) 多波长反常散射法( m a d ) 是国际上9 0 年代发展起来 的蛋白质晶体结构测定的新方法，该法得以实旌的关键一步是获得硒( s e ) 取代 ， 硫( s ) 的高纯蛋白质，并培养出s e 取代s 的蛋白质晶体。通过亚克隆方法，将 编码利热邻苯二酚2 ，3 双加氧酶f t c 2 3 0 ) 的基因p h e b 克隆至表达载体p r s e t 上，得到了高表达质粒p r s e t - p h e b ，并且将其转入m e t 缺陷的菌株b 8 3 4 d e 3 中。通过诱导表达和分离纯化得到了甲硒氨酸( s e m e t ) 置换甲硫氨酸( m e t ) 的 s e m e t t c 2 3 0 。经质谱测定发现t c 2 3 0 的所有7 个甲硫氨酸( m e t ) 全部都被甲 硒氨酸( s e m e t ) 所替代。在此基础上，采用汽相悬滴扩散法成功培养出适合于 x 射线衍射分析的s e m e t t c 2 3 0 蛋白质晶体，为应用m a d 方法解析t c 2 3 0 分 子的晶体结构创造了必要的条件。 j 3 诱导表达和分离纯化了耐热邻苯二酚2 ，3 一双加氧酶( t c 2 3 0 ) 的突变体 p r 0 2 2 8 s e r 。辨且以p e g 4 0 0 为沉淀剂，采用汽相悬滴扩散法在4 条件下培养出 p r 0 2 2 8 s e r 的蛋白质晶体，收集和分析了该晶体的x 一射线衍射数据，衍射分辨率 达2 4a 。p r 0 2 2 8 s e r 晶体的空阳j 群属于1 2 2 2f 交晶系，晶胞参数分别为a = 7 05 9 a ，b = 7 4 15 a ，c = 1 3 3 1 1a ( o = p = y = 9 0 。) 。推测该晶体每个小对称单位中含 有两个p r 0 2 2 8 s e r 分子，其m a t t h e w s 参数( v m ) 为2 4 9a 3d a ，溶剂含量约为 5 i 。 复旦大学博士学位论文耐热邻苯二酚2 ，3 - 双加氧酶的晶体结构及其诱变研究 遗传学研究所姜涛 4 应蚪jm a d 方法解析出了t c 2 3 0 分子的晶体结构，该晶体结构是一个新的禽 非铁离f 的俐热外切型双加氧酶结构。f 在此基础上，还解析了f c 2 3 0 的突变体 p r 0 2 2 8 s e r 分f 的晶体结构。t c 2 3 0 分子r lc 一端结构域的龠属离子结合位点的几 何构犁不同于已报道的含铁离子的外切型双加氧酶分子中的金属离子结合位点 的儿何构型。该分子n 一端结构域中的金属离子结合位点在已报道的同类酶的晶体 结构中并小存在。采用定点诱变方法，研究了t c 2 3 0 分子中c 一端结构域金属离 子结合位点和n 一端结构域金属离了结合位点的性质。分析表明，p r o 残基对t c 2 3 0 分子的热稳定性有较大的影响。比较分析t c 2 3 0 分子和热稳定性明显下降的突 变体p r 0 2 2 8 s e r 分子的晶体结构，显示p r 0 2 2 8 残基在t c 2 3 0 分子维持较高的热 稳定性的机制中起着极为重要的作用。、 令i ，3 驴“ri ? ：( 、1 “0 1 ，、f c 足渺 墨兰苎兰堡主兰堡堡查苎垫塑苎三竺! ：! ：坠垄塾壁竺兰堡竺塑墨苎堡墨塑耋壅竺兰塑壅堡墨鱼 a b s t r a c t t h em a i nr e s u l t si nt h i st h e s i sa r ea sf o l l o w s ： l ，i no r d e rt oi n v e s t i g a t et h ee 髓c t so fa m i n oa c i dr e p l a c e m e n to nt h ec h a r a c t e r so f t h e r m o s t a b l ec a t e c h o l2 , 3 一d i o x y g e n a s e ( t c 2 3 0 ) ，t w om u t a n t sf p r 0 2 2 8 s e ra n d g l u 2 4 2 g l y ) o ft h i se n z y m ew e l e o b t a i n e d b yu s i n g t h em e t h o do fp c rr a n d o m m u t a g e n e s i s t h ew i l dt y p et h e r m o s t a b l ec a t e c h o l2 , 3 一d i o x y g e n a s ea n dt h e s et w o m u t a n t s ( p r 0 2 2 8 s e r ，g l u 2 4 2 g l y ) a r e o v e re x p r e s s e di ne c o l it g ia n dp u r i f i e d t h e e n z y m a t i cc h a r a c t e r sa n dt h e r m o s t a b i l i t yo f t h ew i l dt y p ee n z y m ea n dt h et w om u t a n t s ( p r 0 2 2 8 s e r g l u 2 4 2 g l y ) w e r ea n a l y z e d t h er e s u l t sr e v e a l e dt h a tt h eo p t i m u m e n z y m a t i ct e m p e r a t u r eo f t h et w om u t a n t sw e r es a m ea st h a to ft h ew i l dt y p ee n z y m e ( 6 0 ) a n dt h ek c a t k mv a l u eo fp r 0 2 2 8 s e ra n dg l u 2 4 2 g y ( 4 8 9 o 叭1 0 6 t o o l 1 。s 1 a n d5 8 8 0 0 lx10 6t o o l 1s 一r e s p e c t i v e l y ) w e r er e d u c e dc o m p a r e dw i t h t h ew i l dt y p ee n z y m e ( 6 9 7 o0 1 1 0 6t o o l 。s 1 ) h o w e v e r , l h et h e r m o s t a b i l i t yo f p r 0 2 2 8 s e re x t r e m e l yd e c r e a s e dl0 2 a n dt h e t h e r m o s t a b i l i t y o fg l u 2 4 2 g l y s 】j 曲t l yi n c r e a s e d1 5 i tw a sp r o p o s e dt h a tp r 0 2 2 8p l a y e da ni m p o r t a n t r o l eo nt h e t h e r m o s t a b i l i t yo f t h e r m o s t a b l ec a t e c h o l2 , 3 一d i o x y g e n a s e 2 s e m e tm u l t i w a v e l e n g t ha n o m a l o u sd i s p e r s i o n ( m a d ) i san e wm e t h o df o r d e t e r m i n i n gp r o t e i nc r y s t a ls t r u c t u r es i n c e19 9 0 s o n eo f t h ek e ys t e p so ft h i sm e t h o d i st oo b t a i ns e m e ts u b s t i t u t e dp r o t e i n ，a n dt h e nc r y s t a l l i z ei t u s i n gs u b c l o n i n gm e t h o d ， g e n ep h e bw h i c h e n c o d et h e r m o s t a b l ec a t e c h o l2 ，3 - d i x o g e n a s e ( t c 2 3 0 ) w a sc l o n e d i n t ov e c t o rp r s e t , a n dt h eh i g he x p r e s s i o np l a s m i dp r s e t - p h e bw a so b t a i n e d s u b s e q u e n t l y , p r s e t - p h e b w a st r a n s f o r m e di n t om e t a u x o t r o p hh o s tc e l lb 8 3 4 d e 3 ， a n dt h e ns e m e ts u b s t i t u t e dt c 2 3 0 ( s e m e t t c 2 3 0 ) w a s e x p r e s s e da n dp u r i f i e da l lo f t h es e v e nm e ti nt c 2 3 0w e r er e p l a c e db ys e m e t ，d e t e r m i n e db ym a s ss p e c t r o m e t r y a n a l y s i s b yu s i n gt h em e t h o do fh a n g i n g d r o pv a p o r - d i f f u s i o n ，s e m e t t c 2 3 0w a s c r y s t a l l i z e ds u c c e s s f u l l y 复旦走学博士学位论丈耐热邻苯二酚2 ，3 - 双加氧酶的晶体结构度其诱变研究遗传擘研究所姜涛 3t h em u t a n tp r 0 2 2 8 s e ro ft h e r m o s t a b l ec a t e c h o l2 , 3 一d i o x y g e n a s e ( t c 2 3 0 ) w a s e x p r e s s e d a n d p u r i f i e d ，b y t h e h a n g i n g d r o p 、a p o r - d i f l u s i o n m e t h o d u s i n g p o l y e t h y l e n eg l y c o l 4 0 0a sap r e c i p i t a n t t h em u t a n tp r 0 2 2 8 s e ro ft c 2 3 0w a s c r y s t a l l i z e da t4 x r a yd i f f r a c t i o na n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h ec r y s t a l sb e l o n g t ot h e o r t h o r h o m b i cs p a c eg r o u p1 2 2 2w i t hu n i t c e l lp a r a m e t e r sa = 7 05 9a ，b = 7 4 15a ，c = i3 3 ，11 a ( = p = y = 9 0 。) ，a n dt h e y d i f f r a c t e dt oa tl e a s t2 4ar e s o l u t i o n a s s u m i n g t h ep r e s e n c eo f2m o l e c u l e so ft h em u t a n tp r 0 2 2 8 s e ri nt h ea s y m m e t r i cu n i t ， t h em a t t h e w sp a r a m e t e r ( v m ) w a sc a l c u l a t e dt ob e2 4 9a 3d a ，a n dt h es o l v e n t c o n t e n tw a sa b o u t5 】， 4 b ym a dm e t h o d ，t h ec r y s t a ls t r u c t u r eo ft h e r m o s t a b l ec a t e c h o l2 , 3 一d i o x y g e n a s e ( t c 2 3 0 ) h a sb e e ns o l v e da st h ef i r s tt h e r m o s t a b l ea n dn o n i r o ne x t r a d i o ld i o x y g e n a s e a n dt h ec r y s t a ls t r u c t u r eo fm u t a n tp r 0 2 2 8 s e ro ft c 2 3 0h a sb e e nd e t e r m i n e dt o o a c c o r d i n gt ot h en a t i v ec r y s t a ls t r u c t u r eo f t c 2 3 0 t h ec t e r m i n a lm e t a li nt c 2 3 0i s b o u n dw i t ht h r e ec o n s e r v e dr e s i d u e sa n dt w ow a t e rm o l e c u l e sb u tw i t hac o o r d i n a t i o n g e o m e t r yd i f f e r e n t l y f r o mt h o s eo b s e r v e di n o t h e r i r o n c o n t a i n i n g e x t r a d i o l d i o x y g e n a s e s s t r u c t u r e s a n o t h e rm e t a li o n i sf o u n di nt h en t e r m i n a ld o m a i no f t c 2 3 0t h a tl o s tt h em e t a lb i n d i n ga c t i v i t i e si no t h e rh o m o l o g o u se n z y m e s t h e c a t a l y t i ca c t i v i t yo ft h en t e r m i n a lm e t a lb i n d i n gs i t eh a sb e e nd i s c u s s e dc o m b i n e d w i t ht h em u t a g e n e s i ss t u d i e s t c 2 3 0m o l e c u l ea l s oi n d i c a t e sn e ws t r u c t u r a lc h a r a c t e r s o fp r or e s i d u e sf o r p r o t e i nh i g ht h e r m o s t a b i l i t y t h ec r y s t a l s t r u c t u r eo fm u t a n t p r 0 2 2 8 s e rw h o s et md e c r e a s e sb y1o c o m p a r e dw i t ht h a to ft h ew i l dt y p et c 2 3 0 r e v e a l st h er o l e so fp r 0 2 2 8i ns t a b i l i z i n gt h ee n z y m es t r u c t u r e 复旦走学博士学位论文耐热邻苯二酚2 ，3 双加氧酶的晶体结构及其诱变研究 遗传学研咒所姜涛 课题的总体设计思路 邻苯酚2 ，3 - 双加氧f 晦( c a t e c h o l2 ，3 d i o x y g e n a s e ，c 2 3 0 ) 是脂肪芽孢朴菌芳 香族化合物代谢途径中的关键酶之 。许多能降解环境中有毒的芳香族化合物的 细菌大都先把苯酚降解为中问产物一邻苯二：酚( 图1 ) ，再通过邻位( o r t h o ) 或间位 ( m e t a l 途径继续降解。在问位途径( m e t a ) ，邻苯二酚2 ，3 - 双加氧酶可催化邻苯 二酚的苯虾裂解，转化为2 羟粘糠酸半醛( o h y d r o x y m u c o n i c e s e m i a l d e h y d e ) ，该产物呈黄色，在波长3 7 5 n m 处有最大吸收峰。这两种降解途 径的具体步骤示于图2 。研究该酶结构与功能的关系不仅对于探讨该酶的反应机 制具有重要作用，而且在环境保护工作中也具有潜在的理论和应用价值，因而许 多学者从不同的角度对c 2 3 0 进行了研究。 n i l c o o k a n t l l e 扯e n e 幽姒 味 f i g 1 c e n t r a lr o l eo f c a t e c h o li nt h eo x i d a t i o no f a r o m a t i cc o m p o u n d sb y f l u o r e s c e n t p s e u d o m o n a d s 复旦大学博士学位论丈耐热邻苯二酚2 ，3 双加氧酶的晶体结构及其诱变研究 遗传学研究所姜涛 一 c 0 0 b a 瑚a t e 。m m 出删 嚣k 出一， 。咄印，。甜。h 。时。h 。 徽 c ：o h o - f c h 4 - h y 如x y - 2 k e t o v a l e 础o i 入 a c e t a k l e h 孙l ep 卵 i n t e ，c o o 一 弋c o o c 蚌c s - t t 咖o n 拒 念c 。旷 飞声o ，i u c c l n 酣e 、 a c e t y f i g2 t h em e t a - a n d o r t h o c l e a v a g ep a t h w a y sf o r o x i d a t i o no fb e n z o a t ei n p p u t i d a 我们实验室克隆了嗜热脂肪芽孢杆菌( b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s ) 中编码耐 热邻苯二酚2 ，3 双加氧酶( t h e r m o s t a b l ec a t e c h o | 2 ，3 一d i o x y g e n a s e ，t c 2 3 0 ) 的 p h e b 基因( g e n e b a n k 登录号：x 6 7 8 6 0 ) ，并将其亚克隆到表达载体p j l a 5 0 3 上， 实现了在e c o i lt g l 中的高表达，进行了t c 2 3 0 的分离纯化、基本性质研究和 初步的晶体学分析。由于t c 2 3 0 具有较高的热稳定性和便捷的酶活检测方法， 使之也成为研究蛋白质热稳定机制的一个好材料。对t c 2 3 0 晶体结构的解析， 无疑将为探讨该酶的热稳定机制提供理论和实验依据，将有助于从高缴结构e 阐 明该酶结构与功能的关系，有助于诠释其热稳定机制。 怒雌 、广 旺 2 一 1 8 ，苗中 冬。 复旦大学博士学位论文耐热邻苯二酚2 、3 - 双加氯酶的晶体结构及其诱变研究 遗传学研究所萎涛 多波氐反常散射法( m a d ) 是竹：后基因组时代，为满足结构生物学领域中划 商通量测定蛋 j 质结构的需求l 巾逐步发展起来的蛋白质结构解析方法。其基本原 理是在蛋白质分子中引入重原子，利用重原子的反常散射效应来确定相位，进而 完成蛋白质晶体结构的测定。r | j f ，m a d 方法应用于蛋白质晶体结构测定 作， 主要是运用基因工程的技术，将蛋白质分子中的s 置换为s e ，再利用同步辐射的 高能量和波长的可调性，在s e 的x 一射线吸收端上f 某些合适波长f 收集x 一射线 衍射数据，利用s e 的反常散射效应来测定蛋白质的晶体结构。由于m a d 方法避 免了多对同晶臀换等方法费时、费力、功效较差的不足，往往用颗晶体在同步 辐射光源f ：收集的x 射线衍射数据便呵测定蛋自质分子的晶体结构。目前，m a d 方法在国外的结构生物学领域中已得到越来越广泛的应用，但迄今在国内尚未见 报道。 本课题的总体设计思路为： 应用p c r 随机诱变的方法，筛选热稳定性发生明显改变的耐热邻苯二酚2 ，3 双加氧酶( t c 2 3 0 ) 的突变体。并对野生型t c 2 3 0 和典型突变体的性质进行比 较分析。 j 应用m a d 方法，解析t c 2 3 0 分子的晶体结构。并解析突变体p r 0 2 2 8 s e r 的晶体 结构。比较分析两者的晶体结构，并结合性质研究的结果，探讨与t c 2 3 0 的热 稳定性相关的结构因素。 i i 复旦大学博士学位论丈耐热邻苯二酚2 ，3 双加氧酶的晶体结构及其诱变研究 遗传学研究所姜涛 一一 附：p h e b 基因的核苷酸序列和t c 2 3 0 的氨基酸序列 g e n b a n k 】b s t e a r o t h e r m o p h i l u sp h e b d e f i n i t i o n b s t e a j o t l l e r m o p h i l u sp h e bg e n e f o rc a t e c h o l 一2 ，3 一d i o x y g e n a s e a c c e s s i o nx 6 7 8 6 0v e r s i o n x 6 7 8 6 01g i ：4 0 0 5 0 k e y w o r d sc a t e c h o l2 , 3 一d i o x y g e n a s e ；p h e bg e n e s o u r c eb a c i l l u ss t e a r o t h e r m o d h i l u s r e f e r e n c el ( b a s e s1 t o13 9 3 ) a u t h o r s s h e n gj i a ，z t i t l ed i r e c ts u b m i s s i o n j o u r n a ls u b m i t t e df 2 7 一j u l 一19 9 2 ) zs h e n gj i a ，i n s t i t u t eo fg e n e t i c s ，f u d a n u n i v e r s i t y , s h a n g h a i2 0 0 4 3 3 ，p r o c t r a n s l a t l 0 n m s k n f q e p i f d v a q l a h v e l l s p k l e e s i v f f t k y l g m e v t a r a g n s v y l r a y e d f y h n t l k i t e s a e a g l g h v g w r a s s p q a l e r r v l e l e k s g l g r g w i d g d i g h g k a y q f t t p d g h q m e i f f e v e y y k p q p e q k t k l l n r p s k r p a q g v p v r r l d h i n l m t s n p g v d t q f m i d t l g f r l r e q l r d k g k i l g s w i s v s n l v h e i a f m q e p n q e k g k l h h l c y w y g l p q n l y d l a d l l k d h e y f i e v p p n k h g l s q a f c m y v y e p g g n r i e l f g d a g y l i t d p t w e p v i w e m e d v p g n g d t w i g t a f p d s w w l r g t p v t t k e v v k p 0 r i g i n 1 a g c t c g g c a tt a a a g c t t g tg g t g a t t t c aa t t g g g g a a ag a g c a c g g a tg t t a a a c a a a 61 a t a a a a g a a ag t c a a a a a t tt g c t g t c a a ta t t t t a g c c tg c a a a t c a a ca g g a a t t a t c 121 a a t g a t g t t tg c a g g t c a a at g a a a g a a a aa a g a g a t g t cc g t t t t g a a ca a c t t g c c g g 181 t c t t c c 日i g t ta t t c a a g g t gc a g t t g c t c aa g t g g c a t g tg a g g t t g c t gg t g a a c a t g t 2 4 1a g a a g g c g a cc a c a c c c t t tt t a t c g g t a aa g t a a a c g c ta t t c a a c t a ta t g a t g a a g a 3 0 1a c e a c t t a t tt t c t t t a g t gg t c a a t a t c a f c g h a g a ac c a a a g g a a g c t g t a c t c a g 3 6 1t a a a t a a a t ta t t a a t a g g tg g a a t c t a t aa t g t c a a a a aa t t t c c a a g aa c c a a t c t t t 4 2 1g a t g t t g c a ca a t t g g c t c at g t a g a g c t tc t t t c t c c a aa a c t a g a g g aa t c c a t t g t a 4 8lt t t t t t a c a aa a t a t t t a g ga a t g g a a g t aa c t g c t c g c gc a g g g a a t t ct g t c t a t c t t 5 4 1c g t g c g t a t g a a g a t t t c t at c a t a a t a c tc t a a a a a t a ac g g a a t c c g ct g a a g c t g g t 6 01 t t a g g g c a t gt t g g t t g g c gt g c g t c t t c tc c t c a a g c a ct t g a a a g a c gg g t a c t g g a a 6 61 c t t g a a a a g tc g g g t t t a g gc c g c g g c t g ga t t g a t g g a ga t a t t g g c c at g g c a a g g c a i v 复旦太学博士学位论文耐热邻苯二酚2 ，3 - 双加氧酶的晶体结构及其诱变研究 遗传学研究所萎涛 7 21t a t c a a t t t ac g a c a c c t g at g g t c a t c a aa t g g a a a t a tt t t t t g a g g tc g a a t a t t a t 7 81a a a c c a c a a c c t g a g c a a a ag a c a a a a t t at t a a a t c g g cc g t c t a a a c ga c c a g c a c a a 8 41 g g c g t a c c t gt c c g c c g g t ta g a t c a t a t ta a c t t a a t g ac c t c t a a c c ca g g a g t a g a t 9 01 a c g c a a t t t at g a t c g a t a cg t t a g g a t t cc g c t t a a g g ga a c a a a t c c ga g a t a a a g g c 9 61 a a a a t c c t t gg c a g t t g g a tt a g t g t c t c aa a c t t a g t a ca t g a a a t t g cg t t t a t g c a a 10 21 g a g c c g a a t ca a g a a a a a g gg a a g c t t c a tc a t c t t t g c ta t t g g t a t g gc a t c c c g c a a 10 81 a a c c t a t a t ga t t t a g c a g ac c t a t t a a a ag a c c a t g a a ta t t t c a t t g aa g t t c c a c c a 1141 a a t a a a c a t gg a a t t a g t c aa g c g t t t t g ta l g t a t g t c ta t g a a c c a g gt g g c a a t c g a 12 01 a t c g a a t t a tt t g g t g a t g cc g g g t a t c t ta t t a c c g a t cc a a c a t g g g ag c c t g t t a t a 12 61 t g g g a g a t g ga g g a t g t a c ca g g a a a t g g cg a c a c a t g g at c g g a a c c g ct t t c c c a g a c 13 21 t c t t g g t g g tt a c g t g g c a ca c c t g t t a c aa c g a a a g a a gt t g t g a a g e ca t a g g t t t g t 1 3 8 1a g g g t a c c g a g c t v 复旦戈学博士学位论文耐热邻苯二酚2 ，3 杖加氧酶的晶体结构及其诱变研究遗传学研咒所萎涛 第一部分 综述 复旦大学博士学位论文耐热邻笨二酚2 ，3 - 双加氧酶的晶体结构厦其诱变研究 遗传学研究所姜涛 耐热蛋白质的热稳定机制研究进展 、h ui 存高温条件r ，唰热蛋白质j 以保持其牛物活性以及热稳定性。k 期以来， 对于俐热蛋向质热稳定机制的研究已越来越引起人们的重视，人们直在探寻那 些与喇热蛋白质热稳定性相关的因素，探讨蛋白质分子的热稳定机制。毫无疑问， 阐明蛋白质热稳定机制的原理，将有助f 我们对蛋白，质折叠以及蛋白质相互作用 机制的理解，有助于我们对蛋白质结构与功能关系的认识，有助于我们设计出适 合于高温环境的生物催化剂，还将有助于我们对地球上生命历史的了解。1 9 7 4 年，m a t t e w s 等人报道了第。个高分辨率的耐热蛋白质一嗜热菌蛋白酶 ( t h e r m o l y s i n ) 的晶体结构( m a t t e w se l a l ，1 9 7 4 ) 。p e r u t z 和r a i d t ( p e r u t ze t a l ，1 9 7 5 ) 等人从立体化学的角度对f e r r e d o x i n s 和h o m o g l o b i n 的热稳定机制进行了分析。 此后，许多理论和实验工作探讨了与i i i j 热蛋白质热稳定性相关的分子基础，并对 耐热蛋白质的热稳定机制从各个不同的角度进行了研究和解释( 例如：g u p t a ，e l a l 1 9 9 3 ；r u s s e l ，e ta l ，1 9 9 s ；q u e r o | ，e ta l ，1 9 9 6 ；v i e i l l e ，e la l ，1 9 9 6 ；j a e n i c k e ，e ta l ，1 9 9 7 v o g t ，e t a l ，1 9 9 7 ；l a d e n s t e i n ，e l a l ，1 9 9 8 ；k u m m a r ，e t a l ，2 0 0 0 ) 。1 9 9 7 年，v o g t 等人( v o g t ，e t a l ，1 9 9 7 ) 以已报道的相关研究工作为依据，总结出2 0 种可用于 解释蛋白质热稳定性升高的因素( 表1 ) 。他们认为在已报道的研究工作中，不同 的耐热蛋白质是采用其中一种或多种策略来实现较高的热稳定性。同时，他们也 指出，已有的研究成果仍不足以提出一个较普遍的规律或者个具有明显倾向性 的模型。 复旦大学博士学位论文 耐热邻苯二酚2 ，3 双加氯酶的晶体结构及其诱变研究 遗传学研究所姜涛 f a b l e1 p h y s i c o c h e m i c a le x p l a n a t i o n s f o re n h a n c e dt h e r m o s t a b i l i t ya sr e p o r t e di n l i t e r a t m e e x p l a n a t i o nt y p e b e t t e rh y d r o g e nb o n d i n g b e t t e rh y d r o p h o b i ci n t e r n a lp a c k i n g e n h a n c e ds e c o n d a r ys t r u c t u r ep r o p e n s i t y h e l i xd i p o l es t a b i l i z a t i o n r e m o v a lo fr e s i d u e ss e n s i t i v et oo x i d a t i o no rd e a m i n a t i o m b u r y i n go fh y d r o p h o b i c a c c e s s i b l ea r e a i m p r o v e d e l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n s s t r e n g t h e n i n gi n t e r s u b u n i ta s s o c i a t i o n d e c r e a s e db a c k b o n es t r a i n s a l tb r i d g eo p t i m i z a t i o n b e t t e rv a nd e rw a a l si n t e r a c t i o n s b e t t e ra f f i n i t yf o rc a l c i u m i m p r o v e de n t h a l p yu p o n s u b s t i t u t i o n e n h a n c e ds t a b i l i t yo fs e c o n d a r ys t r u c t u r e d e c r e a s eg l y c i n e sa n de n h a n c e d p r a l i n e si nl o o p s s h o r t e rl o o p s a d d i t i o n a ld i s u l f i d eb r i d g e so rm e t a lb i n d i n ga n d g l y c o l y s a t i o ns i t e s d e c r e a s ei nn u m b e ra n dv o l u m eo fi n t e r n a lc a v i t i e s i n c r e a s ei na r o m a t i ci n t e r a c t i o n s ( 引自g e r h a r d v o g t 等，j m o l b i o l ，1 9 9 7 ，2 6 9 ：6 3 1 - 6 4 3 ) 复旦大学博士学位论丈 耐热邻幕二酚2 ，3 - 双加氧晦的晶体结构厦其谤变研究 遗传学研究所萋蒋 门前，人多数对蛋白质分r 热稳定性的研究l ：作往往采取以f 两种策略： ( 1 ) 是壮r 蛋白质分子结构分析, f l l i 或诱变研究i ：作的策略，t 要是依掘向j 热蛋 白质和与其同源的常温蛋白质之间稿：结构j 二的差异性，并结合随机诱变或定点诱 变等蛋白质1 ：程的研究工作，分析蛋白质r ，各种不同的相互作用对蛋白质热稳定 性的贡献，寻找与热稳定性相关的因素及可能的热稳定机制，总结出可以提高蛋 自质热稳定性的可能规律。( 例如：w a l k e r , e ta l ，1 9 8 0 ；m a t t h e w s ，e ta l ，1 9 8 7 ； n i c h o l s o n ，e ta l ，1 9 8 8 ；p a u p i t ，e ta l ，1 9 8 8 ；f r o m m e l ，e ta l ，1 9 8 9 ；p a n t o l i a n o ，e ta l ， 1 9 8 9 ：a n d e r s o n ，e ta l ，1 9 9 0 ；d a o p i n ，e ta l ，1 9 9 1 ：k l e m m ，e ta l ，1 9 9 1 ；h e i n z ，e ta l ， 】9 9 2 ；f e r s h t ，e la a19 9 3 ：n o s o h ，e la l ，l9 9 3 ；s e r r a n o ，e ta l ，19 9 3 ；k o r n d o r f e r ，e l d f ，1 9 9 5 ；s z i l a g y i ，e l a l ，1 9 9 5 ；t a n n e r ，e l a l 1 9 9 6 ；v a nd e n r u r g ，e t a l ，1 9 9 8 ) 。 ( 2 ) 是基于对具有相同或相似功能的耐热蛋白质和与其同源的常温蛋白质的