（遗传学专业论文）黄瓜线粒体dna类质粒pc3同源性及分布研究.pdf

l i l ll l ii l l l li i i iii i iii y 17 9 8 12 0 ad i s s e r t a t i o no ft h er e q u i r e m e n t ss u b m i t t e dt o n a n k a iu n i v e r s i t yf o rt h ed e g r e eo fm a s t e ro f p h i l o s o p h y i n v e s t i g a t i o no nt h eh o m o l o g ya n d d i s t r i bu t i o no fm i t o c h o n d r i a l p l a s m i d l i k e d n a p c 3f r o mc u c u m b e r s u p p o r t e db yg r a n tf r o mt i a n j i nm u n i c i p a ls c i e n c ea n dt e c h n o l o g yc o m m i s s i o n n o 0 8 j c y b j c 0 4 2 0 0 b ys h a id o n g s u p e r v i s e db y p r o f e s s o ry a n l i n gb a i c o l l e g eo fl i f es c i e n c e s n a n k a iu n i v e r s i t y t i a n j i n3 0 0 0 7 1 er c h i n a m a y 2 0 0 8 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了解南开大学关于收集 保存 使用学位论文的规定 同意如下各项内容 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版 并采用影印 缩印 扫描 数字化或其它手段保存论文 学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务 学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版 在不以赢利为目的的前 提下 学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动 学位论文作者签名 藿色 7 r osf f 占具叠日 经指导教师同意 本学位论文属于保密 在垆年解密后适用 本授权书 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人在导师指导下 进行 研究工作所取得的成果 除文中已经注明引用的内容外 本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的 己公开发表或者没有公开发表的 作品的内容 对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体 均已在文中以明确方式标明 本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担 学位论文作者签名 墨舀 沁g 年y 月矽日 中文摘要 中文摘要 高等植物的遗传信息主要储存在细胞核基因组内 也有部分储存于线粒体 和叶绿体 但其储存的信息量有限 多数结构和功能蛋白仍由细胞核基因组编 码 在植物进化过程当中 细胞核与细胞器间遗传信息一直进行着交流和传递 由此引起了部分遗传信息在细胞内定位和基因表达的改变 本研究以 津研四号 黄瓜线粒体中的环状d n a 类质粒p c 3 为线索 深入 研究p c 3 与其它两个类质粒p c l p c 2 及基因组d n a 的同源序列 实验方法为以 p c 3 为模板设计三对引物 分别能够扩增p c 3 部分及全长序列 以提取的类质粒 及基因组d n a 为模板进行p c r 扩增 探索其他类质粒及基因组中的p c 3 同源序 列 实验思路为逐步探索 津研四号 黄瓜线粒体内其它两个类质粒p c l p c 2 津研四号 黄瓜细胞核 线粒体 叶绿体基因组d n a 黄瓜属内其它品种 津 春四号 津绿三号 葫芦科内其它具有代表性植物 西瓜 甜瓜 南瓜 及非葫芦科植物中与p c 3 同源的序列 研究结果证明 p c l p c 2 与p c 3 具有同源关系 推测p c l p c 2 为p c 3 的多 聚体 津研四号 黄瓜线粒体与叶绿体基因组中p c 3 的同源序列以p c 3 的多拷 贝串联重复形式存在 津春四号 津绿三号 黄瓜基因组d n a 与p c 3 具有不 同程度的同源性 五个品种西瓜的总基因组d n a 均与p c 3 具有同源关系 五个 甜瓜被测品种中有三个与p c 3 具有同源性 而五个南瓜品种中仅有一个品种的 总基因组d n a 具有p c 3 同源序列 四种非葫芦科植物的总基因组d n a 均与p c 3 不同源 由此推测p c 3 可能起源于葫芦科 本研究通过对p c 3 在黄瓜基因组间同源性分析及在相关植物基因组中的分 布情况研究 追踪p c 3 在黄瓜细胞器之间是否可以进行穿梭 为将p c 3 开发成 细胞器遗传转化载体奠定理论基础 关键词 黄瓜 线粒体 类质粒p c 3 同源性 分布 a b s t r a c t a b s t r a c t a l t h o u g hm i t o c h o n d r i o na n dp l a s t i dh a v em e i ro w ng e n o m e s t h eg e n e t i c i n f o r m a t i o no ft h e mi sm u c hl i m i t e d a n dt h e r e f o r e t h ev a s tm a j o r i t yo ft h ep r o t e i n s 廿1 e yn e e da r ec o d e db yn u c l e u sf o rt h e i rc o n s t r u c t i o na n df u n c t i o n d u r i n gt h e e v o l u t i o no ft h eh i g h e rp l a n t t h eg e n e t i ci n f o r m a t i o ne x c h a n g ea m o n gt h en u c l e a r c h l o r o p l a s ta n dm i t o c h o n d f i a t h i sk i n do ft r a n s f e ri sm o s tl i k e l yt ot a k eg e n e t i c i n f o r m a t i o nt on e wl o c a t i o no ft h ec e l l c h a n g et h ee x p r e s s i n go fg e n e s e t c t h er e s e a r c hw a sp l a n e dt o i n v e s t i g a t et h eh o m o l o g yb e t w e e nm i t o c h o n d r i a l p l a s m i d l i k ed n ap c 3a n dp c l p c 2 d i f f e r e n tg e n o m ed n a s i nt h ec u c u m b e rc e l l b a s i n go nt h ep c ra p p r o a c ha n dp c 3s e q u e n c e w ed e s i g n e de m p l o y e dt h r e ep a i r so f p r i m e r sw h i c hc a na m p l i f yt h ef u l l l e n g t ha n dp a r to fp c 3 t h eh o m o l o g o u s s e q u e n c e sw e r ea m p l i f i e du s i n gp c1 p c 2 t h en u c l e a r c h l o r o p l a s ta n dm i t o c h o n d r i a d n ao fj i n y a nn o 4 a n dd n ae x t r a c t e df r o mj i n c h u nn o 4 j i n l vn o 3 w a t e r m e l o n m e l o n s q u a s ha n do t h e rp l a n t sa st e m p l a t er e s p e c t i v e l ym o s to ft h e a m p l i f i e ds e q u e n c e sh a v eb e e nc l o n e da n dt h o s ef r o mp c1 p c 2a n dt h eg e n o m eo f j i n y a nn o 4h a v eb e e ns e q u e n c e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tp c 3h a sh o m o l o g yw i t ht h es e q u e n c e so fp c 1 p c 2 a n dp c l p c 2a r em o s tl i k e l yt ob et h ep o l y m e r so f p c 3 t h eh o m o l o g o u ss e q u e n c e s b e t w e e nt h eg e n o m eo fj i n y a nn o 4a n dp c 3a r ea p p e a r e dt h ec h a r a c t e r i s t i c so f t a n d e mr e p e a to fp c 3 t h ep c 3h a v eh o m o l o g yw i t ht h eg e n o m e so f j i n c h u nn o 4 j i n l vn o 3a n dt h em o s to ft h ec u c u r b i t a c e a ef a m i l yp l a n t si n v e s t i g a t e dt o o b u t d o e s n th a v eh o m o l o g yw i t ho t h e rp l a n t s a n dt h i si m p l e dt h a tp c 3p o s s i b l yo r i g i n f r o mt h ec u c u r b i t a c e a ef a m i l y w eu s e dp c 3a st h ep r o b et o i n v e s t i g a t et h ed i s t r i b u t i o no fp c 3h o m o l o g o u s s e q u e n c ei nd i f f e r e n tg e n o m e si nc u c u m b e r w h i c hw o u l db ei n f o r m a t i v et ou n v e i l w h e t h e rp c 3c o u l dt r a n s f e ra m o n gt h e s eg e n o m e sa n dp r o v i d eap r o f o u n dt h e o r e t i c a l f o u n d a t i o nf o rd e v e l o p i n gp c 3a sav e c t o ro fg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n k e yw o r d s c u c u m b e r m i t o c h o n d r i a p l a s m i d l i k ed n ap c 3 h o m o l o g y i i a b s t r a c t d i s t r i b u t i o n i i i 目录 目录 第一章绪论 1 1 真核生物线粒体类质粒的分布与类型 2 1 1 真核生物线粒体类质粒的发现 2 1 2 真核生物线粒体类质粒的分类 3 2 真核生物线粒体类质粒的同源性及起源 4 2 1 外源性推测 4 2 2 内源性推测 4 3 细胞器间遗传物质的传递 5 4 研究意义和研究现状 7 第二章材料与方法 9 1 材料与方法 9 1 1 供试材料 9 1 2 常用试剂和酶 9 1 3 实验仪器 1 0 1 4 常用储备液及缓冲液 1 0 1 5 引物设计 1 3 2 实验方法 1 5 2 1 线粒体及d n a 类质粒的提取 1 5 2 2 黄瓜核d n a 的提取 1 7 2 3 黄瓜叶绿体d n a 的提取 1 7 2 4 植物总基因组d n a 的提取 1 8 2 5 质粒的提取 二 1 9 2 6p c r 反应 2 0 2 7 酶切反应 2 1 2 8d n a 的凝胶回收 2 2 2 9 连接反应 2 2 2 1 0ec o l i 感受态细胞的制备及其转化 2 3 i v 目录 2 1 l 重组子的序歹9 测定 2 5 第三章结果与分析 2 6 1 黄瓜线粒体类质粒p c l p c 2 与p c 3 的同源性研究 2 6 1 1 线粒体基因组d n a 与d n a 类质粒的提取及电泳 2 6 1 2p c 3 与p c l p c 2 的同源性分析 j 2 6 2p c 3 与基因组d n a 的同源性研究 3 4 2 1p c 3 与线粒体主基冈组d n a 的同源性 3 4 2 2p c 3 与叶绿体基因组d n a 的同源性 3 5 3p c 3 与其它黄瓜品种的同源性研究 4 0 4p c 3 与葫芦科其它植物的同源性研究 4 4 5p c 3 与非葫芦科植物的同源性研究 4 7 第四章讨论 4 8 1p c 3 与p c l p c 2 的同源性研究 4 8 2p c 3 与 津研四号 基因组d n a 的同源性研究 4 9 3p c 3 与其它植物基因组的同源性研究 5 0 小结 5 1 参考文献 5 2 致谢 5 6 附录 5 7 个人简历 6 1 v 缩略词表 缩略词表 第一章绪论 第一章绪论 在光学显微镜下 线粒体一般呈粒状 杆状或线状 不同种类细胞核不同 生理状态下 线粒体的形状可能不同 线粒体的直径一般为0 5 3 0um 电镜 下 线粒体由两层单位膜围城的封闭囊状结构 分为外膜 内膜 膜间腔和内室 基质四部分 外膜平滑 膜上有非特异性孔道作用的蛋白 可让水溶性小分子 物质通过 内膜向内折叠形成嵴 内膜和嵴的基质表面上有a t p 酶的复合物 是氧化磷酸化的关键装置和能量转化单位 两层膜之间有腔 腔中含有许多可 溶性酶类 底物和辅助因子 l 线粒体除通过氧化磷酸化为细胞提供能量外 还 能维持c a 2 及p h 的稳定 同时参与了细胞凋亡的调控 2 1 作为高等生物能量代谢细胞器的线粒体具有d n a 聚合酶 r n a 聚合酶 t r n a 核糖体 氨基酸活化酶等进行d n a 复制 转录和蛋白质翻译的全套装备 说明 线粒体具有独立的遗传体系 但是线粒体能力有限 自身1 0 0 0 多种蛋白质中仅 有十余种是由自身合成 9 0 左右的蛋白质依赖细胞核基因编码 在细胞质中合 成后定向转运到线粒体 因此线粒体只是一种半自主性的细胞器 虽为如此 但是线粒体编码的十余种蛋白质均为线粒体呼吸代谢中至关重要的成分 同时 线粒体也是区分真核生物与原核生物的主要标志 此外 线粒体与真核生物的 能量代谢 光呼吸作用 雄性不育 细胞凋亡等均有关系 3 因此 线粒体是细 胞中不可或缺的组成部分 真核生物中线粒体基因组的大小差距显著 植物线粒体基因组较动物线粒 体基因组大 同时不同植物 动物间线粒体基因组也存在着很大差距 植物线 粒体基因组较动物线粒体基因组编码基因要多 4 而且基因组也要庞大许多 但 是植物线粒体基因组的庞大并不是由编码基因增多而造成的 那是由什么原因 造成的呢 l i l l y 等对黄瓜部分线粒体基因组进行研究发现 之前提出的反转录 转座子 来自质体的d n a 片断都只是造成线粒体基因组庞大的原因之一 主要原 因是d n a 重复序列的存在 5 j 这些重复序列主要包括转座因子 卫星d n a 小片段 重复序列及随机重复序列 6 j 包含内含子的编码序列 反转录转座子和来自质体 d n a 的片断占黄瓜线粒体总基因组的1 2 而d n a 重复序列保守估计就占到了线 粒体基因组的l l 蝌引 除了庞大复杂的主基因组外 线粒体中还存在能进行独立 复制的小核酸分子 7 d 3 第一章绪论 1 真核生物线粒体类质粒的分布与类型 质粒是最早发现于原核生物的一种双链闭合环状d n a 分子 它能够在染色 体外进行自主复制 对宿主细胞没有毒害作用 甚至能赋予宿主一些新的有利 于生存的性质 例如质粒上常有的抗生素抗性基因 有些质粒能够整合进细菌 的染色体 也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的d n a 分子 因此 在基因工程中质粒常被加以改造用作基因的载体 人工构建的质粒可以集多种 有利特征于一体 如含多种单一酶切位点 抗生素耐药性等 在一些真核生物 的细胞器主基因组以外也存在着类似质粒的d n a 分子 它们能独立遗传复制 并对宿主无毒害作用等 其性质与原核生物的质粒非常类似 所以称之为类质 粒或是直接称之为质粒 1 1 真核生物线粒体类质粒的发现 以细胞核为外源基因受体的传统基因工程虽已发展成熟 并已得到广泛使 用 但仍存在难以解决的问题 目的基因表达量不理想 因位置效应外源基因 的转入常沉默 需花大量经历来筛选目的植株 原核基因的表达需经修饰改造 容易引起环境污染等等 1 4 人们不禁将注意力转移到了细胞器遗传转化 细胞 器遗传转化为这些困难的解决带来了希望 l5 1 细胞器遗传转化能定点整合外源 基因 细胞器起源于原核生物 其基因编码及其排序具有原核生物的特点 因 而原核基因在细胞器中表达不需任何修饰 原核启动子也能在细胞器中直接使 用 因细胞器的遗传方式为母系遗传 外源基因整合到细胞器基因组后不会因 孟德尔遗传而在后代中出现性状分离 也不会因为花粉的传播而将外源基因传 播到其它相近植物而引起环境安全性问题 同时细胞中细胞器的拷贝数相对较 多 对目的基因的多拷贝表达具有一定影响 虽然细胞器遗传转化具有细胞核 遗传转化难以比拟的有点 但是一直没有合适的细胞器遗传转化表达载体 幸 运的是 诸多学者在线粒体中发现了类质粒的存在 1 9 7 7 年p r i n g 等人在研究玉米细胞质雄性不育 c y t o p l a s m i cm a l e s t e r i l i t y c m s 与线粒体基因组的关系时意外在玉米s 组雄性不育胞质线粒 体中发现两个线性d n a 分子 依据其分子量大小分别命名为s 1 和s 2 7 1 l e v i n g s 等1 9 8 3 年证明s l 和s 2 是玉米c m s s 所特有的d n a 分子 这些小核酸分子能够 在线粒体染色体以外进行自主复制 对于细胞没有毒害作用等等这些性质与原 核生物的质粒非常相似 因此被称之为线粒体类质粒或是线粒体质粒 随后的 2 第一章绪论 3 0 年间诸多学者相继在甜菜 高梁 蚕豆 油菜 水稻 向日葵等多种植物中 也发现线粒体d n a 质粒 本实验室在2 0 0 2 年首次报道在黄瓜环状类质粒的存在 其中之一p c 3 是迄今为止所报道的分子量最小的类质粒 大小为0 5 k b 到目前 为止高等植物的禾本科 棕榈科 豆科 藜科 十字花科 菊科及葫芦科共7 个科中发现有线粒体类质粒 同时在一些真菌线粒体中也存在d n a 类质粒 线粒体类质粒的发现无疑是细胞器遗传转化潜在的载体 为细胞器遗传转 化的研究开辟了一个新的通道 同时追究线粒体类质粒的分子形态 起源等等 为线粒体类质粒对应用打下基础 1 2 真核生物线粒体类质粒的分类 依据核酸性质和形态将真核生物线粒体类质粒分为环形d n a 类质粒 线性 d n a 类质粒和r n a 类质粒 线粒体类质粒分子形态的鉴定可以借助r n a s e 处理 若不被消化则为d n a 类质粒 环形d n a 类质粒及线性d n a 类质粒的鉴定常借助电子显微镜或是单一 限制性核酸内切酶或s 1 核酸酶消化叭r 兀 环形d n a 类质粒消化后的电泳行为是 由原来的超螺旋及开环两条电泳带变换为位于两条带之间的一条线性条带 而 线状d n a 类质粒经单一限制性核酸内切酶或s 1 核酸酶消化后转变为两条分子量 更小即电泳行为表现为迁移变快的两条核酸条带 环形d n a 类质粒首先是在玉米线粒体中发现的 1 8 随后在甜菜 白藜 向 日葵 水稻 蚕豆等等植物中发现环形d n a 类质粒的存在 虽然来源不同 但 在结构和性质上有一些共同的特征 1 环形d n a 类质粒一般较小 津研四号 黄瓜线粒体类质粒最大约为2 8 k b 最小约为0 5 5 k b 1 9 1 2 已报道的环形类 质粒均与线粒体主基因组和叶绿体基因组没有同源性 大部分与核基因组同源 少部分与核基因组不同源 3 大部分环形类质粒中有正向和反向重复序列正 向重复序列几乎在所有线粒体d n a 类质粒中存在 长度在9 b p 6 0 b p 不等 反向 重复序列是环状线粒体d n a 质粒的一个普遍特征 4 大部分环形类质粒间具 有同源性 z 线状d n a 类质粒绝大多数存在于真菌 少数存在与高等植物 动物细胞中 不存在线状d n a 类质粒 线状d n a 类质粒一般分子较大 有末端重复序列和5 端与蛋白共价结合等特点 具有d n a 聚合酶 偶有品种中也存在r n a 聚合酶 g c 含量较低 线状d n a 类质粒研究最多的是来自于玉米 其在不同玉米类型中 j j ij 一j 一 j i 一一 一 一 1 i7 一 第一章绪论 的分布是限制的 例如s 1 和s 2 质粒仅在s 型细胞质的c m s 株中存在 2 真核生物线粒体类质粒的同源性及起源 真核生物类质粒的起源一直未知 但是依据核酸序列的同源性和高级结构 的相似性 结合类质粒的复制方式可以进行推测 推测线粒体类质粒的起源有 内源性和外源性两种起源 2 1 外源性推测 线状d n a 类质粒具有末端重复序列 t e r m i n a li n v e r t e dr e p e a t s t i r 5 端有蛋白结合 开放阅读框等 这些特征与腺病毒 噬菌体c i 2 9 及a c d s 等 转座因子极为相似 2 1 1 水稻中s l s 2 线性d n a 类质粒5 端结合蛋白与腺病毒 线状d n a 链5 端结合的5 5 0 0 0 道尔顿蛋白相似 且均通过丝氨酸的b o h 与脱 氧胞苷的5o h 形成磷酸二酯键而连接 同时57 端蛋白的存在在病毒复制中起到 了引物的作用 便于d n a 聚合酶与模板链结合合成姊妹链 2 2 2 3 1 线状d n a 类质 粒的g c 含量较低 结合真菌基因组结构 组成及转录起始方式表明线状d n a 类 质粒有可能起源于病毒 2 2 内源性推测 h i r o k a z uh a n d a 在对日本油菜中1 1 6 4 0 b p 的线状类质粒的起源及其传递方式 进行研究时发现 线粒体类质粒是通过花粉传递 即线粒体为父性遗传方式 类质粒的存在与线粒体基因组无关但是却受着细胞核基因的影响 可能细胞核 上某个特定基因控制着类质粒的存在及其拷贝数的多少 2 4 1 许多学者进行类质 粒同源性分析时发现环形d n a 类质粒多与核基因组具有同源性 推测环形d n a 类质粒起源于n d n a 但是基于核同源序列的分析结果 f u k u e h i 等提出了相反 的观点 认为水稻b 4 类质粒可能起源于线粒体基因组 然后转移到细胞核中 并整合到了细胞核基因组 同时发现玉米中s 1 与细胞核基因组具有同源性 2 5 1 s 2 与线粒体主基因组具有同源性 2 6 1 s 一1 与叶绿体基因组中的p s b a 基因具有 同源性 2 基因组上类质粒的同源序列与类质粒是什么关系 谁是始祖谁是产 物 亦或是细胞内遗传物质信息传递的产物 本实验室在黄瓜线粒体中发现三 个类质粒p c l p c 2 和p c 3 p c 3 是迄今为止所报道的真核生物线粒体环形d n a 类质粒中最小的 s o u t h e r n 杂交结果显示p c 3 与叶绿体基因组 细胞核基因组 4 第一章绪论 均有杂交信号 无从说明p c 3 类质粒的起源 可能起源于某一基因组 而后在 细胞内发生转移 存在于线粒体中的类质粒 不管有无明确编码能力及其编码 产物为何 在生物的长期进化中能被世代传递 必然有其生物学意义和功能 3 细胞器间遗传物质的传递 真核生物细胞内除细胞核外还有多种执行特定功能的细胞器 其中线粒体 和叶绿体具有独立的遗传物质 但是细胞器遗传信息储量有限 其多数结构和 功能蛋白是由细胞核来编码 细胞核 线粒体和叶绿体不仅在功能上相互依存 遗传信息能够穿越膜屏障 在细胞核和细胞器及细胞器之间进行传递 从而引 起部分遗传信息在细胞内的定位和表达发生改变 1 细胞核与质体之间遗传信息的传递 内共生学说认为质体起源于蓝细菌 蓝细菌在1 2 亿年前与宿主形成共生 关系后 随后许多基因转移到了宿主基因组 2 8 3 7 或是因为共生关系形成后某 些功能丢失而导致相关基因的丢失或是沉默 从而形成了质体对宿主细胞的依 赖性 同时导致质体基因组相对变小 但是质体具有很强的遗传保守性 不同 植物中质体编码的基因几乎相同 任何外源基因的侵入都可能给质体带来致命 性的损伤 所以质体中包含的外源基因很少 但是质体基因却通过d n a 或r n a 转移方式转移到了细胞核 例如蓝藻叶绿体中的t u f a 基斟3 8 1 m i d 基因 3 9 r p l 2 1 4 u j 等等 s t e g e m a n n 等在分子水平上验证了基因从叶绿体向细胞核的转移 同时还发现了转移后基因的沉默现象 4 l 2 细胞核与线粒体之间遗传信息的传递 线粒体基因组在进化过程当中有许多基因转移到了细胞核 4 2 4 9 但是线粒 体基因组大小并没有受此影响 线粒体基因组反而庞大 尤其是葫芦科植物 但线粒体中仅有1 0 的结构和功能基因是由自身编码 5 0 1 9 0 均依赖细胞核编码 线粒体中冗余基因或是被细胞核中相关功能基因取代 或是吸纳外源基因获得 s c h u s t e r 等人在月见草线粒体中检测到一段细胞核同源序列 比对证实其中 5 2 8 b p 与玉米细胞核1 8 sr r n a 有9 1 的同源性 5 1 1 拟南芥线粒体基因组中来源 于细胞核的反转座子序列占4 5 2 在进化过程中 祖先线粒体的诸多基因转移 到了细胞核 例如线粒体主要编码的核糖体蛋白基因和呼吸链蛋白基因 显花 植物中1 4 种线粒体核糖体蛋白转移到了细胞核 即小亚基的s 1 s 2 s 3 s 4 第一章绪论 s 7 s 9 s i o s 1 1 s 1 2 s 1 3 和s 1 9 大亚基的l 2 l 5 l 1 6 5 3 呼吸链中仅被 子植物的c o x i i s d h 3 和s 批发生了转移 其它基因均未发生转移或是丢失 为什么呼吸链中基因相对稳定保守昵 一种解释是由于某些高度疏水膜蛋白不 能转运到细胞器中并进行准确定位 限制了呼吸链中一些蛋白基因的转移 5 4 1 在逐步进化过程中 细胞核与线粒体之间遗传信息的传递还在继续 3 线粒体与质体之间遗传信息的传递 质体基因组相对保守 目前没有线粒体基因转移到质体的报道 但是也有 线粒体基因的表达产物输送到质体的情况 g a l l o i s 等在研究拟南芥质体l 2 1 蛋 白时就发现这一蛋白的相关基因来自于线粒体 5 5 1 质体基因却是频繁的向线粒 体转移 线粒体中大约1 5 的t r n a 是由质体来源的基因编码 例如拟南芥中有 六个t r n a 基因来自于质体 月见草中t r n a 7 来自于质体 玉米线粒体中有包含 2 3 sr r n a 的3 末端 4 5 sr r n a 5 sr r n a 和毗邻t r n a 慨部分的1 2 7 0 b p 片断 来自于质体 玉米和小麦线粒体中t r n a 泖已被证明来源于质体 且该基因能具 有转录和翻译功能 拟南芥中叶绿体来源的甲硫氨酰t r n a 合成酶基因在细胞质 中翻译后蛋白产物分别转运至线粒体和叶绿体 并能修饰成成熟蛋白发挥功能 p 6 j 也有质体基因并未转移到线粒体 但是质体基因表达蛋白转运到线粒体发 挥功能 例如拟南芥 大豆 棉花中r p s l 3 基因 5 刀 线粒体和质体同为原核起 源 在原始基因逐渐丢失的过程中 质体趋于稳定 在不同植物中质体基因组 大小相差无几 而线粒体在丢失或是转移自身基因的同时也在吸纳外源基因 真核生物中线粒基因组大小相差很多 动物线粒体大小约1 4 3 9 k b 原核生物线 粒体大小约1 6 7 5 k b 真菌线粒体大小约1 7 1 7 6 k b 而植物线粒体相差最大西 瓜线粒体基因组最小 仅为3 3 0 k b 甜瓜线粒体基因组最大 约为2 4 0 0 k b 自1 9 7 7 年p r i n g 在玉米中发现类质粒以来 众多学者开始了对线粒体类质 粒的研究 不禁提出了线粒体类质粒的起源问题 并对这一问题展开深入研究 在研究过程中发现类质粒与细胞内遗传物质的信息传递存在一定的关系 借此 以线粒体类质粒起源研究为重要线索 在理论上研究m t d n a 与核 叶绿体基因 组信息交流 m t d n a 遗传规律 葫芦科植物m t d n a 进化 在应用上 根据类质粒 在细胞的不同基因组同源序列和定位研究结果 将类质粒开发成基因工程的载 体 进行细胞核和细胞器定点转基因探索性研究 为杂交育种和转基因开辟一 条新的途径 6 第一章绪论 图卜1 细胞内遗传物质信息传递图嘲 4 研究意义和研究现状 环状类质粒多与细胞核基因组具有同源性 有些也与其它基因组具有同源 性 利用类质粒与基因组的同源关系 可以借类质粒为线索研究高等植物三个 基因组之间的同源关系 进一步明晰细胞核基因组对细胞器基因组的调控作用 同时线粒体类质粒的分布范围有限 可以将其作为分子标记用以鉴定不同植物 之间的亲缘关系 在植物进化过程当中 三个基因组之间一直进行着遗传信息的传递和转移 类质粒与基因组具有同源关系说明类质粒具有在细胞器之间穿梭的能力 这就 赋予了线粒体类质粒作为植物细胞器遗传转化载体的条件 目前 外源基因导 入植物细胞后很难准确定位并整合到目的基因组中稳定遗传 经常出现外源基 因丢失 转基因沉默等现象 线粒体类质粒的存在解决了这些问题 类质粒的 研究对植物转基因研究具有重大的潜在意义 本实验是以p c 3 为研究对象 通过对p c 3 在多种植物中的分布情况及在黄 7 第一章绪论 瓜基因组间的同源性分析 研究p c 3 能否在细胞器之间进行穿梭 评价以p c 3 为复制子的线粒体表达载体的作用方式和范围 转基因在线粒体中的稳定性 r n a 编辑方式及对线粒体功能的影响等一系列相关问题 第二章材料与方法 第二章材料与方法 1 材料与方法 1 1 供试材料 1 1 1 植物品种 市售黄瓜 津研四号 天津市黄瓜研究所 津绿三号 天津市黄瓜研 究所 津春四号 天津市黄瓜研究所 种子 西瓜 京欣一号 天津市博 士通种业有限公司繁育 重茬地雷王 辽宁省名特优农产品开发服务公司 抗病黑疾风 天津市蔬菜研究所科技开发中心 西农八号 合肥丰乐种 业股份有限公司 津花二号 种子 南瓜 超甜密本 山西太艺农种子有 限公司 夷香红栗 山西太艺农种子有限公司 谢花面 山西太谷县艺 农种子有限公司 日本南瓜 北京天诺裕农生物研究中心 红板栗 吉 林省环球种业有限公司 种子 甜瓜 日本甜宝 黄玉合菜种行 种甜八号 兴城市种旺种子有限公司 种甜一号 兴城市种旺种子有限公司 稷王 运蜜一号 山西省稷王种业有限公司 香脆羊角酥 河南省新乡市科达种 子有限公司 1 1 2 菌种 e s c h e r i c h i ac o l i ec o l i d h 5q 本实验室保存 ec o l ip u c l 8 本实验室保存 1 2 常用试剂和酶 琼脂糖购自联星生物 e xt a q 聚合酶 t a q 聚合酶 p m d l 8 tv e c t o r 限制性内切酶 小肠碱性磷酸单脂酶 c i a p d n a 琼脂糖凝胶回收试剂盒 d n t p d n am a r k e rd l 2 0 0 0 d n am a r k e rd l l 5 0 0 0 均购自大连宝生物工程有限公司 d n a s e i b s a x g a l i p t g h e p e s 均购自华美生物工程公司 聚乙二醇 m w 3 3 5 0 f i c o l l t y p e4 0 0 为s i g m a 公司产品 p e r c o l l 为p h a r m a c i a 生物技术公司产品 山梨醇 甲硫氨酸 c t a b 为鼎国生物公司产品 胰蛋白胨 为d i f c o 公司产品 酵母抽提物为o x o i d 公司产品 其它试剂均为国产分析纯 9 第二章材料与方法 1 3 实验仪器 p t c 一2 0 0 热循环仪 g e n ec o m p a n y m i c r op u l s e r 电转化仪 b i o r a d 7 5 2 分光光度计 上海分析仪器厂 德国e p p e n d o r f5 810 r 离心机 d y y 一2 稳压稳流 电泳仪 北京市六一仪器厂 i m a g em a s t e rv d s 分析系统 m i c r op u l s e r 电 转化仪 b i o r a d 7 5 2 分光光度计 上海分析仪器厂 1 4 常用储备液及缓冲液 1 4 1 储备液 l m o l lt r is t t c l p h 8 0 0 5 m o l le d t a p i t 8 0 1 0 s d s t e 1 0 1 l o m m o l lt r i s l m m o l le d t a p h 8 0 t e 5 0 1 0 5 0 m m o l lt r i s l o m m o l le d t a p h 8 0 5 0 x t a e 5 0 0m l t r i s1 2 1 o g 冰醋酸2 8 5 5m 1 0 5 m o l le d t a5 0 0m l p h 8 0 1 4 2 缓冲液 1 i 线粒体提取缓冲液 缓冲液a p h 7 5 0 5 m o l l 蔗糖 5 0 m m o l lt r i s 5 m m o l le d t a 0 1 b s a 缓冲液b p h 7 5 0 3 m o l l 蔗糖 5 0 m m o l lt r i s 缓冲液c p h 7 2 0 6 m o l l 蔗糖 l o m m o l lt r i s 2 0 m m o l le d t a i i 线粒体裂解缓冲液 p h 8 o 0 1 m o l lt r i s 5 m m o l le d t a 0 1 m o l ln a c l l s d s l o m m o l l 巯基乙醇 2 i 核d n a 提取试剂 缓冲液a 5 柠檬酸 缓冲液b 5 柠檬酸 3 0 蔗糖 缓冲液c p h 7 4 l o m m o l lt r i s l o m m o l ln a c l 2 5 m m o l le d t a i i 核裂解缓冲液 缓冲液c p h 7 4 1 s d s 3 叶绿体d n a 提取试剂 l o 第二章材料与方法 i 叶绿体提取缓冲液 研磨缓冲液 0 2m o l le d t a p h 8 0 1 0m l lm o l lm g c l 2 lm 1 lm o l lm n c l 2 1m 1 1m o l lh e p e s k o h p h 7 5 5 0m 1 山梨醇6 0 1 4g 加水定容至l l 将缓冲液分装成5 0 0 m l 一份 高压灭菌 冷却后4 c 冷藏 实验当天再在每一等分中加入0 5 9 抗坏血酸和1 2 5 9 牛血清蛋白 m m h s 溶液 1m o l lm g c l 2 1m o l lm n c l 2 1m o l lh e p e s k o h p h 7 5 2m o l l 山梨醇 在冰箱中4 冷藏 0 5m l 0 5m l 2 5 m l 8 2 5m l h s m 5 1m o l lh e p e s 用k o h 调p h 至8 0 2 5 m l 山梨醇 3 0 9 甲硫氨酸0 629 加无菌水定容至l o o m l 调p h 至8 0 大概需要k o h 3 5 滴 用孔径为0 4 5 l ar l l 的微孔滤膜过滤除菌 梯度混合物 m m h s 溶液 0 5m o l le d t a l 一抗坏血酸 谷胱甘肽 还原态 p b fp e r c o l l 聚乙二醇 m w 3 3 5 0 牛血清蛋白 f i c o l l t y p e4 0 0 6 2 7m l 0 1 1 6m 1 2 5m g l om g 混匀 4 5 0m g 1 5 0m g 1 5 0m g 第二章材料与方法 加入1 5m lp e r c o l l 混匀 在使用前一天晚上配制 4 c 冷藏 该溶液不 能保存的更久 p e r c o l l 梯度 1 4 0 p e r c o l l 梯度8 0 p e r c o l l 梯度 梯度混合物 4 4 2m l梯度混合物1 3 8m l p b fp e r c o l l8 0m l p b fp e r c o l l5 0m l 水 7 5 8m l 2 每个5 0 m l 离心管中加入6m l8 0 p e r c o l l 再在上层铺加9 5 m l4 0 p e r c o l l 使用前将梯度离心管放在冰上 但放置时间不能超过2 小时 酶解缓冲液 蔗糖 6 1 6 1 4g lm o l lt r i s h c l 3m l 定容至6 0m 1 调p h 至7 5 i i 叶绿体裂解缓冲液 p h 8 0 0 1 m o l lt r i s 5 m m o l le d t a 0 1 m o l ln a c l 1 s d s 1 0 r a m o l l 巯基乙醇 4 植物总基因组提取试剂 1xc t a b 5 0m m o l lt r i s h c l 1 0m m o l le d t a d h 8 0 1 c t a b w v 2 0m m o l ld 一巯基乙醇 5 质粒提取试剂 溶液i 5 0m m o l l 葡萄糖 1 0m m o l le d t a 2 5m m o l lt r i s h c l p h 8 0 溶液i i 0 2m o l ln a o h 1 s d s 溶液i i i 3m o l lk a c 5m o l l 乙酸 p h 4 8 3 培养基 l b 培养基 1 l 蛋白胨1 0 9 酵母膏5 9 n a c l1 0 9 蒸馏水定容至1 0 0 0 m l n a 0 h 调p h7 o 一7 2 固体l b 培养基每1 0 0 m l 加入琼脂粉 1 5 9 s o b 培养基 1 l 细菌培养用胰化蛋白胨2 0 9 酵母提取物5 9 n a c l0 5 9 用去离子水补充体积至8 0 0 m l 搅拌使溶质完全溶解 加 入2 5 0n m o l l 的n 0 11 0 m l 去离子水补充体积至1 0 0 0 m l n a o h 调p h 7 0 7 2 0 1 个大气压灭菌2 0 分钟 该溶液在 1 2 第二章材料与方法 使用前加灭菌的2m o l l 的m g c l 5 m l s o c 培养基 内含s o b 培养基 1 l 和2 0 m ll m o l l 的葡萄糖溶液 1 5 引物设计 1 5 1 依据黄瓜线粒体类质粒p c 3 克隆序列设计引物 黄瓜线粒体d n a 类质粒p c 3 序列如下 全长5 5 1 b p 序列中g c 含量为 4 4 9 同时序列中存在大量正向和反向重复序列 重复序列总长度为2 1 5 b p 占整个序列的4 0 其中长度大于9 b p 的正向重复序列有1 2 个 最长的为2 7 b p 位于1 7 4 3 b p 和2 0 0 2 2 6 b p 处 反向重复序列2 个 长度为l o b p 一些正向和反 向重复序列相互重叠 一 依据p c 3 序列设计3 对特异引物 见序列中灰色标注 为便于后续实验工 作 在上游引物中均加入e c o r i g a 朗 r c 酶切位点 下游引物中均加入b a m h i g g a t c c 酶切位点 上述引物均由上海英骏生物技术有限公司合成 g g 巨委重重耍丕至至至至至丕要i i i j 孕g g c g t t t a c g t t c a t t c a t g t t g t t t t t c t t t c g g t t c c t g g g a t a t p m p a l g t c t t t t c c t t c t t t t c t t t c c g g t c c t g t t a t a t g t c t t c t t c t t t c c t t c t t g t t t t g t t t a t t t t g c t t c t t g g t g t c t t t t t a t g g g g t a t t a t c t t g 迥巫亟亟匦垂垂暨雪g a g a t g g c g c c g c p m p a 2 a g c t c c t a a c ca a c a t c c g a c p m p b 2 a t t t p m p b l c a c t c c a t a a a c c a t t a a a a a a a c c c t c g a a a a a g t g g g c c c g a 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