学士毕业论文-大孔树脂法分离纯化紫藤花色素及其光谱性质研究.doc

吉首大学2011届学士毕业论文论文题目 大孔树脂法分离纯化紫藤花色素及其光谱性质研究作者姓名学号 20074192007 学 院 生物资源与环境科学学院 专业年级 2007级植物科学与技术 指导教师 职称 副 教 授 指导老师 职称 高 级 实 验 师目 录摘 要3关键词3Abstract3Key words31前言32材料、仪器与试剂42.1材料42.2仪器42.3试剂43实验部分43.1紫藤花红色素提取43.2色素初步纯化53.3色素的纯化流程53.4 树脂的选择53.4.1树脂型号及性质53.4.2 大孔树脂预处理（活化）63.4.3树脂选择条件63.4.3.1紫藤花红色素吸收波长的检测63.4.3.2树脂吸附率的测定63.4.3.3树脂洗脱率的测定73.4.3.4上样液浓度的选择83.5洗脱剂的选择条件83.5.1洗脱剂的选择83.5.2洗脱剂浓度的选择83.6不同pH值对树脂吸附率的影响93.7温度对树脂吸附率的影响93.8动态吸附实验103.8.1上样流速对树脂吸附的影响103.8.2树脂的动态吸附103.8.3 洗脱流速的确定103.9紫藤花红色素的树脂吸附分离纯化104 光谱性质114.1紫藤花红色素的吸收光谱114.2色素红外光谱114.3高效液相色谱124.3.1 色谱条件134.3.2 HPLC检测134.3.3 薄层层析134.3.3.1硅胶薄板的制备134.3.3.2薄层Rf值的测定145.结论14参考文献15致 谢16大孔树脂法分离纯化紫藤花色素及其光谱性质研究 张史杰吉首大学生物资源与环境科学学院 指导老师：董爱文 卜晓英摘 要：本文采用60%乙醇溶液提取紫藤花中红色素，比较了八种大孔吸附树脂对红色素静态、动态吸附和解吸实验,筛选出红色素纯化的最佳树脂，并用红外光谱法、高效液相色谱法、薄层色谱法对红色素进行了光谱性质研究。结果表明：LSA-21大孔吸附树脂纯化红色素效果较好，确定了吸附和洗脱的最佳工艺参数为：样液质量浓度0.3915mg/mL，吸附流速2.5mL/min；以90甲醇为解吸剂，洗脱液流速2.0 mL/min；通过高效液相分析得紫藤花红色素保留时间为1.351min，通过薄板层析（TLC）研究，得其TLC最佳展层剂是: 石油醚：丙酮：甲酸 (20:21:2，V:V)，分离红色素。关键词:紫藤花；红色素；大孔吸附树脂；高效液相；薄层层析Extracting and purifying wisteria red pigment with the method of macroporous resin and stndy of its optical properties Zhang Shi-jieJishou University of Biological Resources and Environmental SciencesSupervisor: Dong Ai-wen Bu Xiao-yingAbstract：In the experiment ,60% alcohol solution was used to extraction wisteria red pigment. After comparing the effect of eight kind of macroporous resins in the dynamic and static adsorption and desorption experiment, we are found the best one to purify red pigment. At the same time, a series of methods such as IR,HPLC and TLC were used to study its optical properties. The results show that LSA-21 macroporous adsorption resin is the best compared with other seven resins. The best technical parameter of adsorption and elution: sample mass concentration 0.3915 mg/ml, adsorption relocity 2.5ml/min, desorption sdntion 90% of methanol, elment velocity 2.0ml/min. The rentention time of wisteria red pigment is 1.351min with the HPLC analysis. By TCL stndy, we find that the best exhibition layer system should be : petroleum ether : ace tone : methanoic acid =20:21:2(V:V).Key words: Wisteria; Red pigment; Macroporous adsorption resin; HPLC; TLC1、前言应用安全无毒的天然食用色素代替合成食用色素是大势所趋 ,开发天然色素是世界食用色素业和医药等行业的发展趋势之一。我国目前还处在合成色素与天然色素并存及同时发展的状态，由于合成色素的安全性问题，不少合成色素在各国允许使用的程度被大大限制，尤其是在食品、医药和化妆品行业，所以，天然色素的提取和应用是现在和未来发展的主要方向，到目前为止，已有许多从动植物中提取出天然色素方面的报道1。但天然色素比合成色素价格高,充分利用价廉的天然资源制取食用色素是降低成本的重要途径之一 。紫藤( Wisteria sinensisSweet . )为豆科(Laguminosae) 藤本植物, 又名朱藤，或称招藤、招豆藤、藤萝，蝶形花科紫藤属，属落叶攀援灌木。三月现蕾，四月盛花，每轴有蝶形花20至80朵。紫藤各地均有野生或栽培，根、种子入药，性甘，微温，有小毒。树皮含贰类，花含挥发油，叶子含金雀花碱等。是集药用、食用、观赏、绿化、工业用、材用兼备的植物,经济价值高且栽培容易,分布于我国南北各地 。除白色花外,紫藤花一般呈现蓝紫色,花期长且花序量多,花冠极为丰富,目前对其花中丰富的天然红色素尚无研究。本试验用紫藤花为原料,经乙醇提取、树脂吸附纯化，以及光谱性质的研究。2、材料、仪器与试剂2.1 材料 干燥紫藤花、大孔树脂XDA-8、 SLA-21、 LSA-7、 LX-17（西安蓝晓科技有限公司）大孔树脂D101 、AB-8、330、 D380（安微三星树脂科技有限公司）硅胶G、KBr粉末。2.2仪器UV-160A型紫外分光光度计、SPD-10A液相色谱仪、IR-408红外分光光度计、DF42型干燥箱、EB-330电子分析天平、AE100电子分析天平、R-215旋转蒸发器2.3试剂浓盐酸、无水乙醇、甲醇、丙醇、乙酸乙酯、甲酸、丙酮、乙腈、硝酸氨（以上溶剂均为国产分析纯）蒸馏水。3、实验部分3.1紫藤花红色素提取取干燥紫藤花粉碎混匀后,过40目筛，取粉末100.00g用60%体积乙醇2000ml作为提取液,浸泡12h、过滤,滤渣再加1000ml60%乙醇浸泡6h，过滤，合并滤液，得色素提取液。3.2 色素初步纯化将色素提取液置于分液漏斗中，然后加入1500ml石油醚使其分层，分离得萃取液，将该萃取液过滤，得初步提取色素液。3.3 色素的纯化流程2初步提取色素溶液大孔吸附树脂蒸馏水冲洗色素洗脱50减压浓缩烘箱干燥色素粉末。3.4 树脂的选择3.4.1树脂型号及性质树脂型号性质颜色用途AB-8弱极性乳白色半透明球状颗粒用于生物碱提取，有机物提取分离，对头孢霉素、依维菌素、氯洁霉素磷酸具有较好的吸附效果330弱碱性黄色不透明球状颗粒主要用于水处理中除去Cl-、SO2-等离子，链霉素、苹果酸、柠檬酸等精制中除去无机酸，提取有机酸和脱色。D101非极性乳白色不透明球状颗粒主要于银杏黄酮、人参皂甙、三七皂甙、双花链翘、茶多酚、大豆异黄酮、葛根素、甜菊糖、甘草酸、叶绿素等天然药物的提取和精制。LSA-7极 性白色球状颗粒色素类提取XDA-8极 性深棕色球状颗粒色素类提取LX-17非极性浅粉红色球状颗粒色素类提取D380弱碱性白色球状颗粒SLA-21乳白色不透明球状颗粒提取甜菊糖甙、三七皂甙、绿原酸、原花青素、花色苷、广枣黄酮、沙棘黄酮等3.4.2 大孔树脂预处理（活化）大孔吸附树脂先用去离子水浸泡，洗清，再用无水乙醇浸泡24h，蒸馏水洗净，然后用5%HCl浸泡，蒸馏水洗至中性，再用2%NaOH溶液浸泡，用蒸馏水洗至中性，去离子水浸泡备用。3.4.3树脂选择条件2-43.4.3.1紫藤花红色素吸收波长的检测取少量初步纯化色素溶液,在紫外分光光度计800200nm范围内扫描测其吸光度，见表1。表1：得紫藤花色素的吸收波长为447nm。3.4.3.2树脂吸附率的测定 分别称取8种已活化的湿树脂20.00g置于250ml锥形瓶中，加入150ml初步纯化紫藤花色素溶液，室温静态吸附12h，在UV-160A型紫外分光光度计上于447nm波长处测量上清液的吸光度，比较各种树脂对紫藤花红色素吸附率的大小，其A00.913，见表2。A0A0吸附率(%) 100 式中：A0为吸附前吸光度；A 为吸附后吸光度。表2：树脂型号湿重(g)干重(g)A0A值吸附率(%)吸附率/干重（g）D10120.064.460.9130.69024.45.47D38020.067.060.9130.75317.52.48LSA-2120.084.300.9130.71222.05.12AB-820.105.140.9130.71122.14.3033020.095.310.9130.73619.43.65LSA-720.114.230.9130.71921.25.01LX-1720.084.700.9130.70922.34.74XDA-820.065.290.9130.69224.24.573.4.3.3树脂洗脱率的测定对以上8种吸附色素的树脂加入150ml60%乙醇进行洗脱，比较其洗脱率，结合吸附率选出最佳树脂，见表3。表3：树脂型号A值洗脱率(%)干重（g）洗脱率/干重（g）D1010.12154.34.4612.17D3800.03622.57.063.19LSA-210.13667.74.3015.74AB-80.14270.35.1413.683300.01910.75.312.02LSA-70.07940.74.239.62LX-170.05928.44.706.04XDA-80.03817.25.293.25结合表2表3，本实验选LSA-21为较佳树脂。取100.00g已活化的LSA-21树脂按湿法上柱，再用初步纯化的色素溶液通过树脂进行动态吸附，吸附完毕经过蒸馏水过柱冲洗，再用60%乙醇进行洗脱至流出也为无色止，洗脱液进行旋转蒸发浓缩、烘干得色素粉末。3.4.3.4上样液浓度的选择分别取10g已活化的最佳湿树脂置于6个250ml烧杯中，分别加入浓度0.134、0.224、0.261、0.3132、0.3915、0.487mg/ml色素溶液100ml，室温静态吸附12h，在UV-160A型紫外分光光度计上于447nm波长处测量上清液的吸光度，比较各种树脂对紫藤花红色素吸附率的大小，见表4。表4：浓度（mg/ml）A0A吸附率（%）0.1340.0830.0759.640.2240.1390.10921.580.2610.1430.10228.670.31320.1560.11923.710.39150.1750.10341.140.4870.2240.15331.70由表4可知0.3915mg/ml为最佳浓度。3.5洗脱剂的选择条件5-63.5.1洗脱剂的选择分别取10.00g已吸附色素的LSA-21树脂，分别用浓度为60%的乙醇、甲醇、丙醇、乙酸乙酯对其在常温下静止洗脱，测洗脱液在447nm处的吸光度，见表5。表5：时间（min）试剂306090120甲醇0.1430.1660.1730.185乙醇0.1120.1340.1560.177丙醇0.0910.1160.1310.143乙酸乙酯0.0430.0850.1240.128由表5可知甲醇为较佳洗脱剂。3.5.2洗脱剂浓度的选择分别称取10.00g已吸附了紫藤花红色素的LSA-21湿树脂7份置于烧杯，分别加入浓度为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的洗脱剂溶液，静置2h，在波长447nm处测定各上清液的吸光度，见表6。表6：浓度（%）405060708090100吸光值0.4370.4830.5320.5680.6710.6820.641由表6知90%甲醇为较佳浓度。3.6 不同pH值对树脂吸附率的影响分别称取已活化的LSA-21湿树脂10.00g，加入50mlpH值为4、5、6、7、8、的色素溶液，室温下静态吸附12h，在波长447nm处测量其上清液的吸光度，见表7。表7：PH值吸光值45678A00.3010.3240.3050.5750.690A吸附率（%）0.22824.20.3017.10.30210.815-41.70.957-38.7由表7知pH为4是较佳。3.7温度对树脂吸附率的影响称取10.00g已活化LSA-21湿树脂4份，分别加入50ml浓度为0.3915mg/ml的紫藤花红色素溶液，分别在15、25、40、60温度下静态吸附3h，在447nm处测量上清液的吸光度，见表8。表8：温度（）15254060A00.3590.3590.3590.359A0.3260.2910.3380.356由表8可见25为树脂吸附的较佳温度。3.8动态吸附实验7-83.8.1上样流速对树脂吸附的影响测定浓度为0.3915mg/ml色素溶液在447nm处的吸光值A0为0.359，然后取5份100ml色素液流经LSA-21树脂柱,分别采用0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml/min的流速,待样品液全部通过树脂柱后,收集流出液并测定其吸光值A,通过(A0-A) / A0100%计算吸附率,见表9。表9：流速（ml/min）1.01.52.02.53.0A00.3590.3590.3590.3590.359A0.3160.3070.2950.2680.321吸附率（%）1214.517.825.310.6由表9可知上样流速为2.5ml/min为较佳流速。3.8.2树脂的动态吸附将筛选出来的树脂浸没在蒸馏水中,按湿法装柱，树脂加到柱体积3/4后,再用蒸馏水反复过柱,装好的树脂柱静止放置过夜,备用。然后沿管壁从柱上部缓慢加入待分离纯化的样品溶液透过层析柱，流速控制在2.5ml/min，待溶液完全通过树脂柱，然后用蒸馏水通过树脂柱冲洗，再进行洗脱。3.8.3 洗脱流速的确定取90%甲醇溶液100ml 5份，分别以0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml/min的流速通过吸附色素的树脂，分别收集洗脱液并在447nm处测定吸光值，见表10。表10：流速（ml/min）1.01.52.02.53.0A0.1380.1950.2230.2010.146由表10可知洗脱流速控制在2.0ml/min为较佳。3.9紫藤花红色素的树脂吸附分离纯化按以上所选择的各种条件得到紫藤花色素滤液，然后放置旋转蒸发器50减压浓缩，再经过干燥得到纯色素粉末。4 光谱性质4.1 紫藤花红色素的吸收光谱分别称取2.00mg由树脂法提取的紫藤花红色素6份，用90%甲醇配制为0.3915 mg/ml的色素溶液，分别用盐酸和硝酸氨调节pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0并放置24h后，用紫外分光光度计在800200nm波长范围内扫描得吸收光谱图，见表11。表11：由表11可知不同pH下色素的最大吸光度都在365nm左右偏移，没有明显变化。4.2 色素红外光谱取紫藤花红色素的粉末2mg，利用KBr压片法，压片后在红外光谱仪中进行定性分析。曲线分析。具体操作如下：称取0.0021g色素粉末，然后与0.1504g干燥KBr粉末充分混合，并在玛瑙研钵中研磨12min再转入合适的模具中，使之分布均匀，抽空下压成透明薄片，装入压片夹以KBr空白压片作参比扫描红外光谱，见图1。图1：红外光谱标准图紫藤花红色素红外光谱图4.3高效液相色谱9-104.3.1 色谱条件流动相 78%乙腈检测波长: 365nm 色谱柱: Kromasil ODS-1柱温: 25进样量： 30ul流速： 1ml/ min 。4.2.2 HPLC检测紫藤花色素定性分析:准确称取7.5mg纯化的紫藤花红色素置于25ml的定容瓶中,加入30%甲醇溶液溶解,定容，振摇2min过膜，进行液相色谱分析见图2。图2：由图2可知紫藤花红色素保留时间为1.351min。4.2.3 薄层层析114.2.3.1硅胶薄板的制备将1份硅胶G和2.5份0.5%CMC溶液在研钵中研磨混匀，去除表面气泡，然后将其均匀涂布（厚度为0.20.4 mm）于若干玻璃平板上，置水平台上室温晾干，110活化12 h，置密封干燥剂中保存备用。4.2.3.2薄层Rf值的测定取红色素粉末10mg，用90%甲醇5ml溶解，点样于硅胶G-0.5%CMC薄层板上，沿原线距边各1cm共点样1ml，以石油醚：丙酮：甲酸 (20:21:2，V:V)为展开剂，在展层剂中展开，取出，晾干，观察，测定其Rf值，见图3。图3：其Rf=7.1cm/11.5cm=0.617。5. 结论本文比较了八种不同树脂对紫藤花红色素的吸附能力，用LSA-21树脂吸附和分离紫藤花红色素的效果较好,吸附后的紫藤花红色素易于洗脱,在综合开发利用紫藤花及其色素时,对紫藤花色素的安全性、化学结构、生理活性以及食用安全性还有待进一步研究提高。本文采用LSA-21树脂精制紫藤花红色素，分离的最佳工艺条件为：温度为25；吸附流速为2.5mL/min；色素液pH值为中性；洗脱剂为90%甲醇，色素洗脱流速为2.0mL/min。参考文献1黄俊娴,梁荣选,杨建男.天然色素的提取方法和应用J.广东化工,2006,33(6):63.2蒋益花.紫藤和葛藤花红色素稳定性的比较J.中国调味品,2009(1):82-83.3张庆华,朱向东,张宝,吴